Summary
We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.
Abstract
De demonstratie van tyrosine kinase-remmers (TKIs) bij de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) heeft luidde een nieuw tijdperk in de therapeutiek van kanker. Echter, een kleine bevolking van cellen reageert niet op TKI behandeling, wat resulteert in minimale residuele ziekte (MRD); zelfs de meest potente TKIs ontbreek voor de uitroeiing van deze cellen. Deze cellen MRD dienen als een reservoir te ontwikkelen resistentie tegen therapie. Waarom TKI behandeling is niet effectief tegen MRD cellen is niet bekend. Groeifactor signalering is betrokken bij de ondersteuning van het voortbestaan van MRD cellen tijdens de TKI behandeling, maar een mechanistische inzicht ontbreekt. Recente studies aangetoond dat een verhoogde c-Fos en expressie van Dusp1 als gevolg van convergente oncogene en groeifactor signalering in MRD cellen TKI weerstand bemiddelen. De genetische en chemische remming van c-Fos en Dusp1 maakt van CML prachtig gevoelig voor TKIs en geneest CML in zowel genetische en gehumaniseerd Muismodellen. We deze doelgenen met behulp van meerdere microarrays van TKI-gevoelige en -resistente cellen geïdentificeerd. Wij bieden hier, methoden voor doel validatie met behulp van in vitro en in vivo Muismodellen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op geen doelstelling voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.
Introduction
Constitutieve tyrosine kinaseactiviteit van BCR-ABL1 fusion oncogen veroorzaakt CML, waarmee een grondgedachte te richten op het kinaseactiviteit door klein molecuul remmers. Het succes van TKIs bij de behandeling van CML-patiënten een revolutie teweeggebracht in het concept van gerichte therapie1,2. Anti-kinase therapie als precisie medicijn werd vervolgens ontwikkeld voor verschillende andere maligniteiten, met inbegrip van solide tumoren. Tot nu toe zijn meer dan dertig kinase-remmers goedgekeurd door de Verenigde staat FDA voor de behandeling van verschillende maligniteiten. Terwijl TKI behandeling zeer effectief is in het onderdrukken van de ziekte, is het niet curatief. Bovendien, een kleine populatie van kankercellen aanhoudt tijdens de behandeling: de MRD3,4,5. Zelfs patiënten die volledige verlossing toonde zitten met MRD, die uiteindelijk resultaten in herval zo niet voortdurend onderdrukt. Daarom is de uitroeiing van MRD cellen die nodig zijn om een duurzaam of curatieve antwoord. CML vertegenwoordigt een waardevolle paradigma voor het definiëren van het concept van precisie geneeskunde, mechanismen van oncogenese, rationeel doel-directed therapeutiek, progressie van de ziekte en resistentie. Echter, zelfs vandaag de dag, het rijden van TKI-veroorzaakte celdood in kankercellen mechanisme niet volledig wordt begrepen, noch waarom MRD cellen (bestaat uit leukemische cellen van de stam [LSCs]) intrinsiek resistent zijn tegen TKIs4,6. Niettemin, het verschijnsel van de "oncogen afhankelijkheid" mutant kinase oncoprotein is betrokken bij TKI werkzaamheid waar de acute remming van gerichte oncogen door TKIs veroorzaakt een oncogene schok die tot een enorme proapoptotic reactie of onbeweeglijkheid in cel leidt context-afhankelijke manier6,7,8,9. De mechanistische onderbouwing van oncogen afhankelijkheid ontbreekt echter. Recente studies hebben betrokken dat groeifactor signalering oncogen afhankelijkheid intrekt en bijgevolg weerstand tegen TKI therapie10,11,12 verleent. Daarom, om inzicht te krijgen in het mechanisme van oncogen afhankelijkheid, we uitgevoerd geheel-genoom expressie profilering van het BHG-ABL1 verslaafd en nonaddicted cellen (gegroeid met groeifactoren), waaruit bleek dat c-Fos en Dusp1 kritische bemiddelaars van zijn oncogen verslaving13. De genetische schrapping van c-Fos en Dusp1 is synthetische dodelijke tot de BCR-ABL1-uiting van cellen en de muizen gebruikt in het experiment deed niet leukemie te ontwikkelen. Bovendien genezen de remming van c-Fos en DUSP1 door een klein molecuul remmers CML BCR-ABL1-geïnduceerd in muizen. Uit de resultaten blijkt dat de niveaus van de expressie van c-Fos en Dusp1 de apoptotic drempel in kankercellen definiëren, zodanig dat lagere niveaus drug gevoeligheid, verlenen terwijl hogere weerstand tegen therapie13veroorzaken.
Ter identificatie van de genen die de afhankelijkheid oncogen rijden, wij meerdere geheel-genoom expressie profilering van experimenten in aanwezigheid van groeifactor en een TKI (imatinib) met behulp van de muis- zowel CML patiënt-afgeleide cellen (K562) uitgevoerd. Deze gegevens werden geanalyseerd in parallel met CML-patiënt gegevenssets verkregen CD34+ hematopoietische stamcellen voor en na behandeling met imatinib. Deze analyse bleek drie genen (een transcriptiefactor [c-Fos], dual specificiteit fosfatase 1 [Dusp1], en een RNA-bindende eiwit [Zfp36]) die worden meestal upregulated in TKI-resistente cellen. Voor het valideren van de betekenis van deze genen in de overdracht van resistentie, we stapsgewijze in vitro en in vivo analyse uitgevoerd. De niveaus van de expressie van deze genen werden bevestigd door real-time qPCR (RT-qPCR) en het westelijke bevlekken in resistente cellen. Verder, cDNA overexpressie en knockdown door shRNA haarspelden van c-Fos, Dusp1, en Zfp36 onthuld dat verhoogde c-Fos en Dusp1 expressies zijn voldoende en moeten verlenen TKI weerstand. Dus wij uitgevoerd een in vivo validatie met Muismodellen c-Fos en Dusp1 alleen. Voor de genetische validatie van c-Fos en Dusp1, we ROSACreERT-afleidbare c-Fosfl/fl muizen (voorwaardelijke knockout)14 gemaakt en stak ze met Dusp1- / - (rechte knockout)15 te maken ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - dubbel-transgene muizen. Beenmerg-afgeleide c-Kit+ cellen (vanaf c-Fosfl/fl-, Dusp1- / --, en c-Fosfl/flDusp1- / -) uitdrukken BCR-ABL1 werden geanalyseerd in vitro in een kolonie-vormende eenheid (CFU) assay, en in vivo door beenmergtransplantatie in dodelijk bestraalde muizen, voor het testen van de eis van c-Fos en Dusp1 alleen of samen in ontwikkeling van leukemie. Ook de chemische remmingen van c-Fos door DFC (difluorinated curcumine)16 en Dusp1 door het BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 werden getest in vitro en in vivo met BCR-ABL1-uiting, bot de cellen van het beenmerg-afgeleide c-Kit+ van de wild-type (WT) muis. Om te bevestigen de eis van c-Fos en Dusp1 in leukemische cellen van de stam, we gebruikt een CML muismodel waar BCR-ABL1 in de cellen van de stam specifiek was geïnduceerd door doxycycline (Tet-transactivator spreekt onder lymfkliertest stamcel leukemie (SCL) gen 3' enhancer verordening)18,19. We gebruikten het beenmerg Lin-Sca+c-Kit+ (STL) cellen van deze muizen in een in vivo transplantatie assay. Bovendien, wij gevestigd phopsho-p38 niveaus en de uitdrukking van IL-6 als farmaco-dynamic biomarkers voor Dusp1 en c-Fos inhibitie, respectievelijk, in vivo. Ten slotte uit te breiden van de studie voor menselijk relevantie, patiënt-afgeleide CD34+ cellen (gelijk aan de c-Kit+ cellen van muizen) werden onderworpen aan langdurige in-cultuur-initiëren cel vitrotests (LTCIC) en een in vivo gehumaniseerd muismodel van CML20,21. De immunodeficiëntie muizen waren getransplanteerde met CML CD34 + cellen, gevolgd door de medicamenteuze behandeling en analyse van overleving van de menselijke leukemische cel.
In dit project ontwikkelen we methoden voor target identificatie en validaties zowel genetische en chemische hulpprogramma's, met behulp van verschillende preklinische modellen. Deze methoden kunnen met succes worden toegepast voor het valideren van andere doelen die ontwikkeling van chemische modaliteiten voor therapeutische ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Menselijke specimens (normaal BM en dat van CML (p210-BCR-ABL +) leukemie) waren verkregen door middel van institutionele Review Board-goedgekeurde protocollen (institutionele Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) en donor geïnformeerde toestemming van de CCHMC en de Universiteit van Cincinnati.
1. real-time qPCR analyse
- Isoleren totaal RNA van cellen van de BaF3 groeien in RPMI aangevuld met 10% FBS en 10% WEHI bezig geweest met het kweekmedium als een bron van interleukine-3 (IL-3).
- Oogsten van de cellen in logaritmische fase (99% levend) uit behandelde (IL-3 en imatinib) en onbehandelde stalen en centrifugeer ze bij 435 x g gedurende 3 minuten. De gezondheid en de groeistadia van de cellen zijn kritisch als hun gen expressieprofielen drastisch kunnen veranderen.
- RNA isoleren door het zuiveren van totale RNA22. Kwantificeren van de totale RNA; vervolgens, onverminderd het DNase behandeling23. Converteren van gelijke hoeveelheden DNA-vrije RNA (2 µg) aan cDNA met reverse-transcriptase24.
- Uitvoeren van qPCRs met de gen-specifieke primers (tabel 1). Verrichten van PCRs in 20 µL reacties in 0,2 mL, dunwandige buizen van de PCR met optische doppen, met behulp van een polymerase van 1 x Meng (Zie Tabel of Materials), 0,5 µM voor elke primer, 1 µL van DNA, en water. Plaats van de reactie in de thermocycler met de volgende cyclus: stap 1, 95 ° C gedurende 10 minuten; Stap 2, 95 ° C gedurende 15 s; Stap 3 bij 60 ° C gedurende 1 min; Stap 4, herhaal de stappen 2-3 40 keer. Het uitvoeren van alle PCRs in triplicates en normaliseren van de real-time gegevens op de expressie van de β-actine vóór het plotten.
2. het westelijke bevlekken
Opmerking: Geheel-cel extracten werden voorbereid door het toevoegen van 250 µL 1 x lysis-buffermengsel, zoals beschreven in Kesarwani et al.13 aangevuld met proteaseinhibitor cocktail en fosfatase remmer cocktail 2.
- Oogst vijf miljoen BaF3 cellen in logaritmische fase (99% levend) van behandeld (IL-3 en imatinib), alsmede van onbehandelde BaF3 cellen door centrifugeren bij 435 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Lyse de cellen in de lysis-buffermengsel (250 µL) door pipetteren op en neer 1 x, gevolgd door een 5 minuten incubatie bij 80 ° C. Bewerk ultrasone trillingen ten de lysate te breken alle het DNA met 5 – 6 pulsen van 5 s, elk in een koude kamer bij 4 ° C.
- Breng de lysate tot een 1,5 mL koker en Centrifugeer het bij 16.000 x g gedurende 5 min voor het verwijderen van de onoplosbare materiaal. Het extract kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot gebruik. De monsters van de warmte tot 80 ° C gedurende 5 minuten in een warmte blok vóór het laden. Laden 10 µL van het monster met behulp van een gel-laden tip over 10% SDS-pagina gel.
- De eiwitten bij 150 V oplossen totdat de kleurstof van de verwijzing de onderkant van de gel tot. Het eiwit overbrengen in nitrocellulose membranen door een elektroforetisch overdracht op 1 amp voor 1 h. Na de overdracht, blokkeren de membranen in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing + 0,1% Tween-20 (TBST) met 5% non-fat melk voor 1 h en sonde 's nachts bij 4 ° C met de juiste antilichamen bij een verdunning 1:1,000.
- Wassen van de membranen 3 x tot 5 x met TBST voor 10 minuten elk; vervolgens sonde met een HRP-geconjugeerde passende secundair antilichaam (1:5, 000 verdunning) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het bedrag van TBST gebruikt, is afhankelijk van de grootte van de container. Zorg ervoor dat het membraan in TBST volledig onderdompelen. Wassen van het secundaire antilichaam 3 x voor elke 5 min met TBST.
- Ontwikkelen van de vlek met behulp van substraat chemiluminescent reagens. Meng gelijke delen van het substraat en de buffer van de twee flessen, vlak voor gebruik. Het substraat toevoegen aan de bovenkant van het membraan te bestrijken het hele membraan met een pipet 1 mL en incubeer gedurende 1 minuut. De vlekken moeten worden beeld binnen 1 – 10 min van het toevoegen van het substraat.
- Zorgvuldig het membraan plaats met botte pincet op het platform van de imaging systeem (Zie Tabel of Materials), het vermijden van veel van de vloeistof. Selecteer een live weergave en kies blots en chemiluminiscence in het menu. Met behulp van handmatige acquisitie, verwerven meerdere belichtingen op verschillende tijdstippen. Deze bestanden kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd aan de hand van beeldbewerkingssoftware.
3. productie van knock-out muizen
- C-Fosfl/fl muizen met ROSACreERT2 muizen voor het genereren van ROSACreERT2c-Fosfl/fl muizen13steken. Als u wilt maken van de dubbel-knock-out (KO) muizen, broeden ROSACreERT2c-Fosfl/fl muizen met Dusp1- / - muizen voor het genereren van ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - muizen-13. Genotype de muizen door staart clips gevolgd door PCR, zoals hieronder beschreven.
-
Genotypering:
- Ter voorbereiding van het DNA, een klein deel van de staart knippen met een schaar en zet het in een 1,5 mL-buis. De staart met een verwarmde schaar uitbranden. Voeg 200 µL van 50 mM NaOH naar de geknipte staart in de buis en Incubeer bij 95 ° C in een blok van de warmte gedurende 1 uur.
- Vortex de buis goed en, vervolgens, te neutraliseren door toevoeging van 50 µL van 1 M Tris-HCl pH 6.8 en vortex opnieuw. Centrifugeer de buis bij maximumsnelheid voor 1 min.
- Verrichten van PCRs in 20 µL reacties in 0,2 mL, PCR dunwandige buizen met 1 x Taq polymerase master mix met kleurstof, 0,5 µM voor elke primer, 1 µL van DNA, en water. Plaatsen van de buizen in de thermocycler en voer de juiste cycli, zoals weergegeven in tabel 2.
- Voer het PCR product op 2% agarose gel en beeld met behulp van een documentatiesysteem gel.
4. isolatie van c-Kit+ cellen uit het beenmerg
- De muizen volgens de richtlijnen van de institutionele offeren.
Opmerking: Hier, de muizen werden blootgesteld aan kooldioxide (CO2) op een volgens de AVMA aanbevolen debiet tot dood was vastgesteld door de beeïndiging van de ademhaling en hartslag, gevolgd door cervicale dislocatie. - Oogst de beenbotten van de muis — twee dijbeen, twee zijn verbeend, twee iliacs. Schoon uit alle weefsels uit de botten door weg te schrapen met een scalpel. Zet de botten been in koude 1 x PBS op ijs — 5 mL in een tube van 15 mL. Giet de inhoud van de tube in een mortier en pletten met een stamper.
- Filtreer de celsuspensie door een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL schroefdop met een 10 mL pipet vastgemaakt, met behulp van een precisiepipet. Het wassen van de mortier en een stamper meerdere malen met koud 1 x PBS, verzamelen en celsuspensie toe te voegen aan de tube van 50 mL. Spin down beenmerg bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. verwijderen het supernatant via een vacuüm met een glazen pipet gekoppeld. Suspendeer de pellet cel in 5 mL 1 x PBS met een pipet.
- Met een pipet, Voeg langzaam geschorste beenmerg naar de top van 5 mL kamertemperatuur (de temperatuur is van cruciaal belang) polysucrose, met grote zorg niet te verstoren, de interface. Spin bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met de rem uitgeschakeld.
- Verzamelen van de interface bewolkt mono-nucleaire cel Totaal (TMNC) met een pipet en zet het in een nieuwe tube van 15 mL. Zodat het volume omhoog tot 10 mL met 1 x PBS voor het wassen, het nemen van 20 µL voor het tellen, en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. negeren het supernatant en opslaan van de pellet op ijs voor stap 4.6.1.
-
Uitvoeren van c-Kit+ cel isolatie.
- Volg een microbead kit-protocol voor de c-Kit+ cel isolatie. Resuspendeer de pellet cel in 80 µL van EDTA, 1 x PBS + BSA naar 107 cellen. Voeg aan de celsuspensie, 20 µL van CD117 MicroBeads/107 totaal aantal cellen. Meng goed door vortexing en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Zodat het volume tot 10 mL door toevoeging van 1 x PBS + EDTA + BSA en draai bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant via een vacuüm en opschorten van de cel pellet in 500 µL/108 totaal aantal cellen in het EDTA, 1 x PBS + BSA. De magneet-standaard gebruiken met de magnetische kolom gekoppeld, voeg 3 mL 1 x EDTA, PBS + BSA en laat ze via de zwaartekracht in een tube van 15 mL collectie doorstromen.
- Zodra de eerste buffer toevoeging heeft gebeëindigd doorsnijdt de kolom, voeg de celsuspensie naar de kolom, zodat het via zwaartekracht in de tube van 15 mL collectie doorstromen. Deze flowthrough is de Fractie van de ongewenste cel.
- Was de kolom 3 keer met EDTA, 3 mL 1 x PBS + BSA elke keer, waardoor zij doorheen via zwaartekracht in de collectie-buis kan stromen. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats op de top van een tube van 15 mL.
- Voeg 5 mL 1 x EDTA, PBS + BSA en het onmiddellijk spoelen met de zuiger voorzien van de kolom. Verwijder de zuiger en herhaal de flush met een extra 5 mL 1 x EDTA, PBS + BSA. De cellen in het totale volume met behulp van standaardmethoden tellen.
- Draai naar beneden de cellen bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in volledige IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + [50 ng/mL] mSCF FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) voor cultuur. Cultuur die deze cellen overnachting in 2 x 106 cellen/1 mL cel IMDM volledige media door ze te plaatsen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
5. signaaltransductie
-
Retrovirale plasmide transfectie
- Vers ontdooien HEK293 cellen de middag voordat in een waterbad ingesteld op 37 ° C. Draai de cryotube met de cellen van het HEK bij 435 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten verwijderen het supernatant via een vacuüm en het opschorten van de cel pellet in 1 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS, glutamine, penicilline en streptomycine.
- Cellen tellen en het juiste volume toe te voegen aan een 10 cm behandeld dish (~ 4 x 106 HEK293T cellen). 14 mL van de DMEM 10 media toevoegen aan de schotel en meng dit goed door te schuiven op en neer voor een gelijke verdeling. Plaats de schotel in een 37 ° C, 5% CO2 incubator's nachts.
- Controleer op de volgende ochtend de samenvloeiing van de cellen onder een omgekeerde lichte Microscoop (50% of meer werkt goed).
- Combineren van het DNA (gewenste retrovirale plasmide), PclEco (verpakking plasmide) 2 M CaCl2en H20 in een tube van 1,5 mL (= 500 µL) met behulp van een micropipet in de volgende bedragen: 7,5 µg DNA (BHG-ABL1-YFP), pCLeco, 62 µL van 2 M CaCl2 7,5 µg , en water tot een eindvolume van 500 µL. Voeg 500 µL van 2 x HBS tot een andere 1,5 mL koker.
- Voeg het DNA Meng ontkleuring aan de 1,5 mL-buis met 500 µL van 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES en 1,5 mM nb2HPO4) tijdens het mixen. Dit bereiken door een draaikolk instelt op de laagste snelheid en houd de buis van de HBS op het voor het mengen van de constante terwijl het toevoegen van de transfectie mix.
- Laat de mix van de Transfectie aan Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie, 25 nM chloroquine toevoegen aan de cellen van het HEK en plaats ze terug in de incubator. Na de incubatie, de transfectie mix ontkleuring aan het HEK cellen toevoegen en vervolgens voorzichtig swirl de media om te mengen van de mix van de transfectie gedurende de plaat.
- Incubeer de cellen met de mix voor ~ 8 h in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Media over deze cellen wijzigen door heel langzaam toevoegen 14 mL verse DMEM 10 media. Pipetteren langzaam tegen de muur van de schotel helpt te voorkomen dat eventuele strippen van de cellen van het HEK. Incubeer de cellen 's nachts in de 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Het virale supernatant verzamelen met een 10 mL spuit, trekken de bovendrijvende vloeistof in de spuit en bijvoegen van de filter van de spuit 0,45 µm. Duik de virale bovendrijvende substantie in een nieuwe collectie buis. Neem de eerste collectie van virale supernatant ~ 16 h later.
-
De virale concentratie fibronectine en transductie
- Voeg 2 mL van een fragment van de recombinante menselijke fibronectine 0.1 mg in 1 x PBS op onbehandeld 6-well cultuur platen. Zoveel fibronectine zo nodig voor te bereiden, die afhangt van het aantal cellen en genotypen. Een goed genoeg kan transduce 10 miljoen c-Kit+ cellen. Incubeer de plaat 's nachts bij 4 ° C.
- De volgende dag, verwijder de fibronectine uit de putjes met een pipet, Pipetteer 2 mL steriele 2% BSA in 1 x PBS te blokkeren van de plaat, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de BSA via een vacuüm en wassen grondig door pipetting 2 mL 1 x PBS en verwijderen via een vacuüm.
- Onmiddellijk toevoegen vers verzameld en gefilterd (0,45 µm) virale supernatant tot 5 mL. Centrifugeer bij 435 x g bij 32 ° C voor 2 h. Verwijder het supernatant via een vacuüm en herhaal deze stap met extra supernatans dat vers verzameld is virale en spin opnieuw. Verwijder het supernatant via een vacuüm en was de putjes goed door toevoeging van 2 mL 1 x PBS; Verwijder vervolgens het via een vacuüm.
- Voeg dat de c-Kit+ -muis cellen dat gekweekte overnachting (stap 4.6.6) de virale gecoate putjes door het mengen van de cel schorsingen goed en hen in de nu virale geconcentreerde fibronectine plaat pipetteren. Draaien op 1.200 x g bij 25 ° C gedurende 90 min. Zet de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- 48 h posttransduction, pellet de cellen door centrifugeren op 1200 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en resuspendeer hen in FACS buffer #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) 6 x 106/mL. Het percentage positieve cellen BCR-ABL1 bepalen door het meten van het percentage van de YFP positief met behulp van stroom cytometry.
- Verwerven van gebeurtenissen met de standaardprocedure. Ten eerste poort de levende cellen op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter. Vervolgens poort de YFP positieve levende cellen met uitzondering van de YFP-negativecells bepaald door negatieve controle (Figuur 4).
6. kolonie-vormende UnitAssays
- Ontdooi de methylcellulose met cytokines voor muis bij kamertemperatuur voor 1-2 h. aliquoot 3 mL methylcellulose in een FACS buis met een 5 mL injectiespuit zonder naald. De YFP-positieve cellen in een diasorteerderweergave cel sorteren.
- Draai de cellen naar beneden en Suspendeer de pellet in IMDM volledige media. De cellen om te worden bekleed en Verdun te verkrijgen van 5.000 YFP-positieve cellen in 100 µL van de volledige media IMDM tellen.
- Voeg 100 µL van de celsuspensie met 5.000 YFP-positieve cellen en de juiste remmers tot 3 mL van methylcellulose (Zie Tabel van materialen). Vortex op hoog te mengen het voor 10-30 s.
- Nadat de meeste van de lucht bubbels zijn ontsnapt, kunt een 1 mL spuit 1 mL van de media in drie repliceren 3 cm platen plaat door het uitwerpen van het medium aan de ene kant en langzaam het kantelen van de plaat in een cirkelmotie te gelijkmatig verspreid.
- De uiteindelijke concentratie van de remmers te gebruiken zijn imatinib op 3 µM, DFC op 0,2 µM en BCI op 0,5 µM, afzonderlijk of in combinaties. Waar nodig, de cellen met 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) toegevoegd aan de methylcellulose plating verwijderen c-Fos.
- Na de beplating, zet de platen in een grote petrischaal met een open schaal met 2 mL steriel water in het midden. Dekken de grote petrischaal en zorgvuldig uit te broeden bij de 37 ° C, 5% CO2 incubator. Record de nummers van de kolonie na een week van plating door te tellen het totale aantal kolonies onder een microscoop.
- Het analyseren van een paar kolonies van passende platen voor c-Fos schrapping door PCR. De kolonies verzamelen door zuigen ze met een tip P1000. De cellen in 500 µL van 1 x PBS verjagen door de tip in de PBS meerdere keren wassen. Draai de schorsingen van de cel bij 6.000 x g gedurende 1 minuut en uittreksel van het DNA van de cel pellet met behulp van een genomic DNA isolatie kit.
- Gebruik de genomic DNA voor PCR inleidingen mFos-FP3 en mFos gebruiken-RP5, zoals beschreven in tabel 2. Het analyseren van de PCR producten op een 2% agarose gel en beeld met behulp van een documentatiesysteem gel.
- Vlek voor een grafische voorstelling van de kolonies, de kolonies, met behulp van Iodonitrotetrazolium chloride. Los 10 mg van de Iodonitrotetrazolium chloride in 10 mL water voor een oplossing van 1 mg/mL. Filter steriliseren de oplossing met een Luer-lock met een 0,2 µm filter gekoppeld aan een 10 mL spuit onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek.
- In de weefselkweek kap, voeg 100 µL van de kleurstofoplossing ontkleuring rond de CFU plaat; Wees voorzichtig niet te glijden of verstoren van de koloniën. Incubeer de platen overnachting in een 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator. De kolonies zal verkleuren en worden donker roodachtig bruin. Met behulp van een witte achtergrond in de kap van de steriele weefselkweek, neem foto's van de gekleurde CFU-plaat.
7. transplantatie en sterfte Assay
- De muizen dodelijk te bestralen met split straling met behulp van een 137 Cs gebaseerde Gamma-ray bij een dosering van 7.0 Gy gevolgd door 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h uit elkaar voordat de transplantatie.
- Transplantatie van 4 x 104 ongesorteerd YFP-positieve (berekend op basis van het percentage van YFP) cellen met 3 x 105 normale beenmergcellen als een drager in elke muis via staart veneuze injectie.
- Na een week van transplantatie, bepalen de engraftment door het analyseren van de YFP-positieve cellen uit het perifere bloed met behulp van FACS.
-
Het uitvoeren van een staart ader afloopgebied en FACS analyse.
- Warm de kooi van muizen onder een warmte lamp met de nodige voorzichtigheid niet te oververhitten of branden.
- Een muis in een muis afdekking bedwingen en nick de staart ader met een steriele mes. Zachtjes melk de staart van anterior to posterior, waardoor een druppel bloed te accumuleren. Verzamelen van het bloed met een heparinized capillair totdat het is gevuld (verzamelen rond 75-100 µL). Duik het bloed uit het gevulde capillaire buis in een bloed collectie buis met EDTA en meng goed.
- Lyse de RBC door toevoeging van 30 – 40 µL bloed aan 3 mL 1 x RBC lysis-buffermengsel (ammoniumchloride 150 mM, 10 mM kaliumbicarbonaat en 0.13 mM EDTA). Meng goed, omkeren van de buis meerdere keren. Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 – 15 min. Spin bij 1.200 x g bij 4 ° C voor 5 min. Verwijder het supernatant via een vacuüm en Suspendeer de pellet in 2 mL 1 x PBS voor een wasbeurt.
- Draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en Suspendeer het in FACS buffer #1. FACS analyse uitvoeren zoals hierboven beschreven in stap 5.2.5–5.2.66. Op korte termijn winkel het resterende bloed in de buis van de collectie, die kan worden gebruikt voor diverse andere doeleinden, bij 4 ° C.
- Getransplanteerde muizen die 10-40% YFP-positieve cellen in het perifere bloed toonde werden gebruikt voor het experiment. Muizen die had minder dan 2% van de YFP-positieve cellen werden uitgesloten van de studie.
- Bereiden van tamoxifen bij 20 mg/mL in maïsolie bij 60 ° C met intermitterende vortexing totdat volledig is opgelost, en sla het bij 4 ° C in het donker voor de duur van de behandeling. Na een week van transplantatie, de c-Fosfl/fl -allel te verwijderen door het injecteren van tamoxifen (100 mg/kg in maïsolie) intraperitoneally (i.p.) in de muizen, elke dag gedurende drie opeenvolgende dagen. Het is belangrijk dat de muizen worden gewogen om te bepalen hoeveel tamoxifen te injecteren. Na de behandeling met tamoxifen (in voorkomend geval), de muizen voor drug behandelingen groep (n = 5/groep).
- De muizen voor leukemie progressie en overleving controleren en bepalen de leukemische last (YFP-positieve cellen door FACS) per tot acht weken in muizen te overleven.
- Analyseer het bloed voor c-Fos verwijdering waar nodig, zoals hierboven beschreven in punt 6. Registreren van het aantal overlevende muizen dagelijks en uitzetten van de curve van de overleving aan het einde van het experiment met behulp van een grafische software.
8. transgene muizen Model van BCR-ABL1 leukemie
-
LSK isolatie
- De Scl-tTA transgene muizen op doxycycline chow om te voorkomen dat een expressie van BCR-ABL1 handhaven. Vier weken voor de transplantatie, nemen de muizen uit de doxycycline chow voor BCR-ABL1 expressie.
- Isoleren TMNCs van de Scl-tTA transgene muizen zoals hierboven beschreven in punt 4. Opschorten van de TMNCs in FACS buffer #2 (1 x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) te verkrijgen van 106 cellen/mL.
- De TMNCs voor afkomst-positieve cellen afbreken door toevoeging van 10 µL van lineage cel detectie cocktail Biotine (Biotine-geconjugeerde monoklonale antistoffen tegen CD5 [rat IgG2a], CD11b [rat IgG2a], CD45R [B220] [rat IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rat IgG2a], en Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) per 1 x 106 cellen. Incubeer de cellen bij 4 ° C voor 10 min in het donker, gevolgd door een wassen met 5 mL FACS buffer #2, en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Aspirate het supernatant volledig en opschorten van de cellen in 400 µL van FACS buffer #2.
- 5 µL van anti-Biotine antilichaam-FITC-conjugaat, 1.2 µL van Ly-6A/E (Sca1) PECy7 en 2.4 µL van CD117 (c-Kit) APC antilichamen voor maximaal 108 miljoen cellen toevoegen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen doordat het volume tot 5 mL met FACS buffer #2; vervolgens Centrifugeer bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in 500 µL van FACS buffer #2.
- Filtreer de celsuspensie in een blauw filter-cap FACS buis.
- Gate levende cellen met behulp van voorwaartse en zijdelingse scatter. Selecteer vervolgens de lin- -cellen die MFI toonde (betekenen van de intensiteit van de fluorescentie van minder dan 102) om LSK cellen c-Kit+ en Sca1+ op een biexponential plot van het bovenliggende Lin- , en sorteer ze (Figuur 7 C).
- Verzamelen van de gesorteerde cellen samen en centrifugeer ze bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min.
-
Transplantatie
- Dodelijk bestralen de BoyJ muizen met een split stralingsdosis van 7.0 Gy gevolgd door 4,75 Gy na 3 uur voor de transplantatie.
- Injecteren 3 x 10-3 op 5 x 103 BCR-ABL1-LSK cellen met 0,3 x 106 helper beenmergcellen van WT BoyJ muizen via staart ader (i.v.) in het bestraalde BoyJ muizen.
- Vier weken posttransplantation, analyseren de ontvangende muizen voor CD45.1 en CD45.2. Het verkrijgen van de TMNC uit het perifere bloed door de staart ader bloeden zoals beschreven in stap 7.4. Resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS buffer. Incubeer de cellen met 1 µL van het FITC-CD45.1 en CD45.2-PE antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel de cellen doordat het volume tot 3 mL met FACS buffer en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer het in 200 µL van 1 x PBS.
- Analyseer het percentage op CD45.1 en CD45.2 door het eerste gating de levende cellen op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter, gevolgd door het gating FITC - en PE-positieve cellen op basis van het Onbevlekt monster.
- De muizen in vier groepen groeperen (n = 6 per groep). Begin van de behandeling met imatinib (75 mg/kg 2 x dagelijks) alleen en in combinatie met DFC + BCI (beide drugs kregen bij een dosis van 10 mg/kg 2 x dagelijks).
- Ook het behandelen van andere groepen met combinaties van imatinib (75 mg/kg) +++ curcumine (150 mg/kg) BCI (10 mg/kg) en imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) gedurende drie maanden, 2 x per dag, door ingespoten i.p.
- Analyseren van de muizen 1 x per maand voor zes maanden voor leukemische chimerism door bepaling van het percentage van CD45.2 positieve cellen in het perifere bloed door staart ader bloeden zoals beschreven in stap 7.4.
9. in Vivo evaluatie van BCI en DFC activiteit
-
Phospho-p38 analyse
- Neem drie leukemische muizen (8-12 weken oud), die met BCR-ABL1-uiting van c-Kit+ cellen, getransplanteerde waren zoals beschreven in paragraaf 7. Injecteer de muizen met BCI (10 mg/kg) door het injecteren van i.p. vier weken posttransplant.
- Het meten van phospho-p38 perifeer bloed TMNC met behulp van de fosforylatie stroom cytometry kit volgens de instructies van de leverancier. Het bloed van elke muis verzamelen voordat en 6 uur na de injectie van de drug. Isoleren van de TMNCs door uitputting van de RBC en als volgt corrigeren.
- Voeg 4 mL RBC lysis van de oplossing per 100 µL van perifeer bloed. Meng en incubeer op ijs voor 5 min lyse van de RBC. Spin down de cellen bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Herhaal de lysis 1 x meer.
- Na de tweede stap van de lysis van de cel pellets met 1 mL 2% BSA in PBS te wassen. Los van de cellen door toevoeging van 100 µL van fixatie en permeabilization oplossingen en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C in het donker. Pellet van de cel door centrifugeren op 1200 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- De pellets met 1 mL 1 x wassen van permeabilization wassen. Blokkeren van de cellen door het toevoegen van 300 µL van 2% BSA in permeabilization was buffer bij kamertemperatuur voor 20 min. de cellen verdelen in drie gelijke hoeveelheden van elk 100 µL (~ 1 x106).
- Voeg 1 µL van totale p-38 antilichaam, 1 µL van phospho-p38 antilichaam of 1 µL van isotype IgG controle, respectievelijk aan elk aliquot van vaste cellen en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Wassen van de cellen 1 x met 5 mL 2% BSA in PBS en incubeer met secundair antilichaam (1 µL van Alexa Fluor-488 geconjugeerd) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De cellen 1 x weer wassen en hen op te schorten in 200 µL van 1 x PBS.
- De gegevens door FACS verwerven en analyseren door stroom cytometry analysesoftware.
- Aftrekken van de MFI's van het IgG-besturingselement aan de MFI van de experimentele monsters. De MFI-waarden van phospho-p38 zijn dan op die van totale p-38 om te bepalen van de phospho-p38 niveaus na de injectie BCI genormaliseerd.
-
Kwantitatieve gen expressie analyse van c-Fos doelgenen
- Neem drie leukemische muizen (8-12 weken oud), die met BCR-ABL1-uiting van c-Kit+ cellen getransplanteerde waren zoals beschreven in paragraaf 7. Het perifere bloed verzamelen van elke muis en vervolgens het injecteren van de muizen met 10 mg/kg elke DFC + BCI.
- Verzamelen het perifere bloed 6 uur na de injectie van de drug. Isoleren TMNCs door uitputting van de RBC, zoals hierboven beschreven. De TMNCs pellet en hen op te schorten in een fenol gebaseerde lysis-buffermengsel (Zie Tabel van materialen).
- Analyse van de RT-qPCR (zoals beschreven in sectie 1) uitvoeren voor Bcl2l11, Lif en IL-6 gen-specifieke primers (weergegeven in tabel 1) gebruiken.
10. langdurige cultuur-initiëren cel Assay
Opmerking: Een LTCIC test werd uitgevoerd zoals eerder beschreven25.
- Een muis fibroblast cellijn MS-5 in MEMα aan confluentie in een maatkolf van T175 weefselcultuur groeien. Trypsinize de cellen zoals hierboven beschreven voor HEK293T. Opschorten van de cellen in MEMα 2 x 106 cellen/ml. Neem 10 x 106 cellen in een conische tube van 50 mL en bestralen op 80 Gy. Verdun de cellen naar 0,5 x 106 cellen/mL in MEMα aangevuld met 10% FBS (M10) media. Plaat van 2 mL per putje in een 12-well-plaat en het in een 37 ° C, 5% CO2 incubator's nachts uit te broeden.
- Op de volgende dag, bereiden de hydrocortison natrium hemisuccinate door ontbinding van 2,5 mg in 5 mL MEMα (1 M oplossing). Filter-steriliseren de hydrocortison oplossing 0,2 µm spuit u een filter gebruikt in de kap van de bioveiligheid. Verdun de hydrocortison door seriële verdunning in MEM te verkrijgen van een oplossing van 100 µM. Meng 250 µL van dit 25 mL menselijke op lange termijn kweekmedium (HLTM) (Zie Tabel van materialen) net vóór gebruik, om een eindconcentratie van 1 µM.
- Draai de CML-CD34+ en UCP3 TMNCs schorten hen in de HLTM door korte vortexing en bepalen de graven door een hemocytometer.
- Vacuüm uit de M10 media van de plaat van de 12-well bezaaid met stroma cellen en te vervangen door de 1 mL van patiënt cel (CML-CD34+ [10.000] en UCP3 TMNCs [1 x 106]) schorsing in HLTM. Gebruik drie putten per drug combinatie per celtype.
- Verdun de drugs voorraden tot 2 x van de vereiste concentratie in HLTM. 1 mL van de media met drugs aan de bovengenoemde cellen tot een concentratie van 1 x drug aan toevoegen. Vervang de helft van de media met vers bereide HLTM elke week gedurende vijf weken.
- Aan het einde van de periode van zes weken LTC-IC assay, door nonadherent cellen in een buis uit de culturen te verzamelen. Trypsinize Adherente cellen en deze te combineren met de corresponderende nonadherent cellen.
- Wassen van de cellen en assay voor CFUs in methylcellulose medium met 30% foetaal kalfsserum, Erytropoëtine (3 eenheden/mL), SF (50 ng/mL), en IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), en granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) (20 ng / mL). bepalen van de graven door een hemocytometer.
- Plaat 5 x 104 cellen in drie wordt gerepliceerd. Bevriezen van de resterende cellen in 20% FBS en 10% DMSO. Rangschik de platen in een grote petrischaal met een open schaal met water in het midden. Bedek de grote petrischaal zorgvuldig en Incubeer het in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor twee weken.
- Score van de kolonies twee weken later. In sommige gevallen is slechts een deel van de oogst vehiculumcontrolegroep CFUs). Bereken dat het totale aantal LTCIC aanwezig in de initiële celsuspensie door extrapolatie op basis van de CFUs verkregen uit deel van de oogst van de cel. De gemiddelde CFU output per LTC-IC is 8.
Opmerking: Bijvoorbeeld, als het in eerste instantie 1 x 106 cellen in een goed, na vijf weken, waren verguld 0,5 x 106 cellen zijn geoogst, CFU, 5 x 104 cellen werden verguld en 50 CFUs werden verkregen. Dit is gelijk aan 500 CFUs/1 miljoen vergulde cellen. Deelt u dit getal door 8 om het LTCIC, oftewel 62,5.
11. gehumaniseerd muismodel met behulp van CML CD34+ cellen
- Sublethally het bestralen van de 8 weken oude knik scid gamma muizen, uitdrukken van menselijke IL3, GM-CSF en SCF (NSGS), met een enkelvoudige dosis van 7.0 Gy (700 rads) met 50 rads/min.
- Injecteren van 3 x 106 CD34+ geselecteerde cellen van BCR-ABL1-positieve CML chronische fase patiënten in de bestraalde muizen door intraveneuze injectie.
- Na twee weken van transplantatie, bepalen leukemische engraftment in beenmerg door FACS met muis - en mens-specifieke antilichamen tegen CD45.
-
Een FACS analyses uit te voeren.
- Neem de beenmergaspiraat van het dijbeen van de getransplanteerde muizen. Lyse van RBC met behulp van RBC lysis buffer zoals hierboven beschreven en de TMNCs verzamelen door middel van centrifugeren. Wassen van de pellet 1 x met koude 1 x PBS.
- Blokkeren van de cellen met menselijke FcR blok en muis FcR blok gevolgd door kleuring met anti-mens CD45 FITC en anti-muis CD45 APCCy7 's nachts bij 4 ° C. De FACS analyses uit te voeren op LSRII en analyseren van gegevens met behulp van stroom cytometry analysesoftware.
- De muizen in vier verschillende cohorten groep (n = 6/groep) voor de behandeling met voertuig, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (beide op 10 mg/kg), of imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (beide op 10 mg/kg). Verdun de voorraad drugs in 1 x PBS (voertuig) en hen te beheren door het injecteren van hen i.p. 2 x dagelijks.
- De muizen gedurende zes weken behandelen en bepalen de leukemische last om de twee weken, tot week acht na de transplantatie zoals hierboven beschreven in 11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oncogen verslaving heeft betrokken bij de therapeutische werking van TKIs. De besturen van de afhankelijkheid van oncogen mechanismen worden echter niet begrepen. Wij uitgevoerd meerdere onbevooroordeelde gen expressie analyses ter identificatie van de genetische component die betrokken zijn bij het orkestreren van de verslaving. Deze analyses bleek de opregulatie van drie genen, c-Fos, Dusp1 en Zfp36, in de kankercellen die niet oncogene signalering om te overleven afhankelijk zijn en, dus, zijn ongevoelig voor TKI behandeling. De Downregulatie van c-Fos en Dusp1 door shRNA-gemedieerde knockdown is voldoende om te herstellen van de gevoeligheid van de drug in anders TKI-resistente cellen.
Voor het valideren van de rol van c-Fos en Dusp1 als de therapeutisch doel in leukemie, werd hun overexpressie eerst bevestigd met behulp van BaF3 cellen uiten het BCR-ABL1-oncogen. Groeifactor signalering in de cellen van de BaF3-BA intrekt oncogen afhankelijkheid; Dientengevolge, reageren zij niet op TKI behandeling. Analyse van de kwantitatieve expressie door RT-qPCR en het westelijke bevlekken bevestigd dat zowel c-Fos en Dusp1 zijn geïnduceerd door BCR-ABL1 en hun uitdrukking wordt verder aangevuld door de groeifactor IL-3 (figuur 1A - 1 C).
Studie van de rol van c-Fos en Dusp1 in vivo muizen ontbreekt c-Fos (voorwaardelijke muis model c-Fosfl/fl met Rosa26-CreERT2) of Dusp1 (rechte KO Dusp1- / -) en muizen ontbreekt zowel c-Fos en Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) werden ontwikkeld. Deze muizen waren gegenotypeerde door PCR gebruikend genomic DNA van de staart, en PCR gemakkelijk onderscheiden de c-Fosfl/fl, Dusp1 KO uit de WT-muizen(Figuur 2). De geïnduceerde schrapping van c-Fos door tamoxifen behandeling werd bevestigd door PCR, door de verschijning van een band in vergelijking met geen band in muizen niet behandeld met tamoxifen (Figuur 2B).
Als u wilt testen van de rol van c-Fos en Dusp1, het beenmerg-afgeleide c-Kit+ cellen uit de WT, Dusp1- / -, c-Fosfl/fl, en Dusp1- / -/c-Fosfl/fl waren geïsoleerd en getransduceerde met MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP retrovirussen; een schema van de procedure is afgebeeld in Figuur 3. YFP+ uitdrukken (gebruikt als een marker surrogaat voor BCR-ABL1 expressie) waren gesorteerd FACS (Figuur 4) voor verdere in vitro (CFU) en in vivo tests. Uit de resultaten blijkt dat de schrapping van c-Fos en Dusp1 alleen geremd CFU nummers (< 50%). Interessant, cellen ontbreekt zowel c-Fos en Dusp1 waren aanzienlijk aangetast in hun kolonievormend vermogen, imatinib behandeling weggevaagd van alle CFUs, suggereren dat het verlies van c-Fos en Dusp1 is synthetisch dodelijk voor BCR-ABL1 expressie (Figuur 5 ).
De in-vitrotests CFU inschakelen onderzoekers het fenotype van de KO en activiteit van de klein molecuul remmers snel te testen. Echter verder bevestigt in vivo analyse de geldigheid van de doelstellingen. Voor in vivo validatie, we eerst een snelle transductie transplantatie model1 waar BCR-ABL1 sterfte binnen twee tot drie weken veroorzaakt gebruikt. Vijftig duizend YFP-positieve cellen, samen met 300.000-500.000 beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen van de normale muis, waren geïnjecteerd in dodelijk bestraalde muizen voor het opwekken van CML. De muizen uitvoering de c-Fosfl/fl cellen of de c-Fosfl/flDusp1- / - cellen werden ingespoten met tamoxifen na 10 dagen van transplantatie te verwijderen van het c-Fos. Muizen die WT of Dusp1- / - cellen ontvangen ontwikkeld leukemie en bezweken aan dood binnen twee tot vier weken, terwijl het schrappen van c-Fos alleen toonde een aanzienlijke vertraging in de ontwikkeling van de ziekte en de behandeling van de TKI bijna 50% van de muizen van de dood gered. Interessant is dat de muizen die getransplanteerd met cellen ontbreekt zowel c-Fos en Dusp1 overleefde langer, en de TKI behandeling genezen alle muizen voor het CML (figuur 6A - 6 C). De muizen die overleefd geleidelijk verloren de YFP+ cellen, zoals weergegeven in c-Fos en dubbele KO wanneer behandeld met imatinib (figuur 6D-6F), suggereert de goedkeuring van de BCR-ABL1 positieve cellen.
Gezien het feit dat CML is een ziekte van de cel van de stam, gezien het onvermogen van de retrovirussen te richten op de primitieve en rustige hematopoietische cellen, is het absoluut noodzakelijk zou om te testen of gericht op c-Fos en Dusp1 volstaan om te elimineren de leukemische cellen van de stam. Tetracycline-afleidbare BCR-ABL1 transgene muizen waar tTA wordt uitgedrukt door een Scl-enhancer, waarin specifiek wordt uitgedrukt in hematopoietische stamcellen, hebben eerder gebruikt om te bestuderen van de rol van de doelgenen in LSCs. De tetracycline-afleidbare BCR-ABL1 transgene muizen (figuur 7A-7B) werden gebruikt voor het onderzoek naar de rol van c-Fos en Dusp1 in LSCs. De cellen van de LSK van deze muizen waren gesorteerd met behulp van FACS en geïnjecteerd in de ontvangende muizen (Figuur 7C). Na een maand van transplantatie, werd leukemische engraftment gescoord, gevolgd door medicamenteuze behandeling. De leukemische last en niveaus van LSK waren vastbesloten elke maand voor zes maanden. Muizen behandeld met imatinib alleen toonde een onderdrukking van leukemie, maar bleven met de MRD. Daarom, stopzetting van de behandeling, zoals waargenomen in de kliniek, opgeleverd relapse van de ziekte. In tegenstelling, muizen behandeld met een combinatie van drugs imatinib + DFC (c-Fos-remmer) + BCI (Dusp1 remmer) volledig uitgeroeid de leukemische cellen, en de muizen werden genezen van CML (figuur 7D en 7E).
Om de uitlezing van de farmaco-dynamic voor c-Fos en Dusp1 remmers en studie hun effect op de doelsoort, phospho-p38 niveaus (een surrogaat marker voor Dusp1 remming) werden gemeten en de expressie van genen die c-Fos-geregeld, zoals IL-6, bcl2l11 en Lif, werd gekwantificeerd. Wij en anderen hebben vastgesteld dat de remming van de Dusp1 in het activeren van p38 (gemeten door de verhoogde fosforylatie van p38)13 resulteert. Phospo-p38 niveaus werden gemeten door FACS in volbloed cellen geïsoleerd van drug-behandelde muizen. Zoals verwacht, de phospho-p38 niveaus verhoogd (Figuur 8A) en de expressie van genen c-Fos-gereglementeerde (IL-6, bcl2l11 en Lif) waren werden in drug-behandelde muizen (Figuur 8B). Deze resultaten suggereren dat de remmers hun doel remmen en het voortbestaan van muizen te wijten aan de remming van c-Fos en Dusp1 is.
Voor menselijke relevantie, de doeltreffendheid van c-Fos en Dusp1-inhibitoren werden getest met behulp van patiënt monsters in in vitro (LTC-IC) en in vivo tests (muis xenografts). De behandeling met DFC + BCI is niet effectief op leukemische cellen van de stam. Echter, een combinatie van DFC BCI + imatinib uitgeroeid selectief de leukemische cellen van de stam in beide testen terwijl het sparen van normale cellen van stamcellen (figuur 9A - 9 C). Deze resultaten stellen dat c-Fos en Dusp1 essentieel voor leukemische transformatie zijn, en een verhoogde expressie van deze genen intrekt oncogen afhankelijkheid resulterend in ziekte herval en weerstand. Een combinatorische doelgerichtheid van c-Fos en Dusp1 samen met stuurprogramma oncogen zal dus effectiever en, misschien, een curatieve strategie voor vele vormen van kanker. Wij verwachten dat de hier beschreven methoden in het algemeen kunnen worden toegepast voor extra target identificatie en validatie.
Figuur 1 : c-Fos en Dusp1 zijn overexpressie in reactie op de groeifactor IL-3. qPCR analyse van een overexpressie van c-Fos (A) en (B) Dusp1 in BaF3-BA-cellen cytokine-behandeld. De relatieve expressie werd vastgesteld na normalisatie te β-actine. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie monsters. (C) westelijke vlekkenanalyse van BaF3-BA cellen met IL-3 behandeld en peilden met c-Fos totaal- of P-c-Fos en Dusp1 antilichaam. Anti-actine antilichaam werd gebruikt als het laden van de controle. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Kesarwani et al.,13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Genotypering van c-Fosfl/flDusp1 en Rosa cre-ER muizen. (A) PCR analyse van DNA van de staart. Verwacht bands zijn vanuit WT of vanuit de c-Fosfl/fl-uitvoering CreER transgenic en Dusp1 KO muizen. De maten van de band worden aangegeven aan de linkerkant. (B) PCR analyse van een kleinere band na het schrappen van c-Fos met tamoxifen behandeling. M = 1 kb + DNA-Ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Schematische van de transductie en -transplantatie model. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : FACS tonen de frequentie van YFP+ cellen van het bloed van een getransplanteerde en een WT muis (negatieve controle). De bovenste panelen tonen een scatterplot van de cellen en het gating. De lagere panelen tonen histogrammen van YFP vs. kant scatter. Cellen met een MFI van > 103 werden beschouwd als YFP +. Soortgelijke gating werd gebruikt voor beenmergcellen na transductie voor de berekening van het percentage transductie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Representatief platen van CFU plating. De platen tonen de kolonies gekleurd met iodonitrotetrazolium chloride. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : c-Fos en Dusp1 tekortkomingen compromis leukemie ontwikkeling. (A-C) Overleving curven van muizen getransplanteerde met c-Kit+ BCR-ABL1 cellen uit WT, Dusp1- / -c-Fos- / -, en c-Fos- / - Dusp1- / - muizen. (D-E) Percentage van YFP + cellen zoals bepaald door FACS in het perifere bloed van de getransplanteerde muizen getrokken elke week posttransplant. De niveaus van YFP te verhogen en de muizen bezwijken voor de dood zoals in WT en Dusp1 KO. De muizen die geleidelijk overleven verliezen de cellen van de YFP+ zoals weergegeven in c-Fos en dubbele KO wanneer imatinib behandeld. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Kesarwani et al.. 13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : c-Fos en Dusp1 zijn vereist voor het voortbestaan van LSCs. (A) schema van de transgenic gebruikt in transgene muizen BCR-ABL1 uiten in stamcellen. (B) proefopzet voor het bestuderen van de effecten van Dusp1 en c-Fos remming door DFC en BCI in vivo. (C) FACS percelen van de schommel gating strategie gebruikt voor het sorteren van de LSK cellen voor transplantatie. (D) Percentage van de BCR-ABL1 (bepaald door het percentage van de CD45.2 van donor muizen) positieve cellen in muizen tijdens en posttreatment met remmers. (E) FACS scatter percelen weergegeven: de CD45 chimerism in levende cellen, alsmede in het compartiment van de cel LSK. Let op: het ontbreken van CD45.2 in totaal en in het compartiment van de LSK in behandelde muizen. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Kesarwani et al.,13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: In vivo activiteit van DFC en BCI. (A) lijn grafiek weergeven van de niveaus van phospho-p38 na BCI behandeling. (B) RT-qPCR de uitdrukking van de c-Fos doelgenen in perifeer bloed van de muizen tonen na DFC behandeling. De puntjes vertegenwoordigen drie replicaat-organismen uit elke muis (n = 3). Het nummer boven de grafieken vertegenwoordigen de p-waarde berekend door de Student t-test. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Kesarwani et al.,13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Rol van c-Fos en inhibitie van de DUSP1 in een menselijke patiënten monster. (A) Percentage van de CFUs bepaald door de bepaling van de LTC-IC van twee CML-patiënten, en een gezonde donor behandeld met voertuig of de aangegeven drug-combinaties. (B) Percentage van menselijke leukemische cellen (hCD45) in het beenmerg van NSGS muizen op week 2 (links) en week 4 (rechts) van de behandeling. (C) dit paneel toont representatieve FACS plots een drastische vermindering van de hCD45 cellen in de drug-behandelde muizen tonen terwijl het sparen van de muis cellen weergegeven als mCD45. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Kesarwani et al.,13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het grootste deel van kankercellen, is het therapeutisch antwoord op TKI gemedieerd door een blokkade van de tyrosine-kinase-oncoprotein signalen waaraan de tumor verslaafd is. Echter is relatief weinig bekend over hoe een minderheid van kankercellen bij te dragen aan MRD de oncogen afhankelijkheid en therapie4ontsnappen. Recente studies is gebleken dat de groeifactor signalering medicamenteuse resistentie bij zowel de leukemie en de solide organ-tumoren bemiddelt. Dit suggereert dat verschillende moleculaire mechanismen intrinsieke weerstand10,11,12ten grondslag kunnen liggen. Om te begrijpen van het mechanisme en identificeren van gene doelstellingen voor therapeutische ontwikkeling, we uitvoerige geheel-genoom uitdrukking profielen met behulp van de muis (BaF3) en menselijke (K562) cellen uitgevoerd. Primaire monsters van leukemische muizen of CML-patiënten werden niet gebruikt omdat we vermoedden al dat, zoals primaire beenmerg monsters aanzienlijk heterogene zijn, ze zal het masker van de identiteit van de relevante genen/doelstellingen. Zelfs de cellen gezuiverd door het antilichaam-gemedieerde sorteren (stam voorlopercellen) vertonen aanzienlijke heterogeniteit. Daarom is een gezuiverde cellijn is waarschijnlijk beter geschikt voor target identificatie om te voorkomen dat eventuele ongewenste complexiteit opgelegd door genetische heterogeniteit. De analyse van het geheel-genoom expressie vastgesteld dat c-Fos, Dusp1 en Zfp36 vaak upregulated in resistente cellen zijn. Zodra de doelstellingen worden vastgesteld, wordt hun validatie een cruciaal onderdeel te erkennen van hun rol in de bepaalde genetische context. CDNA overexpressie en genetische studies van de vechtpartij, waarbij in cellen van de BaF3 bleek dat de remming van c-Fos en Dusp1 voldoende en noodzakelijk zijn voor de effectieve gevoeligheid van de TKI is. Misschien is een van de belangrijkste stappen in doel validatie voor het valideren van de relevantie van geïdentificeerde genen/doelen in primaire monsters van zowel de muis en de mens. In dit protocol, wij bieden stap voor stap gebruik van meerdere genetische modellen en beter mechanistische inzichten te bieden voor de verdere verfijning van de drug/target evaluatie.
Een snelle screening op cellulair niveau met behulp van CFUs of de LTCIC assay helpt onderzoekers voor het testen van meerdere combinaties van drugs, evenals concentraties, snel voordat u naar meer tijdrovende transplantatie methoden. Gezien het feit dat CML een ziekte van de cel van de stam is, en gezien het onvermogen van de retrovirussen te richten op de primitieve en rustige hematopoietische cellen, is het noodzakelijk om te testen met behulp van modellen die rechtstreeks betrekking hebben op hun rol in de LSC overleven. Om aan te pakken dit, wij een tetracycline-afleidbare BCR-ABL transgene muis waar tTA wordt uitgedrukt door een Scl-versterker gebruikt. Niettemin, genetische modellen zijn tekort aan Recapitulerend het ziekten bij de mens. Daarom moeten primaire patiënt testopnames in gehumaniseerd Muismodellen. Om te kunnen doen van een lange-termijn studie voor de detectie van MRD na verloop van tijd, een stabiele xenograft is echter vereist dat, afhankelijk van de muizen en de cel typen, kan variëren. Na vier maanden van transplantatie, waren de menselijke CD34 + cellen uitgeput zelfs zonder de medicamenteuze behandeling, dat een beperking in de meest gehumaniseerd Muismodellen is. Betere gehumaniseerd Muismodellen worden ontwikkeld voor het testen van de menselijke cellen in muizen26. Wij raden bepalen van de activiteit op de doelsoort van de remmers zoals af-target effect kan veroorzaken toxiciteit voor normale cellen, de verdere toepassing ervan te beperken. Echter, indien de downstream doelstelling is niet bekend, verschillende benaderingen moeten worden benut. Bijvoorbeeld, identificeren de resistente mutanten met behulp van willekeurige mutagenese van het target-eiwit kan direct worden aangepakt of de Inhibitor van de omwenteling op doel27 is.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een uitgebreide methode voor target identificatie en validatie met behulp van meerdere in vitro en in vivo modelsystemen. Deze methoden kunnen gemakkelijk aangepast worden aan andere doelstellingen en soorten kanker. Verdere mechanistisch onderzoek naar aangegeven doelstellingen en verfijning in drug targeting kan helpen bij de ontwikkeling van betere therapeutische modaliteiten voor effectieve en/of curatieve behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn G. Q. Daley dankbaar voor het verstrekken van de BaF3 en WEHI cellen en T. Reya voor de MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP bouwt. De auteurs zijn M. Carroll dankbaar voor het verstrekken van de patiënt monsters uit de CML blast crisis. Deze studie werd ondersteund door subsidies te M.A. van de NCI (1RO1CA155091), leukemie Research Foundation en Stichting V en van de NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
