Summary
Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.
Abstract
Photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) 뒤에 보이는 빛 photoactivation 세포 apoptosis를 유도 하는 것 적용된 photosensitizer (PS)의 외피를 포함 한 의료 절차입니다. 연방 의약품 안전 청 actinic keratosis, 치료에 대 한 PDT를 승인 했습니다 그리고 임상 지침 특정 비 흑색 종 피부 암과 여드름 vulgaris에 대 한 처리로 PDT를 추천. 그것은 저렴 한 비용, 비-침략 적, 및 관련 된 최소한의 부작용 그리고 무섭게 PDT는 유리한 치료 양식 적임 이다. PDT의 첫 번째 단계는 PS 적용 이며 침 축적을 허용. 후속 빛 방사선 세포 apoptosis, 막 장애, 미토 콘 드 리아 손상, 면역 변조, keratinocyte 확산, 및 교원 질 회전율에 궁극적으로 이어질 수 있습니다 반응성 산소 종 형성을 유도 합니다. 여기, 우리는 체 외에서 하는 방법 연구 PDT 부착 셀 라인에서 제시. 이 치료 프로토콜 PDT를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 그리고 다양 한 셀 라인, photosensitizers, 부 화 온도, 또는 photoactivation 파장 PDT 사용 하 여 공부 하 고 조정할 수 있습니다. 편평 세포 암 종 세포 30 분 및 417 nm 블루 빛 1000 photoactivated 0, 0.5, 1.0, 및 2 m m 5-aminolevulinic 산 (5-ALA) incubated 했다 s. 기본 결과 측정 apoptosis와 괴 사, annexin V 및 7-aminoactinomycin D cytometry 기준으로 측정 했다. 다음 5-살라의 30 분 외피 세포 apoptosis에 복용량 의존 증가 높은 간 테스트 유효성을 달성 하기 위해 생체 외에서 초 실험을 수행할 때 일관 된 외피와 가벼운 매개 변수를 유지 하기 위해 중요 하다. PDT는 소설 PSs, 프로토콜, 및 초에 대 한 새로운 표시의 최적화의 개발에 대 한 유용한 임상 절차 및 생체 외에서 연구 수 있습니다.
Introduction
Photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) 뒤에 보이는 빛 photoactivation 세포 apoptosis를 유도 하는 것 적용된 photosensitizer (PS)의 외피를 포함 한 의료 절차입니다. 연방 의약품 안전 청 (FDA) actinic keratosis (AK)의 치료에 대 한 PDT를 승인 했습니다 그리고 임상 지침 특정 비 흑색 종 피부 암과 여드름 vulgaris1,2에 대 한 처리로 PDT를 추천. 태평양 표준시에 대 한 신흥 비 피부과 사용 위장, 전립선, 부인과 암3의 치료를 포함합니다. 그것은 저렴 한 비용, 비-침략 적, 그리고 최소한의 부작용 및 흉터2관련 된 PDT는 유리한 치료 양식 적임 이다.
PDT의 첫 번째 단계는 PS 적용 이며 침2축적을 허용. 미국에서는, 국 소 5-aminolevulinic 산 (5-ALA)는 일반적으로 AKs 치료에 사용 됩니다. 부 화 하는 동안 단계, 5-ALA protoporphyrin IX (PP-IX) 통합된 셀3헤 생 합성 통로 통해 변환 됩니다. 암 및 전 암 세포 감소 protoporphyrin IX (PP-IX), 최종 제품으로 변환, ferrochelatase 활동, 헤. 그 결과, 암 세포 정상 세포4,5에 비해 PP IX 누적 됩니다. 암 및 전 암 세포 주변 조직 기준으로 PP-IX의이 축적이 초 최소한의 부작용으로 타겟된 접근을 할 수 있습니다. 가벼운 방사선 반응성 산소 종 (ROS) 생성 산소 PP IX에서 흥분된 전자를 수용 하는 때 이끌어 낸다. PP-IX는 파란색과 빨간색 빛2를 포함 하 여 가시 광선 스펙트럼에 걸쳐 작은 봉우리 자외선 스펙트럼에서 피크 흡수. 선생님 형성 세포 apoptosis, 막 장애, 미토 콘 드 리아 손상, 면역 변조, keratinocyte 확산, 및 교원 질 회전율6,7,,89 에 궁극적으로 이어질 수 있습니다. , 10.
PDT와 진화 치료 양식 적임3는 1970 년대에 개발 되었다. AKs의 처리를 위한 FDA 승인 프로토콜 14-18 시간, 5-ALA 피부 외피를 권장 하지만 1 ~ 2 h 외피 임상 연습2에 일반적으로 사용 됩니다. 생체 외에서 우리는 짧은 15 분 5-ALA 외피 섬유 세포 apoptosis 치료 fibroblasts11,12에 비해 증가 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 또한, 소설 chlorin, phthalocyanine, 및 나노 기반 PSs 초 효능3을 개선 하기 위해 공부 되 고 있다. 여기, 우리는 체 외에서 하는 방법 연구 PDT 부착 편평 세포 암 종에서 셀을 제시. 이 프로토콜에서 SCC-13 셀 0, 0.5, 1.0, 및 2 m m 5-ALA 30 분 및 photoactivated 1000 417 nm 블루 빛으로 incubated는 s. 기본 결과 측정은 apoptosis와 괴 사, annexin V 및 7-aminoactinomycin D (7-AAD) cytometry 기준으로 측정. 이 치료 프로토콜 PDT를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 그리고 다른 셀 라인, photosensitizers, 부 화 온도, 또는 photoactivation 파장 PDT 사용 하 여 공부 하 고 조정할 수 있습니다. 추가 제어 그룹의 준비 할 수 있습니다, 흠 없는, 단일 fluorophore를 포함 하 여 스테인드, cytometry에 대 한 부정, 및 긍정적인 컨트롤. 이론, 프로토콜, 실험적인 디자인, 그리고 apoptosis 또는 괴 사 cytometry 위한 게이팅의 종합적인 검토 다른13을찾을 수 있습니다.
Protocol
1입니다. 셀의 준비
- 문화 매체의 2 mL에 20000 셀 biosafety 캐비닛에 무 균 기술을 사용 하 여 6 잘 플레이트의 각 음에 플레이트.
- 6 잘 플레이트 플레이트에 셀 수 있도록 24 h 습도 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 배치 합니다.
2. 셀의 처리를 위한 Photosensitizer의 준비
- 문화 매체에 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA 솔루션을 준비 합니다. 소 태아 혈 청 (FBS) 문화 매체의 성분 인 경우에, 준비 하 고 5-ALA 0.1% 문화 매체 솔루션에 포함 된 셀을 치료 FBS 외피에 대 한. 11 , 12 이 경우 SCC-13 셀 필요가 없습니다 FBS, 5 날개 keratinocyte 혈 청 무료 중간 소 뇌 하 수 체 추출 및 표 피 성장 인자 보충에 직접 추가 되었습니다 그래서.
- 문화 매체를 발음 하 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 최소 2 mL로 세포를 씻어.
- PBS를 발음 하 고 별도 접시 또는 우물으로 0, 0.5, 1 또는 2 m m 5-ALA 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 0, 0.5, 1, 셀을 품 어 또는 30 분에 대 한 블록을 난방 36 37 ° C에 2 m m 5-살라는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 외피 동안 가벼운 노출에서 세포를 보호 합니다.
- 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA 솔루션을 발음 하 고 PBS의 2 mL로 세포 세척.
- PBS를 발음 하 고 블루 빛 조사에 대 한 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
3. 푸른 빛 광선 요법
- 셀, 해 전에 블루 빛 장치 (예를 들어, 발광 다이오드, 형광, 또는 할로겐 빛) 설정 하 고 1 사이클에 대 한 실행 (1000 s) 장치를 따뜻하게. 파란 가벼운 장치는 출력 파장 5 + 417의 있어야 한다 nm. 치료 전에 1 사이클에 대 한 실행 장치를 수 있도록 푸른 빛 파장 및 방사는 photoactivation 단계에 걸쳐 일관성이 보장 합니다.
- 세포 표면에 방사를 측정 하는 광도 계를 사용 합니다. 세포 표면에 푸른 빛 방사는 10 mW/cm2이어야 한다. 빛과는 셀 사이의 거리는 광원의 강도 따라2 10 mW/cm irradiance를 달성 하기 위하여 조정 될 필요가 있습니다.
- 0, 0.5, 1 및 2 m m ALA 치료 그룹 블루 광원 아래 검은 표면에 놓습니다. 셀 1000에 대 한 파란색 빛을 비추는 s (16 분 및 40 s) 10 J/c m2의 총 fluence에 대 한. 블루 빛 photoactivation, 다음 셀 분석에 대 한 준비가.입니다.
4. 수집 및 얼룩
- ( 재료의 표참조)는 제조업체 지침에 따라 흐름 버퍼를 준비 합니다.
- 문화 매체 및 2 mL의 PBS로 세척 셀 발음.
- 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 약 3 ~ 5 분 동안 분리 하는 세포를 허용. 셀 셀 분리 확인 현미경 검사할 수 있습니다.
- 비활성화 된 트립 신을 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 문화 매체 (PBS)의 1 mL를 추가 합니다.
- 분류 5 mL 흐름 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
- 셀 펠 릿을 제거 하지 않고 5 분 Aspirate 솔루션에 대 한 201 x g 에서 원심 분리기에 5 mL 흐름 튜브를 회전 합니다.
- 각 샘플을 활용된 annexin V 항 체 (흐름 버퍼의 39 µ L 당 annexin v의 1 µ L)으로 흐름 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다.
- Resuspend 셀과 annexin V 바인딩 수 있도록 20 분 (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에 놓습니다.
- 각 샘플에 7-AAD의 3 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
5. 흐름 Cytometric 분석
- 설정에 대 한 흐름 cytometer 제조업체 지침에 따라 ( 재료의 표참조).
- 수집 및 분석 cytometry 샘플. 13
- 치료 및 분산 분석 (ANOVA)14를 사용 하 여 컨트롤 그룹의 통계 비교를 수행 합니다. 컨트롤의 평균을 치료 그룹의 의미를 비교 하 여 특별 게시물 분석 Dunnett의 테스트와 함께.
Representative Results
SCC-13 후 셀 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA와 함께 30 분 동안 incubated 되었고 1000 반구 블루 빛, 세포 apoptosis에 복용량 의존 증가의 s. 총 apoptosis (의미의 평균 ± 표준 오차)는 3.94 ± 0.34, 7.90 ± 0.52, 23.86 ± 0.52, 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-날개를 가진 외피의 30 분 후 38.33 ± 1.81 각각, 그리고 파란색의 1000 초 빛 (그림 1). 우리는 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 그룹 ANOVA를 사용 하 여 가운데 apoptotic 세포의 평균 비율을 비교. 1 및 2 m m 5-ALA 치료 셀 0 m m 5-ALA 치료 세포에 비해 세포 apoptosis에 크게 증가 했다. 그림 2A 보여주는 대표적인 흐름 측면 살포 (SSC) SCC-13 셀 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-살라와 함께 알을 품을 대 앞으로 분산형 (FSC)의 cytometric 게이팅 동그라미 게이팅 SCC-13 세포 인구를 포함합니다. 이 실험을 위해 7500 이벤트 수집 하 고 SCC-13 셀 인구 게이트 캡처한 이벤트의 90% 이상. 그림 2B 는 x 축과 y 축에 annexin V에 7-AAD의 대표 작을 보여줍니다. 세포 인구는 4 개의 사분면으로 문이 (4 분기에 1 분기) 차별을 apoptotic 세포. 1 분기 (높은 annexin v, 낮은 7-AAD) 나타내는 셀 초기 apoptosis를 겪고. Q2 (높은 annexin v, 높은 7-AAD) 대표 셀 늦은 apoptosis 또는 괴 사 진행. 3 분기 (낮은 annexin v, 높은 7-AAD) 나타내는 세포 괴 사를 겪고. 4 분기 (낮은 annexin v, 낮은 7-AAD) 대표 하지 겪고 apoptosis 또는 괴 사 세포. Apoptosis를 받고 세포의 백분율을 계산 하려면 우리는 q 1과 q 2에 셀의 비율 추가 되었습니다. 5-ALA 인큐베이션 기간 길이, 부 화 온도, 또는 photoactivation 방사선 복용량에 불일치는 초 효능을 변경할 수 있습니다. 그림 3 부 화 온도 변화 하는 때 대표 annexin V 및 7-AAD 흐름 cytometric 음모를 보여줍니다 (즉, 27, 36, 또는 42 ° C). Apoptosis에 온도 의존 증가 했다.
그림 1: 5-살라의 30 분 부 화 후 apoptosis에 복용량 의존 증가 5-ALA 36 ° C에서 1000 다음 30 분 동안 incubated SCC-13 셀에 푸른 빛의 s. 각 치료 및 제어 그룹에서 평균 백분율 annexin V 긍정적인 세포를 나타내는 막대입니다. 실험 기술 3 중에서 수행 했다. 통계적 의미는 p 와 ANOVA에 의해 결정 되었다 < 0.05 별표 (*)로 표시 됩니다. 오차 막대는 평균 ± 표준 오차의 의미를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 Cytometry 플롯. (A) 대표 앞으로 분산형 대 측 분산형 cytometry 구획 임의의 단위 (AU)에 대 한 x-축 및 y 축 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 셀. 이 실험을 위해 7500 이벤트 수집 하 고 SCC-13 셀 인구 게이트 캡처한 이벤트의 90%. (B) 대표 annexin V 대 7 AAD cytometry 플롯 AU에 대 한 x-축 및 y 축 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 셀에 대 한 합니다. 질문 1: 초기 apoptotic 세포, Q2: 늦은 apoptotic/회 저 성 세포, 3 분기: 회 저 성 세포, 및 4 분기: 가능한 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 5-ALA 다른 온도에서 배양 초 효능을 변경할 수 있습니다. 7-AAD cytometry 대표 annexin V 대 플롯 AU에 대 한 x-축 및 y-축 0.5 m m 5-27, 36, 42 ° c.에서 ALA와 incubated SCC-13 셀에 대 한 질문 1: 초기 apoptotic 세포, Q2: 늦은 apoptotic/회 저 성 세포, 3 분기: 회 저 성 세포, 및 4 분기: 가능한 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
0.5, 1 및 2 m m 5-날개 뒤에 1, 000의 30 분 외피 다음 SCC-13 apoptosis에 상당한 증가 푸른 빛의 s. 이러한 결과 30 분 뒤에 블루 빛 활성화의 5-ALA 외피 fibroblast 세포 apoptosis12, 진행의 백분율에 복용량 의존 증가 리드 보여주는 우리의 이전 출판된 연구와 일치 14.
공부 초가 실험적인 접근 장점과 한계 있다. 설명된 방법 준수 상용 PS로 임상 연습 그리고 광원 사용 되었다. 연구원은 다른 세포 유형, PSs, 광원 및 조사 매개 변수 메서드를 사용자 지정할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜은 부착 세포 경작 한 단층에 대 한 설계 되었습니다 등이 접근에 한계가 있다. 임상 연습에서 조직 아키텍처 또는 질병 병리학 (hyperkeratosis즉, 또는 섬유 증) 차이 PS 흡수 저하 될 수 있습니다 또는 침투15빛. 그 결과, 치료 복용량 및 실험 결과 수 있습니다 일치 하지 않을 직접 임상 연습. 회전 타원 체 종양 모델 및 미세 칩 더 밀접 하 게 종양 microenvironments16,,1718를 복제 하는 방법으로 연구 되었습니다. Spheroids는 내부와 외부 세포 틈새 차동는 photosensitizers를 통합 하 고 다른 유형의 종양 아키텍처를 나타내는 수 있습니다. 다른 연구원은 화면 처리 조건 및 photosensitizers의 혈관 전달 미세 칩을 사용 했습니다. 그러나, 미세 칩 개발 비용이 많이 드는 또는 연구원 기술에 익숙하지에 대 한 구현 하기 어려운 수 있습니다. 또한, spheroids 및 미세 칩에 있는 photosensitizers 직접 혈관 보급 없이 종양 표면에 적용 되는 피부 암의 임상 치료를 반영 하지 않을 수 있습니다. 연구원은 다른 질병 시스템에서 공부 PDT에 대 한 단층 문화, 회전 타원 체 종양 모델 및 미세 칩의 찬 부 양론을 평가 해야 합니다. 면역 세포 또는 세포 외 기질으로 초 복잡 한 세포-세포 상호 작용에 미치는 영향을 확인할 수 아니다. 연구팀은 생체 외에서 실험 결과 동물 모델과 임상 시험을 사용 하 여 확인 해야 합니다. 높은 간 테스트 유효성을 달성 하기 위해 생체 외에서 초 실험을 수행할 때 일관 된 외피와 가벼운 매개 변수를 유지 하기 위해 중요 하다.
온도 변경 PDT19의 효능으로 알려져 있다. 한 연구는 세포 죽음, 5 날개 통풍 관, PP IX 형성과 cytokine 출시 44 ° C19에 최대 5-날개 온도에서 세포를 배양 하 여 향상 될 수 있습니다 설명 했다. 44 ° C의 위 외피 온도 열 유도 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다 그리고 외피 온도 20 ° c을 중요 한 5-ALA 이해 및 축적19이어질 수 있습니다. 연구원은 잠재적으로 혼동 열 효과 대 한 제어를 일정 한 온도에서 온도 조절 난방 블록에 PS 외피를 수행 하는 것이 좋습니다. 또한, 충분 한 양의 시간 PP IX 5-ALA의 변환에 대 한는 photosensitizer 품 어 중요 하다. 이 프로토콜에 SCC-13 셀 성공적으로 세포 apoptosis 유도 30 분 동안 5-ALA와 인 큐베이 팅 했다. 우리 이전 5-ALA의 10 분 인큐베이션 크게 치료 제어 fibroblasts11,14에 비해 섬유 아 세포에 있는 apoptosis 증가 하지 않았다 설명 했다. PP-IX 5-ALA 37 ° c.에 6 분 동안 잠복기 후 마우스 피부에 축적 시작 따라서, 10 분 후 5-ALA 인큐베이션, 있을 수 있습니다 하지 유도 세포 apoptosis20PP-9의 충분 한 축적. 우리의 이전 연구11,14에 따라 5-날개에 대 한 20 ~ 30 분의 최소 잠복기를 좋습니다. 연구팀은 부 화 기간 설정, 관심, 셀 유형, 및 임상 표시의 photosensitizer 실험실에 따라 최적화 할 수 있습니다. 제조업체 지침을 사용 하 여 최상의 결과 대 한 항 체 적정 및 최적화 실험을 수행할 수 있습니다. 블루 라이트 photoactivation dihydroethidium 흐름 cytometric 정량화 선생님의를 포함 하 여 다음 관심의 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 14
빛의 양을 변화 표면 영역 (즉, irradiance)의 단위 당 전달 하 고 photoactivation 단계 총 방사선 복용량 (즉, fluence) 선생님 형성 및 세포 apoptosis21에 영향을 미칠 수 있습니다. Fluence, irradiance, 시간과 관계는 다음 방정식에 의해 기술 될 수 있다:
Fluence (J/c m2) Irradiance (W/c m2) = x 시간 (s)
Fluence는 시간에 따라, 길이 또는 photoactivation 단계를 단축 치료 효능을 변경할 수 있습니다. 방사 광원 및 대상 조직 사이 제곱 거리에 비례 이다. 결과적으로, 빛이 너무 멀리 떨어져, 있을 수 있습니다 하지 자극 대상된 조직에 전달 하는 충분 한 빛 에너지는 ps. 또는,는 irradiance 주변 표면에서 반영 빛에 의해 증가 수 있습니다. 따라서, 빛의 반사를 방지 하기 위해 검은 표면에 세포 배양 배지와 빛 위하여 수행 하는 것이 좋습니다. 연구원은 상업적으로 사용할 수 또는 FDA 승인 파란색 발광 다이오드 및 PDT 실험에 사용 하 여 형광 장치를 획득할 수 있습니다 있지만 이러한 장치 가벼운 분야 균일 하 고 다른 전원 출력을 할 수 있습니다. 파장 별 photometer 세포 표면 및 일관성 있는 결과 대 한 모든 실험 하기 전에 빛의 균일성에 방사를 측정 하기 위해 사용 되어야 한다. 필요한 경우 필드 균일성 향상을 상업적으로 사용할 수 있는 디퓨저를 사용할 수 있습니다.
요약 하자면, 우리 생체 외에서 접근 이론, 실험 방법, 제한, 잠재적인 함정 및 최적화에 대 한 권장 사항을 자세히 설명 하 여 PDT를 조사 하는 것을 설명 했습니다. PDT는 소설 PSs, 프로토콜, 및 초에 대 한 새로운 표시의 최적화의 개발에 대 한 유용한 임상 절차 및 생체 외에서 연구 수 있습니다.
Disclosures
DUSA/일 제약 제공 5-살라 고 블루 U 빛 장치. 이 원고는 박사 Jagdeo의 잔류에 의해 지원 되었다 자금. 내용을 미국 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다.
Acknowledgments
저자 아무 승인 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
| DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
| 6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
| PBS | Thermofisher | 14190250 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
| BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
| 5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
| FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
| FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
| FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
| Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
| FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
References
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