Summary
Здесь мы описываем протоколы для проверки генетические и химические c-Fos и Dusp1 как цель наркотиков в лейкоз, с использованием модели в vitro и in vivo генетических и гуманизированные мыши. Этот метод может применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.
Abstract
Демонстрация ингибитора киназы тирозина (TKIs) в лечении хронический миелолейкоз (CML) ознаменовало новую эру в терапии рака. Однако имеется небольшая популяция клеток не реагировать тки лечения, что приводит к минимальной остаточной болезни (моб); даже наиболее мощным TKIs не в состоянии искоренить эти клетки. Эти клетки MRD служат водохранилище развивается устойчивость к терапии. Не известно, почему тки лечения неэффективны против MRD клетки. Фактор роста сигнализации подразумевается в поддержке выживания MRD клеток во время лечения тки, но хватает механистического понимания. Недавние исследования показали, что повышенные c-Fos и выражение Dusp1 результате конвергентной онкогенных и фактор роста сигнализации в клетках MRD посредником тки сопротивления. Генетические и химическое ингибирование c-Fos и Dusp1 оказывает CML изысканно чувствительна к TKIs и лечит ХМЛ в обеих моделях генетических и гуманизированные мыши. Мы определили эти целевых генов, используя несколько microarrays тки чувствительных и - устойчивостью клеток. Здесь мы предлагаем методы для целевой проверки с использованием моделей мышей в vitro и in vivo. Эти методы могут легко применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.
Introduction
Учредительный тирозин киназы активность онкогена сплавливания BCR-ABL1 вызывает CML, который обеспечивает логическое обоснование для целевым активность протеинкиназы ингибиторов малые молекулы. Успех TKIs в лечении больных ХМЛ революцию в концепции таргетная терапия1,2. Впоследствии, анти киназы терапии как точность медицины был разработан для нескольких других злокачественных опухолей, включая солидных опухолей. Пока более тридцати ингибитора киназы были одобрены Объединенной государства FDA для лечения различных злокачественных опухолей. Хотя тки лечение очень эффективен в подавлении заболевание, это не лечебной. Кроме того, имеется небольшая популяция клеток рака сохраняется во время лечения: MRD3,4,5. Даже пациенты, которые показали полной ремиссии остались с моб, который в конечном итоге результаты в рецидив, если не постоянно подавляются. Таким образом ликвидация MRD клеток необходима для достижения прочного или лечебных ответ. CML представляет собой ценный парадигмы для определения понятие точности медицины, механизмы онкогенеза, рациональные направлена целевой терапии, прогрессирования заболевания и лекарственной устойчивости. Тем не менее даже сегодня, механизм вождения тки индуцированной клеточной гибели раковых клеток не поняты, ни почему MRD клетки (состоящий из лейкозных стволовых клеток [LSCs]) внутренне устойчивы к TKIs4,6. Тем не менее феномен «онкогена зависимости «мутант киназы онкопротеин причастны тки эффективность, где острые ингибирование целевых онкогена, TKIs вызывает онкогенных шок, который приводит к массовым проапоптотических ответ или покоя в ячейке контекстно зависимые образом6,,78,9. Однако хватает механистический основу онкогена зависимость. Недавние исследования замешаны что фактор роста сигнализации аннулирует онкогена зависимость и следовательно наделяет сопротивление ТКИ терапии10,,1112. Поэтому чтобы разобраться в механизме онкогена зависимости, мы провели всего генома выражение профилирования от BCR-ABL1 зависимым и nonaddicted клетки (выращенных с факторами роста), которые показали, что c-Fos и Dusp1 являются критическим медиаторов онкогена наркомании13. Генетических исключение c-Fos и Dusp1 является синтетический смертельны для выражения BCR-ABL1 клетки и мышей, используемые в эксперименте не развиваться лейкемия. Кроме того ингибирование c-Fos и DUSP1 в малых молекул ингибиторов вылечить BCR-ABL1-индуцированной CML мышей. Результаты показывают, что уровни выражения c-Fos и Dusp1 определить порог apoptotic в раковых клетках, таким образом, что более низкие уровни возлагают лекарственной чувствительности при более высоких уровнях вызывают резистентность к терапии13.
Чтобы определить гены, вождения онкогена зависимость, мы провели несколько выражение всего генома, профилирование эксперименты в присутствии фактор роста и тки (imatinib) с помощью мыши - и CML пациента производные клетки (K562). Эти данные были проанализированы параллельно с CML пациента наборы данных, полученные из CD34+ гемопоэтических стволовых клеток до и после лечения иматиниба. Этот анализ выявил три генов (транскрипционный фактор [c ПКС], двойной специфика фосфатазы 1 [Dusp1] и RNA-связывая протеинов [Zfp36]), часто upregulated в тки устойчивостью клеток. Чтобы проверить значение этих генов в присвоении лекарственной устойчивости, мы осуществили поэтапный анализ in vitro и in vivo . Уровни выражения этих генов были подтверждены ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР) и Западный blotting лекарственно-клетках. Кроме того, гиперэкспрессия cDNA и сногсшибательно, индуцируемый заколки c-ПКС, Dusp1, и Zfp36 показали, что повышенные c-Fos и Dusp1 выражения, достаточно и необходимо придать тки сопротивления. Таким образом мы провели в естественных условиях проверки, с помощью мыши модели только с c-Fos и Dusp1. Для генетической проверки c-Fos и Dusp1 мы создали ROSACreERT индуцибильный c-Fosfl/fl мышей (условное нокаут)14 и скрещивали их с Dusp1- / - (прямая нокаут)15 сделать ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - двойной трансгенных мышей. Клетки костного мозга, полученных c комплект+ (от c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- и c-Fosfl/flDusp1- / -) выразил BCR-ABL1 были проанализированы в пробирке в колонии формируя assay блок (CFU) и в VIVO трансплантации костного мозга в смертельно облученного мышей, проверить требования c-Fos и Dusp1 отдельно или вместе в развития лейкоза. Аналогичным образом, химическая запреты c-Fos DFC (difluorinated куркумин)16 и Dusp1, BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 были протестированы в vitro и in vivo, используя BCR-ABL1-выражая, кость клетки костного мозга, полученных c комплект+ от дикого типа мыши (WT). Чтобы подтвердить требование c-Fos и Dusp1 в лейкозных стволовых клеток, мы использовали модель мыши CML, где BCR-ABL1 был специально индуцированных в его стволовых клеток доксициклин (тет transactivator выражает под мышиных стволовых клеток лейкемии (SCL) ген 3' усилитель 18,регулирование)19. Мы использовали костного Линь–c комплект Sca++ (ЛСК) клетки от этих мышей в assay в естественных условиях пересадки. Кроме того, мы создали phopsho-p38 уровней и выражение ИЛ-6 как Фармако динамические биомаркеров для Dusp1 и c-Fos ингибирование, соответственно, в естественных условиях. Наконец, расширить сферу охвата исследования человека актуальности, пациент производные CD34+ клеток (эквивалент в c комплект+ клетки от мышей) были подвергается долгосрочный в пробирке инициирование культуры клеток анализов (LTCIC) и в естественных условиях гуманизированные мыши модель CML20,21. Иммунодефицитных мышей были пересажены с CML CD34 + клеток, следуют медикаментозное лечение и анализ выживаемости лейкозных клеток человека.
В этом проекте мы разрабатываем методы для идентификации цели и проверки с помощью генетических и химических средств, с использованием различных доклинических моделей. Эти методы могут успешно применяться для проверки других целей разработки химических методов терапевтического развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены согласно указаниям институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Цинциннати Детская больница медицинского центра (CCHMC). Человеческих особей (нормальный BM и что от CML (p210-BCR-ABL +) лейкемия) были получены через институциональных Наблюдательный Совет одобрил протоколы (институциональных Наблюдательный Совет: Federalwide гарантия #00002988 Цинциннати Детская больница медицинский центр) и доноров обоснованного согласия от CCHMC и Университета Цинциннати.
1. в режиме реального времени ПЦР анализа
- Изолируйте всего РНК из клеток BaF3, растущих в RPMI, дополненные 10% FBS и 10% WEHI провел питательной среды как источник интерлейкина-3 (IL-3).
- Урожай клетки на логарифмической фазы (99% живых) из очищенных (IL-3 и imatinib), а также от необработанных образцов и центрифуги их в 435 x g на 3 мин. Здоровье и этапов роста клеток являются критическими, как их профили выражение гена может резко измениться.
- Изолируйте РНК путем очистки всего РНК22. Количественную оценку всего РНК; Затем при условии его DNase лечения23. Преобразовать равное количество свободных ДНК РНК (2 мкг) для cDNA с обратной транскриптазы24.
- Выполняют ценообразующие с ген специфические праймеры (Таблица 1). Осуществляют ГКДЗ в 20 мкл реакциях в 0,2 мл, тонкостенных труб ПЦР с оптическим шапки, с помощью 1 x полимеразы микс (см. Таблицу материалы), 0,5 мкм каждого праймера, 1 мкл ДНК, и воды. Место реакции в Термоциклер с следующим циклом: шаг 1, 95 ° C в течение 10 минут; Шаг 2, 95 ° C 15 s; Шаг 3 на 60 ° C в течение 1 мин; Шаг 4, повторите шаги 2-3 40 раз. Выполнить все ГКДЗ в triplicates и нормализации данных в реальном времени в β-актина выражение перед печатью.
2. западный Blotting
Примечание: Целом клеточных экстрактов были подготовлены путем добавления 250 мкл 1 x литического буфера, как описано в Kesarwani et al.13 дополнить с ингибитором протеазы коктейль и АБС битор фосфатазы коктейль 2.
- Урожай пять миллионов BaF3 клеток на логарифмической фазы (99% живых) от лечение (IL-3 и imatinib), а также от необработанных BaF3 клетки центрифугированием в 435 x g 3 мин при 4 ° C. Лизировать клетки литического буфера (250 мкл), закупорить вверх и вниз, 1 x, затем 5 минут инкубации на 80 ° C. Sonicate lysate сломать все ДНК с 5 – 6 импульсов 5 s в холодной комнате при 4 ° C.
- Передача lysate 1,5 мл трубки и центрифуги на 16000 x g 5 мин для удаления любых нерастворимый материал. Экстракт может храниться при температуре-80 ° C до использования. Образцы тепла до 80 ° C за 5 мин в блоке тепла перед загрузкой. Загрузите 10 мкл пример с помощью геля загрузки отзыв на 10% геля SDS-PAGE.
- Разрешить белков в 150 V до тех пор, пока краска ссылка достигает нижней части геля. Передать белка мембраны нитроцеллюлозы электрофоретической переводом на 1 ампер за 1 час. После передачи, блокировать мембраны в 1 x трис амортизированное saline + 0.1% 20 анимации (TBST) с 5% обезжиренное молоко для 1 h и зонд на ночь при 4 ° C с соответствующим антител при разбавлении 1:1,000.
- Вымойте мембраны 3 x 5 x 10 минут каждый; с TBST Затем зонд с ПХ конъюгированных соответствующие вторичные антитела (1:5, 000 разрежения) при комнатной температуре за 1 час. Количество используемых TBST зависит от размера контейнера. Убедитесь в том потопить мембрану в TBST полностью. Мыть вторичное антитело 3 x 5 минут с TBST.
- Разработка пятно с помощью Хемилюминесцентный субстрат реагента. Смесь равных объемов субстрат и буфер из двух бутылок, прямо перед использованием. Добавление подложки в верхней части мембраны для покрытия всего мембраны с 1 мл пипетки и инкубировать в течение 1 мин. Помарки должны отражаться в течение 1-10 мин добавления субстрата.
- Использование тупой щипцы, тщательно место мембраны на платформе системы (см. Таблицу материалы), избегая много жидкости. Выберите представление живой и выберите помарки и chemiluminiscence из меню. С помощью ручной приобретения, приобрести несколько экспозиций в разное время точках. Эти файлы могут быть визуализированы и количественно с помощью визуализации программного обеспечения.
3. поколение мышей нокаут
- Крест c-Fosfl/fl мышей с ROSACreERT2 мышей для создания ROSACreERT2c-Fosfl/fl мышей13. Чтобы создать двойной нокаут (KO) мышах, породы ROSACreERT2c-Fosfl/fl мышей с Dusp1- / - мышей для создания ROSACreERT2c-Fosfl/fl для мышей Dusp1- / - 13. Генотип мышей хвост клипы следуют ПЦР, как описано ниже.
-
Генотипирование:
- Для подготовки ДНК, клип лишь крошечная часть хвоста с ножницами и положил его в 1,5 мл трубку. Прижигание хвост с подогревом ножницами. Добавить 200 мкл 50 мм NaOH обрезанный хвост в трубе и Инкубируйте на 95 ° C в блоке тепла за 1 час.
- Вихревой трубе хорошо и, затем, нейтрализации, добавляя 50 мкл 1 М трис-HCl рН 6,8 и вихрь снова. Центрифуга трубки на максимальной скорости, за 1 мин.
- Осуществляют ГКДЗ в реакциях 20 мкл в 0,2 мл, тонкостенные трубы ПЦР с использованием 1 x Taq полимеразы мастер смесь содержащий краситель, 0,5 мкм каждого праймера, 1 мкл ДНК, и воды. Трубы в Термоциклер и запустить соответствующие циклы, как показано в таблице 2.
- Запуск продукта ПЦР на 2% агарозном геле и изображения с помощью гель системы документации.
4. изоляция c комплект+ клеток из костного мозга
- Пожертвуйте мышей согласно институциональных руководящих принципов.
Примечание: Здесь, мышей были подвержены двуокиси углерода (CO2) в соответствии с AVMA рекомендуется скорость потока до тех пор, пока смерть определяется прекращение дыхания и пульса, а затем шейки матки дислокации. - Урожай ногакости от мыши — два бедра, две tibias, два iliacs. Очистите все ткани от костей соскабливания прочь с помощью скальпеля. Положить кости ноги в холодной ПБС на льду — 5 мл в 15 мл. Залить содержимое трубки в ступке и раздавить его с пестиком.
- Фильтр суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки колпачок с 10 мл пипеткой, в приложении, с помощью пипетки. Вымойте ступку и пестик несколько раз с холодной ПБС, собирая и добавление Тюбик 50 мл суспензии клеток. Спин вниз костного мозга на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант через вакуум с стеклянной пипетки прилагается. Приостановите Пелле клеток в 5 мл с пипеткой ПБС.
- С пипеткой, медленно добавить приостановлено костного мозга в верхней части 5 мл комнатной температуры (температура критических) polysucrose, принимая большую осторожность, чтобы не нарушить интерфейс. Спина на 400 x g при комнатной температуре в течение 20 мин с тормоз выключен.
- Собирать облачно всего моно ядерных клеток (TMNC) интерфейс с пипетки и положил его в новой трубки 15 мл. Довести объем до 10 мл с ПБС для мытья, принимая 20 мкл для подсчета и спина на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и сохранить гранул на льду для шага 4.6.1.
-
Выполнения c комплект+ ячейки изоляции.
- Следовать microbead комплект протокола для c комплект+ ячейки изоляции. Ресуспензируйте Пелле клеток в 80 мкл до 107 клеток ПБС + ЭДТА BSA. Для суспензии клеток 20 мкл CD117 микрошарики/107 всего клеток. Смесь хорошо, vortexing и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Довести объем до 10 мл, добавив 1 x PBS + ЭДТА + BSA и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин.
- Удалить супернатант через вакуум и приостановить Пелле клеток в 500 мкл/108 всего клеток в однократном ПБС + ЭДТА BSA. С помощью магнита стенд с магнитной колонкой прилагается, добавить 3 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA и позволить ему течь через через гравитации в 15 мл трубку коллекции.
- После прохождения через колонку, первое дополнение буфера добавьте суспензию клеток в столбце, позволяя ей течь через через тяжести трубу 15 мл коллекции. Этот проточные является часть нежелательных клеток.
- Промойте колонку 3 раза с PBS 1 x 3 мл + ЭДТА BSA каждый раз, позволяя ей течь через через тяжести трубу коллекции. Удалите столбец из магнита и на верхней части трубки 15 мл.
- Добавьте 5 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA и немедленно промойте поршень с столбце. Удалите поршень и повторите заподлицо с еще 5 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA. Подсчитать ячейки в общем объеме с использованием стандартных методов.
- Спин вниз клетки на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в полной IMDM (IMDM + 10% FBS + ИЛ-6 [10 нг/мл] mSCF [50 нг/мл] + FLT3 лигандом [20 нг/мл] + Ил-3 [10 нг/мл]) для культуры. Культура, которую эти клетки на ночь в 2 х 106 клеток/1 мл клеток IMDM полный СМИ, поместив их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
5. трансдукция
-
Трансфекция ретровирусных плазмиды
- Свеже оттепели HEK293 клетки, днем раньше в водяной бане равным 37 ° C. Спина cryotube, содержащие клетки ГЭС на 435 x g при комнатной температуре 3 мин удалить супернатант через вакуум и приостановить Пелле клеток в 1 мл DMEM дополнена 10% FBS, пенициллин, стрептомицин и глутамина.
- Подсчитать количество ячеек и добавьте соответствующие тома 10 см лечение блюдо (~ 4 х 106 HEK293T клеток). Добавить 14 мл DMEM 10 СМИ на блюдо и перемешать хорошо, сдвинув вверх и вниз для равномерного распределения воздуха. Поместите блюдо в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора на ночь.
- На следующее утро, проверить слияния клеток под микроскопом перевернутый свет (50% или более работает хорошо).
- Объединить ДНК (желаемых ретровирусной плазмида), PclEco (упаковка плазмида), 2 M CaCl2и H20 в 1,5 мл (= 500 мкл) с использованием микропипеткой в следующих размерах: 7.5 мкг ДНК (BCR-ABL1-рекламы ЯФП), 7.5 мкг pCLeco, 62 мкл CaCl 2 M2 и вода в окончательный объем 500 мкл. добавить 500 мкл 2 x HBS к другой 1,5 мл.
- Добавление ДНК смесь каплям до 1,5 мл, содержащих 500 мкл 2 x HBS (280 мм NaCl, 100 мм HEPES и 1,5 мм Na2HPO4) во время смешивания. Добиться этого путем установки вихрь на низкой скорости и удерживайте HBS трубки на его постоянном перемешивании при добавлении трансфекции микс.
- Разрешить смесь трансфекции для инкубации для 20-30 мин при комнатной температуре. Во время инкубации добавить 25 Нм хлорохина к клеткам ГЭС и поместите их обратно в инкубаторе. После инкубации добавьте смесь трансфекции каплям ГЭС клетки и, затем, осторожно вихревой СМИ смешать трансфекции смеси по всей пластине.
- Инкубируйте клетки с смесь для ~ 8 ч при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Измените СМИ на эти клетки, очень медленно добавляя 14 мл свежего DMEM 10 средств массовой информации. Дозирование медленно к стене блюдо помогает предотвратить любые зачистки ГЭС клеток. Инкубируйте клетки на ночь в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
- Собирать вирусный супернатант с 10 мл шприц, рисовать супернатант в шприц и присоединить шприц 0,45 мкм фильтром. Окунитесь вирусный супернатант в новой коллекции трубки. Возьмите первый сборник вирусных супернатанта ~ 16 ч позже.
-
Фибронектин вирусный концентрации и трансдукция
- Добавьте 2 мл 0,1 мг рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмента в однократном ПБС в необработанной 6-ну культуры пластин. Подготовить столько фибронектин, при необходимости, которая зависит от количества клеток и генотипов. Один хорошо можно достаточно передают 10 миллионов клеток c комплект+ . Инкубировать пластину на ночь при 4 ° C.
- Следующий день, удалите фибронектин из скважины с дозатор, пипетки 2 мл стерильного 2% BSA в однократном ПБС блокировать пластину, и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Удаление BSA через вакуум и стирать тщательно дозирования 2 мл ПБС, а затем удалить его через вакуум.
- Немедленно Добавьте свеже собранных и отфильтрованных (на 0,45 мкм) вирусный супернатанта до 5 мл. Центрифуга на 435 x g 32 ° c, 2 ч. удалить супернатант через вакуум и повторить этот шаг с дополнительные свеже собранных вирусный супернатант и спина снова. Удалить супернатант через вакуум и Промыть лунки, добавив 2 мл ПБС; затем удалите его через вакуум.
- Добавьте что мышь c комплект+ клетки что культивировали ночь (шаг 4.6.6) вирусный покрытием скважины путем смешивания суспензий клеток хорошо и закупорить их в пластину вирусный концентрированной фибронектин теперь. Спина на 1200 x g при 25 ° C для 90 минут поставил клетки в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
- 48 ч posttransduction, Пелле клетки центрифугированием при 1200 x g на 4 ° C на 5 мин и Ресуспензируйте их в СУИМ буфера #1 (ПБС + 0,5% BSA) / 6 x 10-6мл. Определите процент BCR-ABL1 позитивных клеток путем измерения доля рекламы ЯФП положительных с помощью проточной цитометрии.
- Приобрести события с стандартной процедурой. Во-первых ворота живых клеток, основанные на передней и боковых разброс. Затем ворота рекламы ЯФП положительный живых клеток, за исключением рекламы ЯФП negativecells определяется отрицательного контроля (рис. 4).
6. колонии формирование UnitAssays
- Оттепель метилцеллюлоза с цитокинами для мыши при комнатной температуре на 1 – 2 ч. аликвота 3 мл метилцеллюлоза в трубу СУИМ, используя 5 мл шприц без иглы. Сортировать рекламы ЯФП положительных клеток на клетки сортировщика.
- Спиновые клетки вниз и приостановить гранулы в IMDM полной СМИ. Подсчитать ячейки быть покрытием и ослабить их получить 5000 рекламы ЯФП положительных клеток в 100 мкл IMDM полный средств массовой информации.
- 100 мкл суспензии клеток, содержащих 5000 рекламы ЯФП положительных клеток и соответствующие ингибиторы до 3 мл метилцеллюлоза (см. Таблицу материалы). Вихрь на высоких смешать его на 10 – 30 с.
- После большинства из воздуха, которые избежали пузыри используйте 1 мл шприц для пластины 1 мл СМИ в трех реплицировать 3 см пластины извлечения средств массовой информации на одной стороне и медленно наклоняя тарелку в круговое движение, чтобы равномерно.
- Конечная концентрация ингибиторов для использования являются иматиниба в 3 мкм, DFC на 0,2 мкм и BCI в 0,5 мкм, самостоятельно или в комбинации. Везде, где это уместно, удалите c-Fos покрытие клетки с 4-hydroxytamoxifen (1 мкг/мл) добавляется метилцеллюлоза.
- После обшивки, поместите пластины в большой Петри с одной открытой блюдо, содержащий 2 мл стерильной воды в середине. Обложка большой Петри блюдо тщательно и инкубировать и при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Запись колонии после одной недели число покрытий путем подсчета общее количество колоний под микроскопом.
- Анализируйте несколько колоний от соответствующие пластины для удаления c-Fos методом ПЦР. Соберите колоний, высасывая их с наконечником P1000. Выбить клетки в 500 мкл ПБС Стиральная кончик в PBS несколько раз. Спина клеточных суспензий на 6000 x g за 1 мин и извлечь ДНК клетки Пелле, с использованием геномной ДНК изоляции комплекта.
- Используйте геномной ДНК для ПЦР праймеры МФО FP3 и МФО-RP5, как описано в таблице 2. Анализ продуктов ПЦР на 2% агарозном геле и изображения с помощью гель системы документации.
- Для графического представления колоний пятно колоний, с помощью Iodonitrotetrazolium хлорид. Растворите 10 мг хлорида Iodonitrotetrazolium в 10 мл воды для получения 1 мг/мл раствора. Фильтр стерилизовать решения с помощью люэровского с 0,2 мкм фильтром прилагается к 10 мл шприц в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном.
- В культуре ткани капот добавьте 100 мкл окрашивание раствора каплям вокруг CFU плита; Будьте осторожны, чтобы не скользить или беспокоить колонии. Инкубируйте пластины на ночь в 37 ° C, 5% CO2 клетки культуры инкубатора. Колонии превратит красновато коричневый. Используя белый фон в стерильных культуры ткани капот, принимать фотографии окрашенных CFU пластины.
7. пересадка и смертности Assay
- Смертельно облучить мышей с Сплит излучения с помощью 137 Cs основе гамма излучения в дозировке 7,0 гр, следуют 4,75 гр (0,5 гр/мин), 3 h друг от друга до пересадки.
- Пересадка 4 x 104 несортированные рекламы ЯФП позитивные (рассчитывается на основе процентной доли рекламы ЯФП) клетки с 3 x 105 клеток нормального костного как перевозчик в каждой мыши через хвост вен инъекций.
- После одной недели трансплантации определите приживления, анализируя рекламы ЯФП положительных клеток в периферической крови, использование СУИМ.
-
Выполните хвост Вены кровь и анализ СУИМ.
- Теплый клетки мышей под тепла лампы с осторожностью не перегреть или сжечь их.
- Сдерживать мышь в мыши фиксатор и Ник хвост вен с стерильные лезвия. Аккуратно молока хвост от впереди кзади, позволяя капли крови накапливается. Сбор крови с гепаринизированным капиллярную трубку до тех пор, пока он наполнен (собирать вокруг 75-100 мкл). Окунуться кровь из заполненных капиллярной трубки в пробирки, содержащие ЭДТА и хорошо перемешать.
- Лизируйте RBCs, добавив 30-40 мкл крови 3 мл буфера lysis РБК 1 x (хлорид аммония 150 мм, 10 мм калия бикарбонат и 0,13 мм ЭДТА). Перемешайте, инвертирование трубке несколько раз. Инкубации при комнатной температуре на 10 – 15 мин спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант через вакуум и приостановить гранулы в 2 мл 1 x PBS для мытья.
- Спина на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и приостановить его в СУИМ буфер #1. Провести анализ СУИМ, как описано выше в шаге 5.2.5–5.2.66. Трубка краткосрочные магазин оставшихся крови в коллекции, которые могут быть использованы для различных других целей, при 4 ° C.
- Для эксперимента были использованы пересаженных мышей, которые показали 10 – 40% рекламы ЯФП положительных клеток в периферической крови. Мышей, которые были менее чем 2% рекламы ЯФП положительных клеток были исключены из исследования.
- Подготовить тамоксифен в 20 мг/мл в кукурузном масле при температуре 60 ° C с прерывистой vortexing до тех пор, пока полностью не растворится и хранить его на 4 ° C в темноте в течение лечения. После одной недели трансплантации, удалить аллеля c-Fosfl/fl путем инъекций тамоксифен (100 мг/кг в кукурузном масле) внутрибрюшинно (и.п.) в мышей, каждый день в течение трех дней подряд. Важно, что мышей взвешивают определить сколько тамоксифен придать. После лечения тамоксифен (при необходимости), группе мышей для лекарств (n = 5/группа).
- Контролировать мышей для лейкемии прогрессии и выживания и определить лейкозных бремя (рекламы ЯФП положительных клеток по СУИМ) загрузок вплоть до восьми недель в живых мышей.
- Анализ крови для удаления c-Fos везде, где это целесообразно, как описано выше в разделе 6. Записать количество живых мышей каждый день и участок кривой выживания в конце эксперимента с использованием графического программного обеспечения.
8. трансгенных мышей модель BCR-ABL1 лейкемии
-
Изоляция LSK
- Поддерживать Scl-tTA трансгенных мышей на Чоу доксициклин для предотвращения выражение BCR-ABL1. За четыре недели до трансплантации, взять мышь от доксициклин Чоу для BCR-ABL1 выражения.
- Изолируйте от трансгенных мышей Scl-tTA TMNCs, как описано выше в разделе 4. Приостановите TMNCs в СУИМ буфера #2 (ПБС + 0,5% BSA + 2 мм ЭДТА), для получения 106 клеток/мл.
- Разрушающим TMNCs для линии положительных клеток путем добавления 10 мкл линии клеток обнаружения коктейль биотин (биотина конъюгированных моноклональных антител против CD5 [крыса IgG2a], CD11b [крыса IgG2a], CD45R [B220] [крыса IgG2a], анти-7-4 [крыса IgG2a], анти-Gr-1 [Ly-6G/C, крыса IgG2a] и анти-Тер-119 [крыса IgG2b]) за 1 х 106 клеток. Инкубируйте клетки на 4 ° C, за 10 мин в темноте, следуют мыть с 5 мл СУИМ буфера #2 и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин аспирата супернатант полностью и приостановить клетки в 400 мкл СУИМ буфера #2.
- Добавьте 5 мкл концентрированного препарата конъюгата антитела анти биотин-FITC, 1.2 мкл Ly-6A/E (Sca1) PECy7 и 2.4 мкл антител CD117 (c комплект) APC для до 108 миллионов клеток. Инкубировать в темноте при комнатной температуре на 10 мин мыть путем привлечения объем до 5 мл с СУИМ буфера #2; затем центрифуги на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл СУИМ буфера #2.
- Фильтр суспензию клеток в трубку СУИМ синий фильтр Кап.
- Ворота живых клеток с помощью передней и боковых разброс. Затем выберите Линь– клетки, которые показали МФО (означают интенсивности флуоресценции менее 102) чтобы получить LSK клеток c комплект+ и Sca1+ на biexponential участок от родителя Линь– и отсортировать их (рис. 7 C).
- Собирать сортировки клеток и центрифуги их на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин.
-
Трансплантация
- Смертельно облучить BoyJ мышей с доза облучения Сплит 7,0 гр, следуют 4,75 гр через 3 ч, до пересадки.
- Придать 3 x 103 до 5 x 103 BCR-ABL1-LSK клетки с 0,3 x 106 клеток костного помощник от WT BoyJ мышей через хвост вен (и.в.) облученного BoyJ мышей.
- Четыре недели posttransplantation, анализировать получателя мышей для CD45.1 и CD45.2. Получите TMNC из периферической крови, хвост вен кровотечение, как описано в шаге 7.4. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера СУИМ. Инкубируйте клетки с 1 мкл антител CD45.1-FITC и CD45.2-PE при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Вымыть клетки, поднимая тома 3 мл с буфером СУИМ и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте в 200 мкл ПБС.
- Анализировать процент на CD45.1 и CD45.2, первые стробирования живых клеток, основанные на передней и боковых разброс, следуют стробирования FITC - и PE-положительных клеток, основанный на образце неокрашенных.
- Группа мышей на четыре группы (n = 6 для каждой группы). Начать лечение с imatinib (75 мг/кг 2 x в день) самостоятельно и в сочетании с DFC + BCI (обоих наркотиков были даны в дозе 10 мг/кг 2 x в день).
- Аналогичным образом, рассматривать другие группы с различными комбинациями imatinib (75 мг/кг) + куркумин (150 мг/кг), imatinib (75 мг/кг) + NDGA (100 мг/кг) + BCI (10 мг/кг) и BCI (10 мг/кг) за три месяца, 2 раза в день, по вводят и.п.
- Анализ мышей 1 x в месяц в течение шести месяцев для лейкозных химеризма путем определения процент CD45.2 позитивных клеток в периферической крови хвост вен кровотечение, как описано в шаге 7.4.
9. в оценке Vivo BCI и деятельности DFC
-
Анализ фосфо p38
- Возьмите три лейкозных мышей (8-12 недель), которые были пересажены с BCR-ABL1-выражая c комплект+ клетки, как описано в разделе 7. Придать мышей с BCI (10 мг/кг) путем инъекций posttransplant и.п. четыре недели.
- Измерения уровней фосфо p38 периферической крови TMNC с помощью комплекта цитометрии потока фосфорилирование согласно инструкциям поставщика. Сбор крови от каждой мыши до и 6 ч после инъекции наркотиков. Изолировать TMNCs, РБК истощения и исправить их следующим образом.
- Добавьте 4 мл раствора лизис РБК в 100 мкл периферической крови. Смешать и инкубировать на льду на 5 минут, чтобы лизировать RBCs. спин вниз клетки на 1200 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите lysis 1 x больше.
- После второго шага лизиса Вымойте клетки окатышей с 1 мл 2% BSA в PBS. Исправьте клетки путем добавления 100 мкл фиксации и permeabilization решений и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в темноте. Пелле клетки центрифугированием при 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
- Вымойте окатышей с 1 мл раствора 1 x permeabilization мыть. Заблокировать ячейки, добавив 300 мкл 2% BSA в буфере мыть permeabilization при комнатной температуре за 20 мин разделить ячейки на три равных аликвоты 100 мкл (~ 1 x106).
- Для каждого Алиготе фиксированной клеток мкл 1 всего p-38 антитела, 1 мкл антител фосфо p38 или 1 мкл изотипа IgG управления, соответственно и инкубировать на ночь при 4 ° C.
- Вымыть клетки 1 x с 5 мл 2% BSA в PBS и проинкубируйте с вторичное антитело (1 мкл Alexa Fluor-488 конъюгированных) за 1 ч при комнатной температуре. Вымыть клетки 1 x снова и приостановить их в 200 мкл ПБС.
- Приобретение данных СУИМ и анализировать их, поток cytometry анализ программного обеспечения.
- Вычесть МФО IgG управления от МФО экспериментальных образцов. Затем значения МФО фосфо p38 нормализуются со всего p-38, чтобы определить уровни фосфо p38 после инъекции BCI.
-
Анализ количественный ген выражение генов-мишеней c Фос
- Возьмите три лейкозных мышей (8-12 недель), которые были пересажены с BCR-ABL1-выражая c комплект+ клетки как описано в разделе 7. Собирать периферической крови от каждой мыши и затем вставляют мышей с 10 мг/кг каждый DFC + BCI.
- Соберите периферической крови 6 ч после инъекции наркотиков. Изолируйте TMNCs, РБК истощения, как описано выше. Пелле TMNCs и приостановить их на основе фенола литического буфера (см. Таблицу материалы).
- Провести анализ RT-ПЦР (как описано в разделе 1) для Bcl2l11, Lif и IL-6 с использованием гена специфические праймеры (показано в таблице 1).
10. долгосрочные культуры инициирование Assay клетки
Примечание: LTCIC assay была выполнена, как описано ранее25.
- Расти мыши линии клетки фибробластов MS-5 в MEMα confluency в T175 колбу культуры ткани. Trypsinize клетки, как описано выше для HEK293T. Приостановите клетки в MEMα на 2 х 106 клеток/мл. Взять 10 х 106 клеток в 50 мл Конические трубки и излучают в 80 гр. Разбавьте клетки 0,5 х 106 клеток/мл в MEMα с 10% FBS (M10) средства массовой информации. Пластина 2 мл на хорошо в пластине 12-Ну и инкубировать в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора на ночь.
- На следующий день Подготовьте гидрокортизона натрия hemisuccinate, растворяя 2,5 мг в 5 мл MEMα (1 М раствора). Фильтр стерилизуйте гидрокортизон решения с помощью 0,2 мкм фильтром шприц в биобезопасности Худ. Разбавьте гидрокортизон путем последовательного разрежения в MEM для получения решения 100 мкм. Добавьте это 250 мкл 25 мл человека долгосрочных питательной среды (HLTM) (см. Таблицу материалы) только до использования, для достижения конечной концентрации 1 мкм.
- Спин вниз CML-CD34+ и UCP3 TMNCs и приостановить их в HLTM, кратко vortexing и определить отсчеты Горяева.
- Вакуумные покинуть M10 СМИ от 12-ну пластины семенами с клетками стромы и заменить его 1 мл пациента ячейки (CML-CD34+ [10000] и UCP3 TMNCs [1 x 10-6]) подвеска в HLTM. Используйте три скважины на комбинации препарата каждого типа клеток.
- Разбавляют препараты запасов до 2 x требуемой концентрации в HLTM. Добавьте 1 mL СМИ с наркотиками в вышеупомянутых ячейки для получения 1 x концентрации наркотиков. Замените половину СМИ свежеприготовленный HLTM каждую неделю в течение пяти недель.
- В конце 6 недельного периода пробирного LTC-IC Соберите nonadherent клетки в трубку от культур. Trypsinize адэрентных клеток и объединить их с соответствующими nonadherent клеток.
- Вымыть клетки и assay для CFUs в метилцеллюлоза средних содержащие плода теленка 30% сыворотки крови, эритропоэтин (3 единиц/мл), SF (50 нг/мл) и Ил 3(20 ng/mL), Ил-6 (20 нг/мл), Г-КСФ (20 нг/мл) и гранулоцитов/макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (20 нг / mL). определить отсчеты Горяева.
- Клемная 5 x 104 клетки в три реплицирует. Заморозить вниз оставшиеся ячейки в 20% FBS и 10% ДМСО. Организуйте и пластины в большой Петри с одной открытой блюдо, содержащих воду в середине. Тщательно покрыть большие Петри и инкубировать в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора на две недели.
- Оценка колоний спустя две недели. В некоторых случаях только часть урожая является assayed для CFUs). Рассчитайте общее количество LTCIC в суспензии первоначальных клеток путем экстраполяции на основе CFUs, полученные от части урожая ячейки. Средний выход кое за LTC-IC — 8.
Примечание: Например если первоначально 1 х 106 клеток были покрытием в колодец, после пяти недель, 0,5 х 106 клеток были собраны, для ГРУ, 5 x 104 клетки были покрытием и 50 CFUs были получены. Это равняется 500 CFUs/1 миллион клеток покрытием. Разделите это число на 8, чтобы получить LTCIC, который является 62,5.
11. гуманизированные модель мыши, с помощью CML CD34 клетки+
- Sublethally облучить 8 week-old NOD scid гамма мышей, выражая человеческого уровня IL3, ГМ-КСФ и ФСД (NSGS), с одной дозы 7,0 гр (700 заявках) с 50 заявках/мин.
- Придать 3 х 106 CD34+ выбираются ячейки от CML BCR-ABL1-положительных больных хронической фазы в облученных мышей внутривенные инъекции.
- После двух недель после трансплантации определите лейкозных приживления в костном мозге, с помощью мыши и человека-антитела против CD45 СУИМ.
-
Выполните анализ СУИМ.
- Возьмите аспирата костного мозга от бедра пересаженных мышей. Лизировать RBCs, с использованием буфера lysis РБК, как описано выше и собирать TMNCs центрифугированием. Помыть лепешка 1 x с холодной ПБС.
- Заблокировать ячейки с человека FcR блока и мыши FcR следуют окрашивание с антинародным CD45 FITC и анти мыши CD45 APCCy7 на ночь при 4 ° C. Выполнить анализ СУИМ на LSRII и анализа данных, используя поток cytometry анализ программного обеспечения.
- Группа мышей в четырех различных когорт (n = 6/группа) для лечения с транспортного средства, imatinib (75 мг/кг), DFC + BCI (как на 10 мг/кг), или imatinib (75 мг/кг) + DFC BCI (как на 10 мг/кг). Разбавить запасов лекарств в однократном ПБС (автомобиль) и управлять ими путем инъекций их и.п. 2 x в день.
- Лечить мышей в течение шести недель и определить лейкозных бремя каждые две недели, до 8 недели после трансплантации, как описано выше в 11,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Терапевтическая эффективность TKIs были причастны онкогена наркомании. Однако механизмы, вождение онкогена зависимость не понятны. Мы провели несколько беспристрастной ген выражение анализа для идентификации генетический компонент, участвующих в оркеструя наркомании. Эти анализы показали upregulation трех генов, c Фос, Dusp1 и Zfp36, в раковых клетках, которые не зависят от онкогенные сигнальные для выживания и, таким образом, не чувствительны к лечению тки. Даунрегуляция c-Fos и Dusp1, индуцируемый опосредованной нокдаун достаточно для восстановления лекарственной чувствительности в противном случае тки устойчивостью клеток.
Для проверки роли c-Fos и Dusp1 качестве терапевтической цели в лейкоз, их гиперэкспрессия впервые было подтверждено с помощью BaF3 клетки, выражая BCR-ABL1 онкогена. Фактор роста, сигнализации в клетках BaF3-BA аннулирует онкогена зависимость; как следствие они не отвечают на лечение тки. Анализ количественных выражения RT-ПЦР и Западный blotting подтвердил, что c-Fos и Dusp1 индуцированных BCR-ABL1 и их выражение далее увеличивается на коэффициент роста Ил-3 (Рисунок 1A - 1 C).
Для изучения роли c-Fos и Dusp1 в естественных условиях, мышей, не хватает c Фос (условное мыши модель c-Fosfl/fl с Rosa26-CreERT2) или Dusp1 (прямо ко Dusp1- / -) и мышей, не хватает c-Fos и Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) были разработаны. Эти мыши были генотипируемого методом ПЦР с использованием геномной ДНК из хвоста, и ПЦР легко отличить c-Fosfl/fl, Dusp1 KO от WT мышей (рисA). Индуцированная исключение c-Fos тамоксифен лечения была подтверждена методом ПЦР, внешний вид группы, по сравнению с не группы мышей, не получавших тамоксифен (рис. 2B).
Для проверки роли c-Fos и Dusp1, клетки костного мозга, полученных c комплект+ от WT, Dusp1- / -, c-Fosfl/fl, и Dusp1- / -/c-Fos-fl/fl были изолированы и преобразованы с MSCV-BCR-ABL1-Ires-рекламы ЯФП ретровирусы; Схема процедуры показан на рисунке 3. Для дальнейшего в пробирке (CFU) и в естественных условиях анализов рекламы ЯФП+ выражения (используется в качестве суррогатной маркера для BCR-ABL1 выражение) были отсортированы СУИМ (рис. 4). Результаты показывают, что исключение c-Fos и Dusp1 только препятствует CFU чисел (< 50%). Интересно, что клетки не хватает c-Fos и Dusp1 были значительно скомпрометированы их колонии формирование способности и иматиниб лечения уничтожили все CFUs, предполагая, что потеря c-Fos и Dusp1 синтетически смертоносных BCR-ABL1 выражение (Рисунок 5 ).
В пробирке CFU анализы позволяют исследователям быстро проверить фенотип KO и деятельности малых молекул ингибиторов. Однако далее в естественных условиях анализ подтвердит обоснованность целей. Для проверки в естественных условиях мы впервые использовали быстрый трансдукции трансплантации модель1 где BCR-ABL1 причин смертности в течение двух-трех недель. Пятьдесят тысяч рекламы ЯФП положительных клеток, наряду с 300 000 – 500 000 костного мозга-производные мононуклеарных клеток от обычной мыши, вводили в смертельно облученного мышей, чтобы стимулировать участие Мышей, перевозящих c-Fosfl/fl клетки или клетки- / - c-Fosfl/flDusp1 вводили тамоксифен после 10 дней трансплантации для удаления c Фос. Мышей, которые получили WT или Dusp1- / - клеток разработаны лейкемии и поддался смерти в течение двух-четырех недель, в то время как исключения c-Fos только показал значительные задержки развития болезни и лечения тки, спас от смерти почти 50% мышей. Интересно мышей, пересаженные с ячейками, не хватает c-Fos и Dusp1 выжил дольше, и лечение тки вылечить всех мышей CML (рис. 6A - 6 C). Мышей, которые выжили постепенно потерял рекламы ЯФП+ клетки, как показано в c-Fos и двойной KO, когда лечение с imatinib (рис. 6 d-6F), предлагая разминирования BCR-ABL1 позитивных клеток.
Учитывая, что CML это заболевание стволовых клеток, и учитывая неспособность ретровирусы для примитивных и покоя гемопоэтических клеток, важно проверить ли ориентированные на c-Fos и Dusp1 будет достаточно для ликвидации лейкозных стволовых клеток. Тетрациклин индуцибельной BCR-ABL1 трансгенных мышей где tTA выражается Scl усилитель, который конкретно выражается в гемопоэтических стволовых клеток, были ранее использованы для изучения роли целевых генов в LSCs. Тетрациклин индуцибельной BCR-ABL1 трансгенных мышей (рис. 7A-7B) были использованы для изучения роли c-Fos и Dusp1 в LSCs. LSK клетки от этих мышей были отсортированы с помощью СУИМ и вводят в получателя мышей (рис. 7C). После одного месяца трансплантации лейкозных приживления забил, следуют медикаментозное лечение. Каждый месяц в течение шести месяцев были определены лейкозных бремя и уровни LSK. Мышей с imatinib одиночку показал подавления лейкемии, но остались с моб. Таким образом прекращение лечения, как отмечено в клинике, привели к рецидив болезни. В отличие от мышей лечение с помощью комбинации препаратов иматиниб + DFC (c-Fos ингибитор) + BCI (ингибитор Dusp1) полностью искоренить лейкозных клеток, и мышей были вылечены от ХМЛ (рис. 7 d и 7е).
Учредить Фармако динамические считывания для c-Fos и Dusp1 ингибиторы и изучение их на цель эффект, фосфо p38 уровни (суррогатной маркер для ингибирования Dusp1) были измерены и выражение c-Fos регулируется генов, например, Ил-6, bcl2l11 и Lif, была оценена количественно. Мы и другие установили, что ингибирование Dusp1 приводит к активации p38 (измеряется увеличение фосфорилирование p38)13. Phospo-p38 уровни были измерены по СУИМ в целом кровяные клетки изолированы от наркотиков лечение мышей. Как и ожидалось, фосфо p38 уровней увеличилась (рисA) и выражение c-Fos регулируется генов (IL-6, bcl2l11 и Lif) были downregulated в мышах наркотики лечение (Рисунок 8B). Эти результаты показывают, что ингибиторы подавлять их цель и выживаемости мышей связано с ингибированием c-Fos и Dusp1.
Для человека актуальность эффективность c-Fos и Dusp1 ингибиторы были протестированы с использованием пациентов образцов в пробирке (LTC-IC) и в естественных условиях анализов (ксенотрасплантатов мыши). Лечение с DFC + BCI не является эффективным на лейкозных стволовых клеток. Однако сочетание DFC + BCI иматиниб выборочно искоренить лейкозных стволовых клеток в обоих анализов во время резервирования нормальные стволовые клетки (рис. 9A - 9 C). Эти результаты установить, что c-Fos и Dusp1 необходимы для лейкозных преобразования, и повышенной экспрессии этих генов аннулирует онкогена зависимость приводит к рецидиву заболевания и лекарственной устойчивости. Таким образом комбинаторные ориентации c-Fos и Dusp1 вместе с онкогена драйвер будет более эффективной и, возможно, лечебной стратегией для многих раковых заболеваний. Мы ожидаем, что описанные здесь методы как правило может применяться для идентификации дополнительные цели и проверки.
Рисунок 1 : c-Fos и Dusp1 оверэкспрессировали в ответ на фактор роста Ил-3. ПЦР анализ гиперэкспрессия c Фос (A) и (B) Dusp1 в клетках cytokine лечение BaF3-ба. Относительные выражения был определен после нормализации β-актина. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех реплицировать образцов. (C) Западный анализ помаркой клеток BaF3-BA относились с Ил-3 и исследован с c ФОС Итого или P-c-Fos и Dusp1 антител. Антитела против актина был использован как загрузки элемента управления. Эта цифра была адаптирована с разрешения Kesarwani et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Генотипирования c-Fosfl/flDusp1 и Роза cre-ER мышей. (A) ПЦР анализ ДНК хвост. Ожидаемые диапазоны от WT или c-Fosfl/fl-CreER трансген и Dusp1 KO мышей. Группа размеры указаны на левой стороне. (B) ПЦР анализ меньшие группы после удаления c ПКС с тамоксифен лечения. M = 1 КБ + лестница ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Схематические модели трансдукция и трансплантация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : СУИМ, показаны частоты рекламы ЯФП+ клеток из крови пересаженные и WT мышь (отрицательный контроль). Верхней панели показывают точечная клеток и стробирования. Нижней панели показывают гистограммы рекламы ЯФП против точечной стороне. Клетки с МФО по > 103 рассматривались рекламы ЯФП +. Подобные стробирования был использован для клеток костного мозга после трансдукции для расчета процент трансдукции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель пластины от обшивки CFU. Пластины показывают колонии витражные с iodonitrotetrazolium хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : c-Fos и Dusp1 недостатки подрывают развитие лейкемии. (A-C) Кривых выживания мышей, пересаженные с c комплект+ BCR-ABL1 клетки от WT, Dusp1- / -c-Fos- / -и c-Fos- / - Dusp1- / - мышей. (D-E) Процент рекламы ЯФП + клеток определяется СУИМ в периферической крови мышей, пересаженные обращается posttransplant каждую неделю. Повышения уровня рекламы ЯФП и мышей поддался смерти как WT и ко Dusp1. Мышей, которые постепенно выжить потерять рекламы ЯФП+ клетки, как показано в c-Fos и двойной KO, когда лечение с imatinib. Эта цифра была адаптирована с разрешения Kesarwani . и др. 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : c-Fos и Dusp1 необходимы для выживания LSCs. (A) схема трансген, используется у трансгенных мышей, выражая BCR-ABL1 в стволовых клеток. (B) экспериментальный дизайн для изучения последствий Dusp1 и c-Fos ингибирование DFC и BCI in vivo. (C) СУИМ участков качели стробирования стратегии, используемые для сортировки LSK клеток для трансплантации. (D) процент положительных клеток BCR-ABL1 (определяется процент CD45.2 от доноров мышей) мышей во время и лечения ингибиторами. (E) СУИМ точечные показаны CD45 химеризма живых клеток, а также в отсеке клеток LSK. Пожалуйста, обратите внимание на отсутствие CD45.2 в целом и в отсеке LSK в обработанных мышей. Эта цифра была адаптирована с разрешения Kesarwani et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: In vivo активности DFC и BCI. (A) линия графике показаны уровни фосфо p38 после лечения BCI. (B) RT-ПЦР показаны выражение c-Fos целевых генов в периферической крови мышей после лечения DFC. Точки представляют три реплицирует от каждой мыши (n = 3). Номер выше диаграммы представляют p-значение рассчитывается путем студента t-теста. Эта цифра была адаптирована с разрешения Kesarwani et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Роль c-Fos и DUSP1 ингибирования в пробе больного человека. CFUs (A) доля определяется assay LTC-IC от двух CML больных и здоровых доноров, относились с транспортного средства или комбинации указанных препаратов. (Б) процент человека лейкозных клеток (hCD45) костного мозга мышей NSGS на 2 недели (слева) и неделя 4 (справа) лечения. (C) Эта группа показывает представитель участки СУИМ, показывая резкое сокращение клеток hCD45 в мышах обработанных наркотиков когда щадящие мыши клетки, как mCD45. Эта цифра была адаптирована с разрешения Kesarwani et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для подавляющего большинства раковых клеток терапевтический ответ тки опосредовано блокаду тирозин киназы онкопротеин сигналов, к которым пристрастилась опухоли. Однако относительно мало известно о как меньшинство раковых клеток, способствуя MRD избежать онкогена зависимость и терапии4. Недавние исследования показали, что фактор роста сигнализации опосредует лекарственной устойчивости в лейкоз и твердых органа опухоли. Это свидетельствует о том, что различные молекулярные механизмы могут лежат в основе внутреннего сопротивления10,,1112. Чтобы понять механизм и определить цели гена для терапевтических развития, мы провели всестороннее выражение целое геном профили с помощью мыши (BaF3) и клеток человека (K562). Первичные пробы из лейкозных мышей или CML пациентов не были использованы, потому что мы подозревали, что, как значительно разнородных первичных костного образцы, они будут маска личности соответствующих генов/целей. Даже клетки, очищенные антитела опосредованной сортировки (стволовых клеток-предшественников) демонстрируют значительную гетерогенность. Таким образом очищенный клеточная линия, вероятно лучше подходит для идентификации цели избежать каких-либо нежелательных сложности, введенных генетической гетерогенностью. Анализ состава геном выражения определены, c Фос, Dusp1 и Zfp36, часто upregulated в лекарственно-клеток. После того, как определены цели, их проверки становится критической частью признать их роль в данном контексте генетические. С помощью гиперэкспрессия cDNA и генетические исследования нокдаун в BaF3 клетках показал, что ингибирование c-Fos и Dusp1 достаточные и необходимые для эффективного тки чувствительность. Возможно один из наиболее важных шагов в целевой проверки является для проверки значимости выявленных генов/целей в первичные пробы от мыши и человека. В этом протоколе мы предоставляем шаг за шагом использования нескольких генетической модели и предоставляют более механистических идей для дальнейшего уточнения наркотиков/цель оценки.
Быстрый скрининг на клеточном уровне, используя CFUs или LTCIC assay помогает исследователям для тестирования нескольких комбинации препаратов, а также концентрации, быстро перед переходом к более длительным трансплантации методам. Учитывая, что CML это заболевание стволовых клеток, и учитывая неспособность ретровирусы для примитивных и покоя гемопоэтических клеток, необходимо проверить с помощью моделей, которые непосредственно касаются их роль в выживании LSC. Для решения этой проблемы, мы использовали тетрациклин индуцибельной BCR-ABL трансгенные мыши где tTA выражается Scl усилитель. Тем не менее генетической модели являются несовершенными в перечислении болезней человека. Таким образом это необходимо для тестирования первичных пациентов образцов в гуманизированные мыши модели. Однако, чтобы иметь возможность делать долгосрочное исследование для выявления MRD со временем, стабильной ксенотрансплантата требуется, в зависимости от мышей и ячейка типы, могут отличаться. После четырех месяцев трансплантации даже без лечения наркомании, который является ограничение в наиболее гуманизированные мыши модели были истощены CD34 + клетки человека. Более гуманизированные мыши модели в настоящее время разрабатываются для тестирования клетки человека в26мышей. Мы настоятельно рекомендуем, определение на целевого действия ингибиторов, как любой пробить эффект может привести к токсичности для нормальных клеток, ограничивая его дальнейшего применения. Однако если цель вниз по течению не известна, следует использовать различные подходы. Например выявление лекарственно-мутантов, используя случайные мутагенеза целевого белка может непосредственно обратиться ли ингибитор целевой27.
Протокол, представленные здесь предоставляет всеобъемлющий метод для идентификации цели и проверки с использованием нескольких систем модели in vitro и in vivo . Эти методы могут быть легко адаптированы для других целей и типов рака. Кроме того механистический исследования определены цели и уточнения в отношении наркотиков может помочь в разработке эффективных и/или лечебной лечение лучше терапевтических методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарны G. Q. Дейли для обеспечения BaF3 и WEHI клеток и т. Рея для MSCV-BCR-ABL-Ires-рекламы ЯФП конструкций. Авторы благодарны м. Кэрролл для предоставления пациентов образцов из кризиса CML взрыва. Это исследование было поддержано грантов для м.а. от NCI (1RO1CA155091), лейкемии исследовательский фонд и Фонд V и от NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
