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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.

Abstract

La demostración de inhibidores de la cinasa de la tirosina (ITC) en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC) ha anunciado una nueva era en la terapéutica del cáncer. Sin embargo, una pequeña población de células no responden al tratamiento de TKI, dando por resultado la enfermedad residual mínima (Milirutherford); incluso los más potentes ITC no erradicar estas células. Estas células MRD sirven como reservorio para el desarrollo de resistencia a la terapia. No se sabe por qué tratamiento TKI es ineficaz contra las células de la MRD. Señalización del factor de crecimiento está implicado en el apoyo a la supervivencia de las células de la MRD durante el tratamiento de TKI, pero carece de una comprensión mecanicista. Estudios recientes demostraron que una elevada de c-Fos y expresión de Dusp1 como resultado convergente oncogénico y factor de crecimiento en las células de la MRD median resistencia TKI. La inhibición genética y química de c-Fos y Dusp1 hace CML exquisitamente sensible a la ITC y cura la leucemia mielógena crónica en ambos modelos de ratón humanizado y genética. Se identificaron estos genes diana mediante microarrays múltiples de TKI-sensible y - células resistentes. Aquí, ofrecemos métodos para la validación de la blanco usando modelos de ratón in vitro e in vivo. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a cualquier destino para validación genética y desarrollo terapéutico.

Introduction

Actividad de la cinasa de tirosina constitutiva del oncogene de fusión BCR-ABL1 causa CML, que proporciona un fundamento para orientar la actividad quinasa por inhibidores de molécula pequeña. El éxito de ITC en el tratamiento de pacientes con LMC revolucionó el concepto de terapia dirigida1,2. Posteriormente, la terapia anti-cinasa como medicina de precisión fue desarrollada para varias otras malignidades, incluyendo tumores sólidos. Hasta ahora, más de treinta los inhibidores de la quinasa han sido aprobados por la FDA de Estado Unidos para el tratamiento de diversos tumores malignos. Tratamiento de TKI es muy eficaz en la supresión de la enfermedad, no es curativa. Además, persiste una población pequeña de células de cáncer durante el tratamiento: la MRD3,4,5. Incluso los pacientes que mostraron remisión completa quedan con MRD, que eventualmente suprimidos resultados en recaída si no continuamente. Por lo tanto, la erradicación de las células MRD es necesario para lograr una respuesta durable o curativa. CML representa un valioso paradigma para definir el concepto de la medicina de precisión, mecanismos de oncogénesis, rational therapeutics dirigido por el destino, progresión de la enfermedad y resistencia a los medicamentos. Sin embargo, aún hoy, el mecanismo de muerte celular inducida por TKI de conducción en las células cancerosas no se entiende completamente, ni por qué las células MRD (formadas por células leucémicas [LSCs]) son intrínsecamente resistentes a ITC4,6. Sin embargo, el fenómeno de la «dependencia oncogene» a quinasa mutante oncoproteína está implicado en la eficacia TKI donde la inhibición aguda de oncogén dirigida por ITC causa un choque oncogénico que conduce a una respuesta masiva proapoptóticas o quietud en celda manera dependiente del contexto6,7,8,9. Sin embargo, carece de la base mecanicista de la dependencia del oncogene. Estudios recientes han implicado que el factor de crecimiento señalización abroga dependencia oncogene y por lo tanto confiere resistencia a TKI terapia10,11,12. Por lo tanto, para ganar la penetración en el mecanismo de la dependencia del oncogene, realizamos perfiles de expresión de todo el genoma de BCR-ABL1 adicto y células infecciosa (crecidas con factores de crecimiento), que reveló que el c-Fos y Dusp1 son importantes mediadores de la de adicción oncogén13. La canceladura genética de c-Fos y Dusp1 es células letales BCR-ABL1-expresión sintéticas y los ratones utilizados en el experimento no se desarrolló leucemia. Por otra parte, la inhibición de c-Fos y DUSP1 por inhibidores de molécula pequeña había curada LMC BCR-ABL1-inducida en ratones. Los resultados muestran que los niveles de expresión de c-Fos y Dusp1 definen el umbral de la apoptosis en las células cancerosas, que niveles más bajos confieren sensibilidad de drogas mientras que niveles superiores causan resistencia a la terapia13.

Para identificar los genes conduce a la dependencia del oncogene, realizamos la expresión de todo el genoma varios perfiles experimentos en presencia de factor de crecimiento y un TKI (imatinib) usando ratón y células derivadas del paciente de leucemia mielógena crónica (K562). Estos datos fueron analizados en paralelo con conjuntos de datos paciente de CML de CD34+ las células madre hematopoyéticas antes y después del tratamiento con imatinib. Este análisis reveló tres genes (un factor de transcripción [c-Fos], fosfatasa de especificidad dual 1 [Dusp1] y una proteína de unión a RNA [Zfp36]) que comúnmente son upregulated en las células resistentes a TKI. Para validar la importancia de estos genes que confieren resistencia a los medicamentos, llevamos a cabo análisis in vitro e in vivo paso a paso. Los niveles de expresión de estos genes fueron confirmados por qPCR en tiempo real (RT-qPCR) y western blot en células resistentes a los medicamentos. Además, la sobreexpresión de cDNA y caída por shRNA horquillas de c-Fos, Dusp1, y Zfp36 reveló que elevados de c-Fos y expresiones Dusp1 son suficientes y necesarias para conferir resistencia a TKI. Por lo tanto, se realizó una validación in vivo con modelos de ratón c-Fos y Dusp1 solamente. Para la validación genética del c-Fos y Dusp1, hemos creado ROSACreERT inducible de c-Fosfl/fl ratones (condicional knockout)14 y cruzó con Dusp1- / - (eliminatorias recta)15 para hacer ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - ratones transgénicos doble. Las células de la médula ósea c-Kit+ (de c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- y c-Fosfl/flDusp1- / -) expresan BCR-ABL1 fueron analizados en vitro en una prueba de unidad (UFC) formadoras de colonias y en vivo por el trasplante de médula ósea en ratones irradiados letalmente, a probar el requisito de c-Fos y Dusp1 solos o juntos en el desarrollo de leucemia. Asimismo, las inhibiciones químicas de c-Fos por DFC (difluorados curcumina)16 y Dusp1 por BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 fueron probados in vitro e in vivo utilizando BCR-ABL1-expresando, hueso células derivadas de la médula c-Kit+ del ratón de tipo salvaje (WT). Para confirmar la exigencia de c-Fos y Dusp1 en células leucémicas, se utilizó un modelo de ratón de LMC donde BCR-ABL1 específicamente fue inducida en las células de sus madre por doxiciclina (expresa Tet transactivator bajo células murino leucemia (SCL) gen 3' potenciador Reglamento)18,19. Utiliza la médula ósea Lin–c-Kit de Sca++ (LSK) las células de estos ratones en un ensayo de trasplante in vivo. Además, establecimos los niveles de phopsho-p38 y la expresión de IL-6 como biomarcadores de fármaco-dinámico para Dusp1 y la inhibición de c-Fos, respectivamente, en vivo. Por último, ampliar el estudio de relevancia humana, derivados del paciente CD34+ las células (equivalente a las células c-Kit+ de los ratones) fueron sometidas a largo plazo ensayos in vitro inicio de cultivo celular (LTCIC) y un modelo de ratón humanizado en vivo de CML20,21. Los ratones inmunodeficientes fueron trasplantados con células de CML CD34 +, seguidas de tratamiento y análisis de la supervivencia de células leucémicas humanas.

En este proyecto, desarrollamos métodos para la identificación de objetivos y validaciones usando herramientas genéticas y químicas, utilizando diferentes modelos preclínicos. Estos métodos pueden aplicarse con éxito para validar otros objetivos desarrollar modalidades de química para el desarrollo terapéutico.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según los lineamientos de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el centro médico Hospital infantil de Cincinnati (CCHMC). Especímenes humanos (Normal BM y eso de CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) se obtuvieron a través de protocolos aprobados por la Junta de revisión institucional (institucional Review Board: Hospital Medical Center Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati infantil) y consentimiento informado donantes de CCHMC y la Universidad de Cincinnati.

1. en tiempo real qPCR análisis

  1. Aislar el ARN total de BaF3 células en RPMI suplementado con 10% FBS y 10% WEHI pasó medio de cultivo como fuente de interleucina-3 (IL-3).
  2. Cosecha de las células en fase logarítmica (99% de vida) de tratados (IL-3 y imatinib) así como de las muestras sin tratar y centrifugar a 435 x g durante 3 minutos. La salud y las etapas de crecimiento de las células son críticas como sus perfiles de expresión génica pueden cambiar dramáticamente.
  3. Aislar RNA purificación de RNA total22. Cuantificar el ARN total; Luego, someterla a la ADNasa tratamiento23. Convertir cantidades iguales de ARN ADN libre (2 μg) a cDNA con transcriptasa inversa24.
  4. Realizar qPCRs con los cebadores específicos del gen (tabla 1). Realizar PCRs en 20 reacciones μl 0.2 mL, tubos de PCR de paredes delgadas con óptico, usando una polimerasa 1 x mezclan (véase Tabla de materiales), 0,5 μm de cada primer, 1 μl de ADN y el agua. Lugar la reacción en el termociclador con el siguiente ciclo: paso 1, 95 ° C por 10 min; Paso 2, 95 ° C por 15 s; Paso 3 a 60 ° C por 1 min; Paso 4, repita los pasos 2 – 3 veces 40. Realizar PCRs todos en triplicado y normalizar los datos en tiempo real a la expresión de β-actina antes de trazar.

2. Western Blotting

Nota: Se prepararon extractos celulares mediante la adición de 250 μl de 1 x de tampón de lisis tal como se describe en Kesarwani et al.13 complementado con un inhibidor de la proteasa cóctel y un inhibidor de la fosfatasa 2 cóctel.

  1. Cosecha de 5 millones de BaF3 de células en fase logarítmica (99% de vida) de tratados (IL-3 y imatinib) así como de BaF3 no tratados las células por centrifugación a 435 x g durante 3 min a 4 ° C. Lyse las células en el buffer de lisis (250 μL) mediante pipeteo arriba y abajo 1 x, seguido por una incubación de 5 minutos a 80 ° C. Someter a ultrasonidos el lisado para romper todo el ADN con pulsos de 5-6 de 5 s en un cuarto frío a 4 ° C.
  2. Transferir el lisado a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 16.000 x g durante 5 min eliminar cualquier material insoluble. El extracto se puede almacenar a-80 ° C hasta su uso. Muestras de calor a 80 ° C por 5 min en un bloque de calor antes de cargar. Cargar 10 μl de la muestra utilizando un gel-cargamento en gel SDS-PAGE al 10%.
  3. Resolver las proteínas a 150 V hasta que el tinte de referencia alcanza la parte inferior del gel. La proteína de transferencia a membranas de nitrocelulosa por una transferencia electroforética a 1 amperio durante 1 hora. Después de la transferencia, bloquear las membranas en 1 x solución salina con tampón Tris + 0,1% Tween 20 (TBST) con 5% leche descremada de 1 h y la sonda durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos correspondientes a una dilución de 1:1,000.
  4. Lavar las membranas 3 x a 5 x con TBST durante 10 minutos cada uno; entonces, probe con un anticuerpo conjugado con HRP apropiado secundario (1:5, 000 dilución) a temperatura ambiente durante 1 hora. La cantidad de TBST utilizado depende del tamaño de envase. Asegúrese de que al sumergir la membrana en TBST completamente. Lavar el anticuerpo secundario 3 x 5 min con TBST.
  5. Desarrollo de la mancha blanca /negra usando reactivo sustrato quimioluminiscente. Mezclar volúmenes iguales de sustrato y el buffer de las dos botellas, justo antes del uso. Añadir el sustrato a la parte superior de la membrana que cubre la membrana entera con una pipeta de 1 mL e incubar durante 1 minuto. La bienvenida debe ser reflejada dentro de 1 a 10 min de la adición del sustrato.
  6. Utilizando fórceps romos, coloque cuidadosamente la membrana sobre la plataforma del sistema de proyección de imagen (véase Tabla de materiales), evitando gran parte del líquido. Seleccione una vista en vivo y elija lacras y por quimioluminiscencia en el menú. Usando el manual adquisición, adquirir múltiples exposiciones en diferentes puntos temporales. Estos archivos pueden visualizarse y cuantificaron utilizando el software de imágenes.

3. generación de ratones Knockout

  1. Cruz de c-Fosfl/fl ratones ROSACreERT2 ratones para generar ROSACreERT2c-Fosfl/fl ratones13. Para crear los ratones de doble nocaut (KO), se crían ratones defl/fl ROSACreERT2c-Fos con Dusp1- / - ratones para generar ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - ratones13. Genotipo de los ratones por los clips de cola seguido por PCR, como se describe a continuación.
  2. Genotipado:
    1. Para preparar el ADN, clip una pequeña porción de la cola con las tijeras y poner en un tubo de 1,5 mL. Cauterizar la cola con tijeras calientes. Añadir 200 μL de NaOH de 50 mM a la cola recortada en el tubo e incubar a 95 ° C en un bloque de calor durante 1 hora.
    2. Vórtice del tubo bien y, a continuación, neutralizar agregando 50 μl de 1 M Tris HCl, pH 6.8 y agitar nuevamente. Centrifugar el tubo a máxima velocidad durante 1 minuto.
    3. Realizar PCRs en 20 μl reacciones 0,2 mL, tubos PCR de paredes delgadas con 1 x Taq polimerasa master mix que contiene tinte, 0,5 μm de cada primer, 1 μl de ADN y el agua. Colocar los tubos en el termociclador y ejecute los ciclos apropiados como se muestra en la tabla 2.
    4. Ejecutar el producto PCR en gel de agarosa al 2% y la imagen mediante un sistema de documentación de gel.

4. aislamiento de células c-Kit+ de médula ósea

  1. Sacrificar a los ratones según las directrices.
    Nota: Aquí, los ratones fueron expuestos a dióxido de carbono (CO2) en un acuerdo a la AVMA recomendada caudal hasta que la muerte fue determinada por el cese de la respiración y del latido del corazón, seguido por dislocación cervical.
  2. Cosecha de la piernahuesos de ratón, dos fémures, dos tibias, dos iliacs. Limpiar todos los tejidos de los huesos por raspado con un escalpelo. Poner los huesos de la pierna en PBS 1 x frío en hielo: 5 mL en un tubo de 15 mL. Verter el contenido del tubo en un mortero y machacar con un mortero.
  3. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de tapón de rosca 50 mL con una pipeta de 10 mL coloca, utilizando una pipeta. Lavar el mortero y Maja varias veces con PBS 1 x frío, recolección y adición de suspensión de células en el tubo de 50 mL. Desactivación de la médula a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, eliminar el sobrenadante por vacío con una pipeta de vidrio conectado. Suspender el precipitado de células en 5 mL de 1 x PBS con una pipeta.
  4. Con una pipeta, añada lentamente suspendido de la médula en la parte superior de 5 mL de temperatura ambiente (la temperatura es crítico) polysucrose, teniendo mucho cuidado de no molestar a la interfaz. Vuelta a 400 x g durante 20 min con el freno desactivado.
  5. Recopilar la interfaz celular mono nuclear total nublado (TMNC) con una pipeta y ponerlo en un nuevo tubo de 15 mL. Llevar el volumen a 10 mL 1 x PBS para el lavado, teniendo 20 μl para contar y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y guardar el precipitado en el hielo para paso 4.6.1.
  6. C-Kit+ de realizar aislamiento de la célula.
    1. Seguir un protocolo de kit del microbead para c-Kit+ célula de aislamiento. Resuspender el precipitado de células en 80 μl de PBS 1 x + EDTA + BSA 107 células. A la suspensión de células, añadir 20 μl de células totales de CD117 MicroBeads/107 . Mezclar por Vortex e incubar 10 min a 4 ° C. Llevar el volumen hasta 10 mL mediante la adición de 1 x PBS + EDTA + BSA y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
    2. Eliminar el sobrenadante por vacío y suspender el precipitado de células en 500 μl/108 total células en PBS 1 x + EDTA + BSA. El soporte de imán con la columna magnética conectada, añadir 3 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA y deje que fluya por gravedad en un tubo de colección de 15 mL.
    3. Una vez terminada la primera adición de tampón pasa por la columna, agregar la suspensión de células a la columna, permitiendo que fluya a través de la gravedad en el tubo de la colección de 15 mL. Este flujo es la fracción de células no deseadas.
    4. Lavar la columna 3 veces con 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA cada vez, permitiendo que fluya por gravedad en el tubo de colección. Retire la columna del imán y colocar en la parte superior de un tubo de 15 mL.
    5. Añadir 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA y lavarlo inmediatamente con el émbolo con la columna. Retire el émbolo y repita la ras con un adicional 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA. Contar las células en el volumen total utilizando métodos estándar.
    6. Desactivación de las células a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en IMDM completa (IMDM 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] ligando FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) de la cultura. Cultura que estas células durante la noche en 2 x 106 células/1 mL de células IMDM completa los medios de comunicación, colocando en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.

5. transducción de señales

  1. Transfección del plásmido retroviral
    1. Recién descongelar las células HEK293 establece la tarde antes en un baño de agua a 37 ° C. Girar el criotubo que contiene las células HEK 435 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante por vacío y suspender el precipitado de células en 1 mL de DMEM suplementado con 10% FBS, glutamina, penicilina y estreptomicina.
    2. Contar las células y añadir el volumen adecuado a un plato de 10 cm tratado (~ 4 x 106 HEK293T células). Añadir 14 mL de DMEM 10 medios de comunicación en el plato y se mezcla bien deslizando hacia arriba y hacia abajo para una distribución equitativa. Coloque el plato en un 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante la noche.
    3. En la mañana siguiente, verificar la confluencia de las células bajo un microscopio de luz invertida (50% o más funciona bien).
    4. Combinar el ADN (plásmido retroviral deseado), PclEco (plásmido de embalaje), CaCl 2 M2y H20 en un tubo de 1,5 mL (= 500 μl) con una micropipeta en las siguientes cantidades: 7,5 μg de DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg de pCLeco, 62 μl de 2 M de CaCl2 y el agua hasta un volumen final de 500 μl. Agregar 500 μl de 2 x HBS a otro tubo de 1,5 mL.
    5. Añadir el ADN mezcla gota a gota en el tubo de 1,5 mL conteniendo 500 μl de 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES y 1,5 mM de Na2HPO4) mientras se mezcla. Lograrlo mediante el establecimiento de un vórtice a la velocidad más baja, sostenga el tubo de HBS en él para la constante mezcla añadiendo la mezcla de transfección.
    6. Deje que la mezcla de transfección a incubar durante 20-30 min a temperatura ambiente. Durante la incubación, añadir 25 cloroquina nM a las células HEK y colocarlos en la incubadora. Después de la incubación, añadir gota a gota la mezcla de transfección para las células HEK y, luego, agitar suavemente para mezclar la mezcla de transfección a lo largo de la placa de los medios de comunicación.
    7. Incubar las células con la mezcla de 8 h a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Cambiar los medios de comunicación en estas células muy lentamente añadir 14 mL de medio DMEM 10 fresco. Pipeteo lentamente contra la pared del plato ayuda a prevenir cualquier desmontaje de las células HEK. Incube las células durante la noche de la 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
    8. Recoger el sobrenadante viral con una jeringa de 10 mL, sacar el sobrenadante en la jeringa y colocar el filtro de jeringa de 0.45 μm. Hunda el sobrenadante viral en un nuevo tubo de colección. Tomar la primera colección de sobrenadante viral ~ 16 h más tarde.
  2. Transducción y concentración viral de fibronectina
    1. Añadir 2 mL de un fragmento de la fibronectina humana recombinante de 0,1 mg en PBS 1 x 6 bien placas. Preparar tanto fibronectina según sea necesario, que depende del número de células y genotipos. Uno bien puede transducir suficiente 10 millones células c-Kit+ . Incube la placa durante la noche a 4 ° C.
    2. Al día siguiente, retire la fibronectina de los pozos con una pipeta, pipeta de 2 mL de estéril 2% de BSA en PBS 1 x a bloquear la placa e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Retire la BSA a través de un vacío y lavar bien por pipetear 2 mL de 1 x PBS luego retire a través de un vacío.
    3. Inmediatamente agregar recién recogida y filtrada (a 0.45 μm) viral sobrenadante hasta 5 mL. Centrifugue a 435 x g a 32 ° C por 2 h. quitar el sobrenadante por vacío y repita este paso con adicional sobrenadante viral recién recogido y girar otra vez. Eliminar el sobrenadante por vacío y lavar los pocillos añadiendo 2 mL de 1 x PBS; a continuación, quitarlo por medio de un vacío.
    4. Añadir que el ratón de c-Kit+ de las células que fueron cultivada durante la noche (paso 4.6.6) a los pocillos recubiertos virales por mezclando bien las suspensiones de células y pipetear en la placa de fibronectina concentrado viral ahora. Centrifugado a 1.200 x g a 25 ° C durante 90 minutos poner las células en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
    5. posttransduction de 48 h, sedimenten las células por centrifugación a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min y resuspender en tampón FACS #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) de 6 x 106/ml. Determinar el porcentaje de células positivas BCR-ABL1 midiendo el porcentaje de YFP positivo mediante citometría de flujo.
    6. Adquisición de eventos con el procedimiento estándar. En primer lugar, las células vivas, basadas en la dispersión hacia delante y lateral de la puerta. Entonces, la puerta del YFP vivo las células positivas excepto YFP-negativecells determinada por control negativo (figura 4).

6. formación de colonias UnitAssays

  1. Descongelar la metilcelulosa con citocinas para ratón a temperatura ambiente durante 1 – 2 h. alícuota 3 mL de metilcelulosa en un tubo de FACS utilizando una jeringa de 5 mL sin aguja. Ordenar las celdas de YFP-positivo de un clasificador de células.
  2. Desactivación de las células y suspender el sedimento en medios completo IMDM. Contar las células para ser plateado y diluir para obtener 5.000 YFP-positive células en 100 μl de medios completo IMDM.
  3. Añada 100 μl de la suspensión de células que contiene 5.000 células YFP-positivas y los inhibidores adecuados a 3 mL de metilcelulosa (véase Tabla de materiales). Vórtice en high para mezclar de 10 a 30 s.
  4. Después de la mayoría del aire burbujas han escapado, use una jeringa de 1 mL a 1 mL de medio en tres placas replicadas de 3 cm de la placa expulsión de los medios de comunicación por un lado e inclinando lentamente la placa en un movimiento circular para esparcir uniformemente.
  5. La concentración final de los inhibidores de uso son imatinib a 3 μm, DFC en 0,2 μm y BCI a 0,5 μm, solos o en combinaciones. Cuando sea apropiado, eliminar c-Fos por la galjanoplastia de las células con 4-hydroxytamoxifen (1 μg/mL) añadido a la metilcelulosa.
  6. Después de la galjanoplastia, de poner las placas en un gran plato de Petri con un plato abierto que contiene 2 mL de agua estéril en el medio. Cubrir el gran plato de Petri e incubar cuidadosamente a los 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Registrar el número de la Colonia después de una semana de la galjanoplastia contando el número total de colonias bajo un microscopio.
  7. Analizar algunas colonias de las placas adecuadas para la eliminación de c-Fos por PCR. Recoger las colonias succionando con una punta de P1000. Desalojar a las células en 500 μl de PBS 1 x por lavar la punta en el PBS varias veces. Giran las suspensiones celulares a 6.000 x g durante 1 min y extraer el ADN del precipitado de células usando un kit de aislamiento de DNA genómico.
  8. Utilizar la DNA genomic de la polimerización en cadena usando las cartillas mFos-FP3 y mFos-RP5, tal como se describe en la tabla 2. Analizar los productos PCR en un gel de agarosa al 2% y una imagen mediante un sistema de documentación de gel.
  9. Para una presentación gráfica de las colonias, se tiñen de las colonias, utilizando cloruro Iodonitrotetrazolium. Disolver 10 mg del cloruro Iodonitrotetrazolium en 10 mL de agua para obtener una solución de 1 mg/mL. Filtro de esterilizar la solución utilizando un conector Luer lock con filtro de 0.2 μm unida a una jeringa de 10 mL en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
  10. En la campana de cultivo de tejidos, añada 100 μl de solución de tinción gota a gota alrededor de la placa de UFC; Tenga cuidado de no deslizar o molestar a las colonias. Incubar las placas durante la noche en a 37 ° C, 5% CO2 célula cultura la incubadora. Las colonias se volverá oscuro rojizo marrón. Con un fondo blanco en la campana de cultivo estériles para tejidos, tomar fotos de la placa teñida de UFC.

7. trasplante y el análisis de la mortalidad

  1. Irradiado letalmente los ratones con radiación dividida usando un 137 Cs basado en rayos Gamma en una dosificación de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h aparte antes del trasplante.
  2. Trasplante de 4 x 104 sin clasificar YFP-positivo (calculado según el porcentaje de YFP) células con 3 x 105 células de médula ósea normal como un portador en cada ratón con cola vena de inyección.
  3. Después de una semana de trasplante, determinar el engraftment analizando las células de YFP-positivas de la sangre periférica mediante el FACS.
  4. Realizar un análisis FACS y sangrado de la vena de la cola.
    1. Caliente la jaula de los ratones bajo una lámpara de calor con cuidado de no recalentar o quemar.
    2. Refrenar un ratón en un limitador de ratón y nick la vena de la cola con una cuchilla estéril. Suavemente la cola de anterior a posterior, permitiendo que una gota de sangre que se acumule la leche. Recoger la sangre con un tubo capilar heparinizado hasta que se llene (recoger alrededor de 75-100 μL). Sumir la sangre desde el tubo capilar lleno en un tubo de colección de sangre que contiene EDTA y mezclar bien.
    3. Lisan los hematíes mediante la adición de 30-40 μl de sangre a 3 mL de tampón de lisis RBC 1 x (150 mM cloruro de amonio, bicarbonato de potasio de 10 mM y 0,13 mM EDTA). Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 minutos Retire el sobrenadante por vacío y suspender el sedimento en 2 mL de 1 x PBS para un lavado.
    4. Centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y suspensión en tampón FACS #1. Realizar análisis FACS como se describe en el paso 5.2.5–5.2.66. Almacén a corto plazo la sangre restante en el tubo de la colección, que puede utilizarse para diversos propósitos, a 4 ° C.
  5. Se utilizaron ratones trasplantados que presentaron 10 – 40% células YFP-positivas en la sangre periférica para el experimento. Los ratones que tenían menos del 2% de células positivas de YFP fueron excluidos del estudio.
  6. Preparar el tamoxifeno 20 mg/ml en aceite de maíz en 60 ° C con un vórtex intermitente hasta que se disuelva completamente y almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante la duración del tratamiento. Después de una semana de trasplante, eliminar el alelo c-Fosfl/fl inyectando el tamoxifeno (100 mg/kg en aceite de maíz) por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones, todos los días durante tres días consecutivos. Es importante que los ratones se pesaron para determinar cuánto tamoxifeno para inyectar. Después del tratamiento con tamoxifeno (en su caso), los ratones para los tratamientos con fármacos del grupo (n = 5/Grupo).
  7. Controlar los ratones para la supervivencia y progresión de la leucemia y determinar carga leucémica (células de YFP-positivas por FACS) semanal hasta ocho semanas en ratones de sobrevivir.
  8. Analizar la sangre para la eliminación de c-Fos cuando sea apropiado, como se describió anteriormente en el apartado 6. Anote el número de ratones sobrevivir cada día y trazar la curva de supervivencia al final del experimento usando un software de graficación.

8. transgénicos ratones modelo de leucemia BCR-ABL1

  1. Aislamiento de LSK
    1. Mantener los ratones transgénicos Scl-tTA en chow de doxiciclina para prevenir la expresión del BCR-ABL1. Cuatro semanas antes del trasplante, tomar los ratones de la doxiciclina chow para la expresión de BCR-ABL1.
    2. Aislante TMNCs de ratones transgénicos Scl-tTA como se describe anteriormente en la sección 4. Suspender las TMNCs en tampón FACS #2 (1 x PBS BSA 0.5% + 2 mM EDTA) para obtener 106 células/mL.
    3. Agotan las TMNCs para las células de linaje-positivo mediante la adición de 10 μl de biotina Cóctel de detección de células de linaje (biotina conjugado anticuerpos monoclonales contra CD5 [rata IgG2a], CD11b [rata IgG2a], CD45R [B220] [rata IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rata IgG2a] y Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) por 1 x 106 células. Incube las células a 4 ° C para 10 min en la oscuridad, seguido por un lavado con 5 mL de tampón FACS #2 y vuelta a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min aspirar el sobrenadante totalmente y suspender las células en 400 μL de tampón FACS #2.
    4. Añadir 5 μl de conjugado anti-biotina anticuerpo-FITC, 1,2 μl de PECy7 Ly-6A/E (Sca1) y 2.4 μL de CD117 (c-Kit) APC anticuerpos contra células de8 millones a 10. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min lavado poniendo el volumen a 5 mL con tampón FACS #2; Luego, centrifugar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 500 μl de tampón FACS #2.
    5. Filtrar la suspensión de células en un tubo de tapa de filtro azul FACS.
    6. Puerta en las células mediante dispersión hacia delante y lateral. A continuación, seleccione las celdas de lin– que demostraron MFI (significa intensidad de fluorescencia de menos de 102) obtener LSK células c-Kit+ y Sca1+ en un biexponential parcela de los padres de Lin– y ordenarlos (figura 7 C).
    7. Recoger las células clasificadas y centrifugar a 1.200 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
  2. Trasplante
    1. Irradiado letalmente los BoyJ ratones con una dosis de radiación dividida de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy después de 3 horas, antes del trasplante.
    2. Inyectar 3 x 103 a 5 x 103 BCR-ABL1-LSK células con 0.3 x 106 linfocitos de la médula ósea de los ratones WT BoyJ vía vena de la cola (i.v.) en los ratones irradiados de BoyJ.
    3. Posttransplantation de cuatro semanas, analizar los ratones receptores para CD45.1 y CD45.2. Obtener la TMNC de la sangre periférica por cola vena sangrado como se describe en el paso 7.4. Resuspender las células en 100 μl de tampón FACS. Incubar las células con 1 μl del anticuerpo CD45.1-FITC y PE CD45.2 a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Lavar las células llevando el volumen a 3 mL con tampón FACS y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender en 200 μL de 1 x PBS.
    5. Analizar el porcentaje de CD45.1 y CD45.2 por primera que bloquean las células vivas, basadas en la dispersión hacia delante y lateral, seguido por bloquear las células FITC y PE positiva basadas en la muestra sin manchas.
    6. Grupo de los ratones en cuatro grupos (n = 6 por grupo). Iniciar el tratamiento con imatinib (75 mg/kg 2 veces al día) sola y en combinación con DFC + BCI (ambas drogas fueron dados en una dosis de 10 mg/kg 2 veces al día).
    7. Tratar del mismo modo, otros grupos con combinaciones de imatinib (75 mg/kg) + curcumina (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg), imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg), BCI (10 mg/kg) durante tres meses, 2 x día, por inyección i.p.
    8. Analizar los ratones 1 x mes por seis meses para quimerismo leucémica determinando el porcentaje de CD45.2 positiva de las células en la sangre periférica por cola vena sangrado como se describe en el paso 7.4.

9. en Vivo evaluación de BCI y actividad de DFC

  1. Análisis de la fosfo-p38
    1. Tomar tres ratones leucémicos (8 – 12 semanas) que fueron trasplantados con BCR-ABL1-expresar las células c-Kit+ , como se describe en la sección 7. Inyectar a los ratones con BCI (10 mg/kg) por inyección i.p. de posttransplant de cuatro semanas.
    2. Medir los niveles de la sangre periférica de fosfo-p38 TMNC utilizando el equipo de citometría de flujo fosforilación según las instrucciones del proveedor. Recoger la sangre de cada ratón antes y 6 h después de la inyección de drogas. Aislar el TMNCs por el agotamiento de RBC y fijarlos como sigue.
    3. Añadir 4 mL de solución de lisis RBC por 100 μl de sangre periférica. Mezclar e incubar en hielo por 5 min lisar los glóbulos rojos. desactivación las células a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita la lisis 1 x más.
    4. Después de la segunda etapa de lisis, lavar el pellet celular con 1 mL de BSA 2% en PBS. Fijar las células mediante la adición de 100 μl de las soluciones de fijación y permeabilización e incubar durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. La celda de pellets por centrifugación a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C.
    5. Lavar el pellet con 1 mL de 1 x lavado de permeabilización. Bloquear las células mediante la adición de 300 μL de BSA 2% en tampón de lavado permeabilización a temperatura ambiente por 20 minutos las células se dividen en tres iguales partes alícuotas de 100 μl (~ 1 x106).
    6. A cada alícuota de células fijadas añadir 1 μl de anticuerpo p-38 total, 1 μl del anticuerpo phospho-p38 y 1 μl de isotipo IgG control, respectivamente e incubar durante una noche a 4 ° C.
    7. Lavar las células 1 x con 5 mL de 2% de BSA en PBS e incubar 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (1 μl de conjugado Alexa Fluor-488). Lavar las células 1 x otra vez y suspenderlos en 200 μL de PBS 1 x.
    8. Adquirir los datos por FACS y analizar por el software de análisis de citometría de flujo.
    9. Deducir el MFI del control IgG de la IMF de las muestras experimentales. Los valores de la IMF de fosfo-p38 se normalizan luego a la de p-38 total para determinar los niveles de fosfo-p38 después de la inyección de BCI.
  2. Análisis de la expresión de genes cuantitativos de genes diana de c-Fos
    1. Tomar tres ratones leucémicos (8 – 12 semanas), que fueron trasplantados con BCR-ABL1-expresan c-Kit+ las células como se describe en la sección 7. Recoger la sangre periférica de cada ratón y luego inyectar a los ratones con 10 mg/kg cada de DFC + BCI.
    2. Recoger la sangre periférica 6 h después de la inyección de drogas. Aislar TMNCs por agotamiento de la RBC, como se describe anteriormente. Las TMNCs de la pelotilla y suspender en un tampón de lisis basado en fenol (véase Tabla de materiales).
    3. Llevar a cabo análisis de RT-qPCR (como se describe en la sección 1) Bcl2l11 y Lif, IL-6, usando las cartillas específicas de genes (se muestra en la tabla 1).

10. a largo plazo ensayo de células iniciadoras de la cultura

Nota: Un ensayo LTCIC se realizó como se describió anteriormente25.

  1. Crecen un ratón células del fibroblasto MS-5 en MEMα a la confluencia en un matraz de cultivo de tejidos T175. Trypsinize las células como se describe anteriormente para HEK293T. Suspender las células en MEMα 2 x 106 células/ml. Toma 10 x 106 células en un tubo cónico de 50 mL e irradiar a 80 Gy. Diluir las células 0.5 x 106 células/mL en MEMα con media de 10% FBS (M10). 2 mL por pozo en una placa de 12 pozos de la placa e incubar en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante la noche.
  2. Al día siguiente, preparar el hemisuccinato de hidrocortisona sodio disolviendo 2,5 mg en 5 mL de MEMα (solución del de 1 M). Filtro-esterilizar la solución de hidrocortisona mediante un filtro de jeringa 0.2 μm en campana de bioseguridad. Diluir la hidrocortisona por dilución seriada en MEM para obtener una solución de 100 μm. Añadir 250 μl de este a 25 mL de medio de cultivo a largo plazo humana (HLTM) (véase Tabla de materiales) justo antes de usar, para lograr una concentración final de 1 μm.
  3. Desactivación de la CML-CD34+ y TMNCs de UCP3 suspenderlas en la HLTM por Vortex breve y determinar las cuentas de un hemocitómetro.
  4. Vacío de los medios de comunicación de M10 de la placa de 12 pozos sembrada con células del estroma y reemplazar con 1 mL de células del paciente (CML-CD34+ [10.000] y UCP3 TMNCs [1 x 106]) suspensión de HLTM. Utilizar tres pozos por combinación de drogas por tipo de la célula.
  5. Diluir las existencias de medicamentos a 2 x de la concentración requerida de HLTM. Añadir 1 mL de los medios de comunicación con las drogas a las células antes mencionadas para obtener una concentración de fármaco de 1 x. Vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con HLTM recién preparado cada semana durante cinco semanas.
  6. Al final del período de ensayo de seis semanas LTC-IC, recoger las células nonadherent en un tubo de las culturas. Trypsinize células adherentes y las combina con las celdas correspondientes de la nonadherent.
  7. Lavar las células y el ensayo de unidades formadoras de colonias en metilcelulosa medio que contiene 30% fetal becerro suero, eritropoyetina (3 unidades/mL), SF (50 ng/mL) y IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) y factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófago (GM-CSF) (20 ng / mL). determinar la cuenta de un hemocitómetro.
  8. Placa de 5 x 104 células en tres repeticiones. Congelar abajo las células restantes en 20% FBS y 10% DMSO. Arreglar las placas en un gran plato de Petri con un plato abierto que contiene agua en el medio. Cubrir cuidadosamente el gran plato de Petri e incubar en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante dos semanas.
  9. Puntuación de las colonias de dos semanas más tarde. En algunos casos, sólo una parte de la cosecha se analizan para unidades formadoras de colonias). Calcular que el número total de LTCIC presente en la suspensión inicial por extrapolación basada en las UFC obtenidas de parte de la cosecha celular. El rendimiento promedio de UFC por LTC-IC es 8.
    Nota: Por ejemplo, si inicialmente 1 x 106 células fueron plateadas en un pozo, después de cinco semanas, se cosecharon 0,5 x 106 células y para UFC, 5 x 104 células fueron plateadas y se obtuvieron 50 UFC. Esto equivale a 500 UFC/1 millón de células plateadas. Divida este número por 8 para LTCIC, que es de 62.5.

11. humanizado modelo de ratón con CML CD34 de las células+

  1. Sublethally irradiar los ratones de 8 semanas de edad gamma NOD scid, expresando humano IL3, GM-CSF y SCF (NSGS), con una sola dosis de 7.0 Gy (700 rads) con 50 rads/min.
  2. Inyectar 3 x 106 CD34 celdas seleccionadas+ de pacientes de fase crónica BCR-ABL1-positive CML en los ratones irradiados por la inyección intravenosa.
  3. Después de dos semanas de trasplante, determinar el engraftment leucémico en la médula ósea por FACS usar ratón y humanos-anticuerpos específicos contra CD45.
  4. Realizar un análisis FACS.
    1. Tomar el aspirado de médula ósea de los fémures de los ratones trasplantados. Lisar los glóbulos rojos con tampón de lisis RBC como se describe anteriormente y recoger el TMNCs por centrifugación. Lavar el sedimento 1 x con PBS 1 x fría.
    2. Bloquear las células con humanos FcR bloque y ratón FcR seguida de tinción con anti-humanos CD45 FITC y anti-ratón CD45 APCCy7 durante la noche a 4 ° C. Realizar el análisis FACS en LSRII y analizar los datos usando software de análisis de citometría de flujo.
  5. Grupo de los ratones en cuatro diferentes cohortes (n = 6/Grupo) para el tratamiento con vehículo, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (ambos a 10 mg/kg), o imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (ambos a 10 mg/kg). Diluir los medicamentos comunes en PBS 1 x (vehículo) y administrar inyectando el i.p. 2 veces al día.
  6. Tratar a los ratones durante seis semanas y determinar la carga leucémica cada dos semanas hasta la semana ocho después del trasplante, como se describe anteriormente en 11.4.

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Representative Results

Adicción oncogén ha sido implicada en la eficacia terapéutica de ITC. Sin embargo, no se entienden los mecanismos de conducción la dependencia oncogene. Se realizaron análisis de expresión génica imparcial múltiples para identificar el componente genético involucrado en la orquestación de la adicción. Estos análisis revelaron el upregulation de tres genes c-Fos, Dusp1 y Zfp36, en las células cancerosas que no dependen de señalización oncogénica de supervivencia y, por lo tanto, son insensibles al tratamiento TKI. El downregulation de c-Fos y Dusp1 por shRNA-mediado caída es suficiente para restaurar la sensibilidad a drogas en otra manera TKI-resistente a las células.

Para validar el papel de c-Fos y Dusp1 como diana terapéutica en la leucemia, su sobreexpresión primero fue confirmada usando las células BaF3 expresan el oncogén BCR-ABL1. Factor de crecimiento en las células BaF3-BA abroga dependencia del oncogén; en consecuencia, no responden a tratamiento de TKI. Análisis cuantitativo de la expresión por RT-qPCR y western blot confirmó que c-Fos y Dusp1 son inducidos por BCR-ABL1 y su expresión es aumentada aún más por el factor de crecimiento IL-3 (figura 1A - 1C).

Para estudiar el papel de c-Fos y Dusp1 vivo, ratones que carecen de c-Fos (ratón condicional modelo c-Fosfl/fl con Rosa26-CreERT2) o Dusp1 (recta Dusp1 KO- / -) y los ratones que carecen de c-Fos y Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) fueron desarrollados. Estos ratones fueron genotipados mediante PCR utilizando el ADN genómico de la cola, y la polimerización en cadena puede distinguir fácilmente el c-Fosfl/fl, Dusp1 KO de los ratones WT (figura 2A). La supresión inducida de c-Fos por tratamiento con tamoxifeno fue confirmada por la polimerización en cadena, por la aparición de una banda en comparación con ninguna banda en ratones no tratados con tamoxifeno (figura 2B).

Para probar el papel de c-Fos y Dusp1, células de médula ósea c-Kit+ de la WT, Dusp1- / -, c-Fosfl/fl, y Dusp1- / -/c-Fosfl/fl fueron aislados y transduced con MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP retrovirus; un esquema del procedimiento se muestra en la figura 3. YFP+ expresando (utilizado como un marcador sustituto para la expresión de BCR-ABL1) fueron ordenados por FACS (figura 4) para más in vitro (UFC) y ensayos en vivo. Los resultados muestran que la eliminación de c-Fos y Dusp1 solo inhibió números de UFC (< 50%). Curiosamente, las células que carecen de c-Fos y Dusp1 fueron comprometidas significativamente en su capacidad formadora de colonias y del tratamiento del imatinib aniquilado todo UFC, lo que sugiere que la pérdida de c-Fos y Dusp1 es sintético letal para la expresión de BCR-ABL1 (figura 5 ).

Los ensayos de UFC in vitro permiten a los investigadores probar rápidamente el fenotipo del KO y actividad de los inhibidores de molécula pequeña. Sin embargo, otros análisis in vivo confirmará la validez de los objetivos. Validación en vivo, primero utilizamos una transducción rápida trasplante modelo1 donde BCR-ABL1 provoca mortalidad dentro de dos a tres semanas. 50 mil células de YFP-positivos, junto con 300.000 – 500.000 células mononucleares derivadas de la médula ósea de ratón normal, fueron inyectadas en ratones irradiados letalmente para inducir la CML. Los ratones que las células de c-Fosfl/fl o el c-Fosfl/flDusp1- / - células fueron inyectados con tamoxifeno después de 10 días de trasplante a eliminar el c-Fos. Ratones que recibieron células- / - WT o Dusp1 desarrollaron leucemia y sucumbieron a la muerte dentro de dos a cuatro semanas, mientras que la eliminación de c-Fos solo mostraron un retraso significativo en el desarrollo de la enfermedad y el tratamiento de TKI salvado casi el 50% de los ratones de la muerte. Curiosamente, los ratones transplantados con células que carecen de c-Fos y Dusp1 sobrevivieron más de largo, y el tratamiento de TKI había curado todos los ratones de la CML (figura 6A - 6 C). Los ratones que sobrevivieron progresivamente pierde las células YFP+ , como se muestra en el c-Fos y doble KO cuando fueron tratados con imatinib (figura 6-6F), lo que sugiere la separación de las células positivas BCR-ABL1.

Dado que la LMC es una enfermedad de la célula de vástago, y dada la incapacidad de los retrovirus para apuntar las células hematopoyéticas primitivas y quietas, es imprescindible comprobar si los objetivos de c-Fos y Dusp1 sería suficiente para eliminar las células leucémicas. Inducible por tetraciclina BCR-ABL1 ratones transgénicos donde tTA se expresa por un reforzador de la Scl, que se expresa específicamente en células madre hematopoyéticas, se han utilizado previamente para estudiar el papel de genes diana en LSCs. Los ratones transgénicos inducible por tetraciclina de BCR-ABL1 (Figura 7A-7B) fueron utilizados para investigar el papel de c-Fos y Dusp1 en LSCs. Las células LSK de estos ratones fueron ordenadas utilizando FACS e inyectado en los ratones receptores (figura 7C). Después de un mes del trasplante, fue anotado engraftment leucémico, seguida de tratamiento farmacológico. Los niveles de LSK y carga leucémica se determinaron cada mes durante seis meses. Ratones trataron con imatinib solo mostraron una supresión de la leucemia pero se quedaron con el MRD. Por lo tanto, interrupción del tratamiento, como se observa en la clínica, dio lugar a la recaída de la enfermedad. En contraste, ratones trataron con una combinación de drogas imatinib + DFC (inhibidor de c-Fos) + BCI (inhibidor de Dusp1) habían erradicado por completo las células leucémicas, y los ratones fueron curados de CML (figura 7 y 7E).

Establecer la lectura del fármaco-dinámico para c-Fos y Dusp1 inhibidores y estudio de su efecto en el blanco, fosfo-p38 niveles (un marcador sustituto para la inhibición de Dusp1) fueron medidos y la expresión de los genes c-Fos-regulada, como IL-6, bcl2l11 y Lif, se cuantificó. Nosotros y otros hemos establecido que la inhibición de Dusp1 resulta en la activación de la p38 (medido por la mayor fosforilación de p38)13. Phospo-p38 niveles fueron medidos por FACS en sangre entera de células aisladas de ratones tratados con drogas. Como era de esperar, los niveles de fosfo-p38 aumentaron (figura 8A) y la expresión de los genes c-Fos-regulado (IL-6, bcl2l11 y Lif) fueron reguladas en los ratones tratados con drogas (figura 8B). Estos resultados sugieren que los inhibidores inhiben su destino y la supervivencia de los ratones es debido a la inhibición de c-Fos y Dusp1.

Importancia humana, la eficacia del c-Fos y Dusp1 inhibidores fueron analizadas usando las muestras de pacientes en in vitro (LTC-IC) y en ensayos in vivo (xenoinjertos de ratón). El tratamiento con DFC + BCI no es eficaz en las células madre leucémicas. Sin embargo, una combinación de DFC + BCI + imatinib erradicar selectivamente las células leucémicas en ambos ensayos, mientras que ahorra las células madre normales (Figura 9A - 9C). Estos resultados establecen que c-Fos y Dusp1 son esenciales para la transformación leucémica, y una elevada expresión de estos genes deroga dependencia oncogene dando por resultado enfermedad recaída y resistencia a los fármacos. Por lo tanto, una combinatoria contra c-Fos y Dusp1 junto con el oncogene de conductor será más efectivo y, tal vez, una estrategia curativa para muchos tipos de cáncer. Anticipamos que los métodos aquí descritos pueden aplicarse generalmente para la validación y la identificación de objetivos adicionales.

Figure 1
Figura 1 : c-Fos y Dusp1 son overexpressed en respuesta al factor de crecimiento IL-3. Análisis de qPCR de una sobreexpresión de c-Fos (A) y (B) Dusp1 en células tratadas con citocinas de BaF3-BA. La expresión relativa se determinó después de la normalización a β-actina. Las barras de error representan la desviación estándar de tres muestras replicadas. (C) análisis de Western blot de las células BaF3-BA tratados con IL-3 y sondeado con total de c-Fos o anticuerpos P-c-Fos y Dusp1. Anticuerpo anti-actina se utilizó como control de carga. Esta figura fue adaptada con el permiso de Kesarwani et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Genotipificación de ratones de c-Fosfl/flDusp1 y Rosa cre-ER. (A) PCR Análisis del ADN de la cola. Espera que las bandas son de peso o de la de c-Fosfl/fl-llevar CreER transgen y ratones KO Dusp1. Los tamaños de banda se indican a la izquierda. (B) PCR Análisis de una banda más pequeña después de la eliminación de c-Fos con tamoxifen el tratamiento. M = 1 kb + escalera de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema del modelo de transducción de señales y el trasplante de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : FACS mostrando la frecuencia de células de la sangre de un ratón WT (control negativo) y un trasplantado de YFP+ . Los paneles superiores muestran un diagrama de dispersión de las células y la compuerta. Los paneles inferiores muestran histogramas de YFP vs dispersión lateral. Las células con un MFI de > 10 se consideraron3 YFP +. Gating similar fue utilizado para las células de la médula ósea después de transducción para calcular el porcentaje de transducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Placas representativas de galjanoplastia de la UFC. Las placas muestran las colonias teñidas con iodonitrotetrazolium cloruro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : c-Fos y deficiencias Dusp1 comprometen desarrollo de leucemia. (A-C) Curvas de supervivencia de los ratones trasplantaron con c-Kit+ las células BCR-ABL1 de WT, Dusp1- / -c-Fos- / -y c-Fos- / - Dusp1 ratones- / - . (D-E) Porcentaje de células YFP + según FACS en la sangre periférica de los ratones trasplantados dibujado de posttransplant cada semana. Aumentan los niveles de YFP y los ratones sucumben a la muerte como en WT y Dusp1 KO. Los ratones que progresivamente pierden las células YFP+ como se muestra en el c-Fos y doble KO cuando se tratan con imatinib. Esta figura fue adaptada con el permiso de Kesarwani et al.. 13. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : c-Fos y Dusp1 son necesarios para la supervivencia de LSCs. (A) esquema del transgén utilizado en ratones transgénicos que expresaban BCR-ABL1 en células madre. (B) diseño Experimental para el estudio de los efectos de la inhibición de c-Fos y Dusp1 por DFC y BCI in vivo. (C) FACS parcelas de la estrategia de oscilación bloquea utilizada para clasificar las células LSK para el trasplante. (D) porcentaje de las células positivas de BCR-ABL1 (determinado por el porcentaje de CD45.2 de ratones donantes) en ratones durante y posttreatment con inhibidores. (E) FACS scatter diagramas mostrando el quimerismo de CD45 en células vivas, así como en el compartimiento de célula LSK. Tenga en cuenta la falta de CD45.2 en total y en el compartimiento de LSK en ratones tratados. Esta figura fue adaptada con el permiso de Kesarwani et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: actividad In vivo de DFC y BCI. Línea (A) gráfico que muestra los niveles de fosfo-p38 después del tratamiento de BCI. (B) RT-qPCR mostrando la expresión de los genes diana de c-Fos en sangre periférica de los ratones después del tratamiento de DFC. Los puntos representan tres repeticiones de cada ratón (n = 3). El número por encima de las gráficas representa el p-valor calculado por de Student t-test. Esta figura fue adaptada con el permiso de Kesarwani et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : Papel de c-Fos y la inhibición de DUSP1 en muestra de un paciente humana. (A) porcentaje de unidades formadoras de colonias determinó mediante el ensayo de LTC-IC de dos pacientes con LMC y un donante sano del tratado con el vehículo o las combinaciones de medicamentos indicados. (B) porcentaje de células leucémicas humanas (hCD45) en la médula ósea de ratones NSGS en la semana 2 (izquierda) y 4 (derecha) del tratamiento. (C) este panel muestra representativas parcelas FACS mostrando una drástica reducción de las células hCD45 en los ratones tratados con drogas mientras que ahorra el ratón células como mCD45. Esta figura fue adaptada con el permiso de Kesarwani et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La mayor parte de las células cancerosas, la respuesta terapéutica a TKI es mediada por un bloqueo de las señales de la tirosina-cinasa-oncoprotein a que el tumor es adicto. Sin embargo, relativamente poco se sabe sobre cómo una minoría de las células de cáncer que contribuyen a la MRD escape oncogene en dependencia y la terapia4. Estudios recientes revelaron que de señalización del factor de crecimiento media resistencia a droga en leucemia y tumores de órganos sólidos. Esto sugiere que diversos mecanismos moleculares podrían ser la base de resistencia intrínseca10,11,12. Para comprender el mecanismo e identificar objetivos de genes para el desarrollo terapéutico, se realizaron perfiles de expresión de todo el genoma completo utilizando el mouse (BaF3) y células humanas (K562). Muestras primarias de ratones leucémicos o pacientes con LMC no fueron utilizadas porque sospechamos que, como las muestras primarias de la médula son significativamente heterogéneas, que enmascaran la identidad de objetivos de genes relevantes. Incluso las células purificadas por anticuerpo-mediada de clasificación (células progenitoras) exhiben una heterogeneidad significativa. Por lo tanto, una línea celular purificada probablemente es más adecuada para la identificación de objetivos evitar cualquier indeseado complejidad impuesta por heterogeneidad genética. El análisis de expresión de todo el genoma había identificado que c-Fos y Dusp1 Zfp36 comúnmente son upregulated en las células resistentes a drogas. Una vez que se identifican los objetivos, su validación se convierte en una parte crítica para reconocer su papel en el contexto genético determinado. Utilizando cDNA sobreexpresión y estudios genéticos de precipitación en las células BaF3 reveló que la inhibición de c-Fos y Dusp1 es suficiente y necesaria para la sensibilidad efectiva de TKI. Tal vez uno de los pasos más críticos en la validación del objetivo es validar la importancia de genes/objetivos identificados en las muestras primarias de ratón y humano. En este protocolo, proporciona paso a paso utilización de múltiples modelos genéticos y proporcionan mejor visión mecanicista para el refinamiento adicional de evaluación de medicamentos y destino.

Una proyección rápida a nivel celular utilizando la UFC o el ensayo LTCIC ayuda a los investigadores a probar múltiples combinaciones de fármacos, así como concentraciones, rápidamente antes de pasar a métodos más desperdiciadora de tiempo de trasplante. Dado que la LMC es una enfermedad de la célula de vástago, y dada la incapacidad de los retrovirus para apuntar las células hematopoyéticas primitivas y quietas, es imperativo realizar las pruebas utilizando modelos que abordan directamente su papel en la supervivencia de la LSC. Para solucionar esto, se utilizó un ratón transgénico del BCR-ABL inducible por tetraciclina donde tTA se expresa por un reforzador de Scl. Sin embargo, los modelos genéticos son deficientes en recapitular la enfermedad humana. Por lo tanto, es necesario poner a prueba las muestras de pacientes primarias en modelos de ratón humanizado. Sin embargo, para poder hacer un estudio a largo plazo para la detección de MRD con el tiempo, un xenoinjerto estable se requiere que, dependiendo de la célula y ratones tipos, puede variar. Después de cuatro meses de trasplante, las células CD34 + humanas fueron agotadas incluso sin el tratamiento de la droga, que es una limitación en modelos de ratón más humanizados. Mejores modelos de ratón humanizado se están desarrollando para las pruebas de las células humanas en ratones26. Se recomienda determinar la actividad sobre el destino de los inhibidores como efectos off-target pueden causar toxicidad a las células normales, limitando su aplicación más. Sin embargo, si no se conoce el destino de aguas abajo, deben utilizarse diferentes enfoques. Por ejemplo, identificar a los mutantes resistentes a los medicamentos mediante mutagénesis al azar de la proteína diana directamente puede resolver si el inhibidor es el objetivo27.

El protocolo que presentamos proporciona un método integral para la identificación de objetivos y validación utilizando varios sistemas de modelo in vitro e in vivo . Estos métodos pueden adaptarse fácilmente a otros destinos y tipos de cáncer. Más estudios mecanísticos en identificaron objetivos y refinamiento en la orientación de drogas puede ayudar a desarrollar mejores las modalidades terapéuticas para el tratamiento eficaz o curativo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores están agradecidos a G. Q. Daley por proporcionar las células BaF3 y WEHI y construye T. Reya para MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. Los autores están agradecidos a M. Carroll para proporcionar las muestras pacientes de la crisis de la ráfaga CML. Este estudio fue apoyado por subvenciones a M.A. de NCI (1RO1CA155091), la Fundación de investigación de la leucemia y la Fundación de la V y de NHLBI (R21HL114074-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Materials
RPMI Cellgro (corning) 15-040-CV
DMEM Cellgro (corning) 15-013-CV
IMDM Cellgro (corning) 15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment Takara T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) Stem Cell 3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) Stem Cell 4434
4-Hydroxytamoxifen Sigma H6278
Recombinant Murine SCF Prospec CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand Prospec CYT-340
Recombinant Murine IL-6 Prospec CYT-350
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17
DFC LKT Laboratories Inc. D3420
BCI Chemzon Scientific NZ-06-195
Imatinib LC Laboratory I-5508
Curcumin Sigma 458-37-7
NDGA Sigma 500-38-9
Penn/Strep Cellgro (corning) 30-002-CI
FBS Atlanta biological S11150
Trypsin EDTA 1x Cellgro (corning) 25-052-CI
1x PBS Cellgro (corning) 21-040-CV
L-Glutamine Cellgro (corning) 25-005-CL 5 mg/mL stock in water
Puromycin Gibco (life technologies) A11138-03
HEPES Sigma H7006
Na2HPO4.7H2O Sigma S9390
Protamine sulfate Sigma P3369 5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%) Sigma T8154
DMSO Cellgro (corning) 25-950-CQC
WST-1 Roche 11644807001
0.45 μM acro disc filter PALL 2016-10
70 μm nylon cell stariner Becton Dickinson 352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) Simga 1083
PBS Corning 21040CV
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail Roche CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5762
Nitrocullulose Membrane Bio-Rad 1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) Thermo Scientific 34075
CD5 eBioscience 13-0051-82
CD11b eBioscience 13-0112-75
CD45R (B220) BD biosciences 553092
CD45.1-FITC eBioscience 11-0453-85
CD45.2-PE eBioscience 12-0454-83
hCD45-FITC BD Biosciences 555482
Anti-Biotin-FITC Miltenyi 130-090-857 
Anti-7-4 eBioscience MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) eBioscience 13-5931-82
Anti-Ter-119 eBioscience 13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 BD  558612
CD117 APC  BD  553356
BD Pharm Lyse BD  555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) BD  554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow) BD  554723
phospho p38 Cell Signaling Technologies 4511S
total p38 Cell Signaling Technologies 9212
Mouse IgG control BD  554121
Alexa Flour 488 conjugated  Invitrogen A-11034
Calcium Chloride Invitrogen K278001
2x HBS Invitrogen K278002
EDTA Ambion AM9261
BSA Sigma A7906
Blood Capillary Tubes Fisher 22-260-950
Blood Collection Tube Giene Bio-One 450480
Newborn Calf Serum Atlanta biological S11295
Erythropoiein Amgen 5513-267-10
human SCF Prospec CYT-255
Human IL-3 Prospec CYT-210
G-SCF Prospec CYT-220
GM-CSF Prospec CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay) Stem Cell Technologies 5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate Stem Cell Technologies 7904
MEM alpha Gibco 12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 Becton Dickinson 329461
Mortor pestle Coor tek  60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM) Butler Schien 29405
SOC New England Biolabs B90920s
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar) Difco 214050
Terrific broth Becton Dickinson 243820
Agarose Genemate E-3119-500
Doxycycline chow TestDiet.com 52662 modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline 
Tamoxifen Sigma T5648
Iodonitrotetrazolium chloride  Sigma I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit Qiagen 69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) Promega M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit) Qiagen 217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) Ambion, Life Technologies AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) Invitrogen 18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) Bio-Rad 1725270
CD117 MicroBead Kit Miltenyi 130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R Eppendorf
TC-10 automated cell counter Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2 Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) Bio-RAD 17001401
Hemavet (boold counter) Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer) BD 
Fortessa I (FACS analyzer) BD 
FACSAriaII (FACS Sorter) BD 
Magnet Stand Miltenyi
Irradiator  J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA Mark I Model 68A source Cs 137
Mice
ROSACreERT2 Jackson Laboratory
Scl-tTA  Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ  mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6  Jackson Laboratory
NSGS mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-  Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Made in house
Cells
BaF3 Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells University Hospital, University of Cincinnati

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References

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  24. SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
  25. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
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  27. Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).

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Cancer Research número 143 inhibidores de tirosina quinasa leucemia mieloide crónica enfermedad residual mínima cinasa de la tirosina las células madre leucémicas adicción oncogén resistencia de la terapia trasplante de médula ósea modelos de ratón
Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén
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Kesarwani, M., Kincaid, Z., Azam, M. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (143), e58194, doi:10.3791/58194 (2019).

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