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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Abstract

La démonstration des inhibiteurs de tyrosine kinase (utilisation) dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) a annoncé une nouvelle ère dans la thérapeutique anticancéreuse. Cependant, une petite population de cellules ne répond pas au traitement TKI, entraînant la maladie résiduelle minime (MRD) ; même les plus puissants inhibiteurs fail pour éradiquer ces cellules. Ces cellules MRD servent de réservoir à développer une résistance au traitement. Pourquoi le traitement TKI est inefficace contre les cellules MRD ne connaît pas. Signalisation du facteur de croissance est impliquée dans le soutien à la survie des cellules MRD durant le traitement TKI, mais une interprétation mécaniste fait défaut. Des études récentes ont démontré qu’un élevé de c-Fos et d’expression Dusp1 par suite convergente oncogène et facteur de croissance de signalisation dans les cellules MRD médient résistance TKI. L’inhibition génétique et chimique de c-Fos et Dusp1 rend CML extraordinairement sensible aux inhibiteurs et durcit CML dans les deux modèles de souris génétiques et humanisé. Nous avons identifié ces gènes cibles à l’aide de puces multiples des cellules résistantes et - TKI sensibles. Ici, nous fournissent des méthodes pour la validation de cibles à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Introduction

L’activité kinase tyrosine constitutive des oncogènes de fusion BCR-ABL1 provoque CML, qui fournit une justification pour cibler l’activité kinasique de petites molécules inhibitrices. Le succès de l’utilisation dans le traitement des patients atteints de LMC a révolutionné le concept de thérapie ciblée1,2. Par la suite, la thérapie Anti-kinase comme médicament de précision a été développée pour plusieurs autres tumeurs malignes, y compris les tumeurs solides. Jusqu'à présent, plus de trente inhibiteurs de kinase ont été approuvés par la FDA des État Unis pour le traitement de diverses tumeurs malignes. Alors que le traitement TKI est très efficace pour supprimer la maladie, il n’est pas curatif. En outre, une petite population de cellules cancéreuses persiste pendant le traitement : le MRD3,4,5. Même les patients qui ont montré la rémission complète sont retrouvent avec MRD, qui finalement réprimées les résultats en rechute, sinon en permanence. Par conséquent, l’élimination des cellules MRD est nécessaire pour atteindre une réponse durable ou curative. LMC représente un paradigme précieux pour définir le concept de la médecine de précision, les mécanismes de l’oncogenèse, rationnelle axée sur les cibles thérapeutiques, progression de la maladie et la résistance aux médicaments. Cependant, aujourd'hui encore, le mécanisme de mort cellulaire induite par TKI au volant dans les cellules cancéreuses n’est pas entièrement compris, ni pourquoi les cellules MRD (composées de cellules souches leucémiques [CDL]) sont intrinsèquement résistants à cette4,6. Néanmoins, le phénomène de la « dépendance oncogène » à mutant kinase oncoprotéine est impliqué dans efficacité TKI où l’inhibition aiguë de l’oncogène ciblé par cette provoque un choc oncogène qui entraîne une réponse massive proapoptotique ou quiescence dans la cellule manière contextuelle6,7,8,9. Toutefois, le fondement mécaniste de la dépendance de l’oncogène est absent. Des études récentes ont mis en cause que la signalisation du facteur de croissance abroge la dépendance de l’oncogène et par conséquent confère une résistance aux TKI thérapie10,11,12. Par conséquent, pour mieux comprendre le mécanisme de la dépendance de l’oncogène, nous avons effectué profilage de l’expression du génome entier de BCR-ABL1 accro et des cellules nonaddicted (cultivées présentant des facteurs de croissance), qui a révélé que le c-Fos et Dusp1 sont des médiateurs critiques de oncogène addiction13. La délétion génétique de c-Fos et Dusp1 est cellules létales permettant d’exprimer par le BCR-ABL1 synthétiques et les souris utilisées pour l’expérience n’a pas développé une leucémie. De plus, l’inhibition de c-Fos et DUSP1 de petites molécules inhibitrices guéri induite par la BCR-ABL1 LMC chez la souris. Les résultats montrent que les niveaux d’expression de c-Fos et Dusp1 définissent le seuil de l’apoptose dans les cellules cancéreuses, tels que des niveaux inférieurs confèrent sensibilité aux médicaments, alors que des niveaux plus élevés causent la résistance à la thérapie de13.

Pour identifier les gènes de la dépendance de l’oncogène de conduite, nous avons effectué plusieurs profilage des expériences en présence de facteur de croissance et d’un TKI (imatinib) à l’aide de la souris - et cellules d’origine patient LMC (K562) de l’expression du génome entier. Ces données ont été analysées en parallèle aux ensembles de données patients LMC, obtenu à partir de CD34+ des cellules souches hématopoïétiques avant et après traitement par l’imatinib. Cette analyse a révélé trois gènes (un facteur de transcription [c-Fos], la double spécificité phosphatase 1 [Dusp1] et une protéine de liaison à l’ARN [Zfp36]) qui sont couramment positivement en cellules TKI-résistantes. Pour valider l’importance de ces gènes conférant une résistance aux médicaments, nous avons effectué des analyses in vitro et in vivo étape par étape. Les niveaux d’expression de ces gènes ont été confirmés par qPCR en temps réel (RT-qPCR) et western blot dans les cellules résistantes aux médicaments. En outre, la surexpression de cDNA et knockdown de Sharn barettes de c-Fos, Dusp1, et Zfp36 a révélé qu’élevés de c-Fos et Dusp1 des expressions sont suffisantes et nécessaires pour conférer résistance TKI. Par conséquent, nous avons effectué une validation in vivo à l’aide de modèles murins avec c-Fos et Dusp1 seulement. Pour la validation génétique de c-Fos et Dusp1, nous avons créé inductibles par ROSACreERT de souris (conditionnel knockout) c-Fosfl/fl 14 et les croisées avec Dusp1- / - (droite knockout)15 à faire ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - souris double-transgéniques. Les cellules de moelle osseuse c-Kit+ (de c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- et c-Fosfl/flDusp1- / -) exprimant BCR-ABL1 étaient analysées in vitro dans un test d’unité (CFU) formatrices et en Vivo par greffe de moelle osseuse chez des souris mortellement irradiés, pour tester la condition c-Fos et Dusp1 seul ou ensemble dans le développement de la leucémie. De même, les inhibitions chimiques de c-Fos par DFC (difluoré curcumine)16 et Dusp1 par BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one),17 ont été testés in vitro et in vivo par BCR-ABL1-exprimant, OS cellules de moelle osseuse c-Kit+ par la type sauvage (WT) de souris. Pour confirmer l’obligation de c-Fos et Dusp1 dans les cellules souches leucémiques, nous avons utilisé un modèle de souris de LMC où BCR-ABL1 a été spécifiquement induits dans ses cellules souches par doxycycline (Tet-transactivateur se déclare dans les cellules souches murines leucémie (SCL) gène 3' enhancer règlement)18,19. Nous avons utilisé la moelle osseuse Lin–c-Kit de Sca++ (LSK) les cellules de ces souris lors d’un essai in vivo de transplantation. En outre, nous avons établi les niveaux phopsho-p38 et l’expression d’IL-6 comme biomarqueurs pharmaco-dynamique pour Dusp1 et inhibition de c-Fos, respectivement, in vivo. Enfin, d’élargir l’étude humaine pertinence, dérivé de patient CD34+ cellules (équivalent pour les cellules de c-Kit+ de souris) ont été soumis à long terme essais in vitro qui lance la culture cellulaire (LTCIC) et un modèle de souris humanisée in vivo des CML20,21. Les souris immunodéficientes ont été transplantées avec LMC CD34 + cellules, suivies du traitement de la toxicomanie et l’analyse de la survie des cellules leucémiques humaines.

Dans ce projet, nous développons des méthodes d’identification des cibles et des validations à l’aide d’outils génétiques et chimiques, à l’aide de différents modèles précliniques. Ces méthodes peuvent être appliquées avec succès afin de valider les autres objectifs de développement chimiques modalités de développement thérapeutique.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Les prélèvements humains (BM normale et celle de LMC (p210-BCR-ABL +) leucémie) ont été obtenues par le biais de protocoles approuvés Institutional Review Board (Institutional Review Board : Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children Hospital Medical Center) et consentement des donateurs informés de CCHMC et de l’Université de Cincinnati.

1. en temps réel qPCR analyse

  1. Isoler l’ARN total de BaF3 cellules qui croissent en milieu RPMI additionné de milieu de culture WEHI passé FBS et 10 % 10 % comme source de l’interleukine-3 (IL-3).
  2. Récolter les cellules en phase logarithmique (99 % de vie) des traités (IL-3 et imatinib) ainsi que des échantillons non traités et les centrifuger à 435 x g pendant 3 min. La santé et les stades de croissance des cellules sont cruciaux car leurs profils d’expression génique peuvent changer de façon spectaculaire.
  3. Isoler l’ARN par purification total RNA22. Quantifier l’ARN total ; Ensuite, assujettir à la DNase traitement23. Convertir des quantités égales d’ARN sans ADN (2 µg) d’ADNc avec24de la transcriptase inverse.
  4. Effectuer y avec les amorces de gène-spécifique (tableau 1). Effectuer PCRs dans 20 réactions µL à 0,2 mL, à parois minces PCR tubes avec bouchons optiques, à l’aide d’une polymérase 1 x mélangent (voir Table des matières), 0,5 µM de chaque amorce, 1 µL d’ADN et de l’eau. Placer la réaction dans le thermocycleur avec le cycle suivant : étape 1, 95 ° C pendant 10 min ; L’étape 2, 95 ° C pendant 15 s ; Étape 3 à 60 ° C pendant 1 minute ; Étape 4, répétez les étapes 2 et 3 40 fois. Effectuer toutes les RFT en géométrie et normaliser les données en temps réel à l’expression de la β-actine avant traçage.

2. Western Blot

Remarque : Extraits de cellules entières ont été préparés en ajoutant 250 µL de 1 x tampon de lyse, comme décrit dans Kesarwani Al13 additionné d’un inhibiteur de la protéase cocktail et phosphatases 2 cocktail.

  1. Récolte des cellules BaF3 5 millions à phase logarithmique (99 % de vie) de traités (IL-3 et imatinib) ainsi que de BaF3 non traitées des cellules par centrifugation à 435 x g pendant 3 min à 4 ° C. Lyse des cellules dans le tampon de lyse (250 µL) de pipetage et descendre 1 x, suivie d’une incubation de 5 min à 80 ° C. Laisser agir le lysat de briser tous les ADN avec des impulsions de 5 et 6 de 5 s chacun dans une chambre froide à 4 ° C.
  2. Transférer le lysat dans un tube de 1,5 mL et il centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min enlever toute matière insoluble. L’extrait peut être conservé à-80 ° C jusqu'à utilisation. Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 5 min dans un bloc chauffant avant le chargement. Charger de 10 µL de l’échantillon à l’aide d’une pointe de gel-chargement sur gel SDS-PAGE 10 %.
  3. Résoudre les protéines à 150 V jusqu'à ce que la teinture de référence atteint le fond du gel. La protéine de transfert à des membranes de nitrocellulose par un transfert électrophorétique à 1 ampère pendant 1 h. Après le transfert, bloquer les membranes en 1 x tampon Tris salin + 0,1 % Tween 20 (TBST) avec du lait écrémé 5 % pour 1 h et la sonde pendant la nuit à 4 ° C avec les anticorps appropriés à une dilution de 1 : 1 000.
  4. Laver les membranes 3 x à 5 x avec un mélange TBST pendant 10 min chacun ; Ensuite, la sonde avec un HRP conjugué approprié anticorps secondaire (1:5, 000 dilution) à température ambiante pendant 1 h. La quantité d’un mélange TBST utilisé dépend de la taille du conteneur. Veillez à plonger la membrane dans un mélange TBST complètement. Laver l’anticorps secondaire 3 x de 5 min chacun, avec un mélange TBST.
  5. Développer la tache à l’aide du réactif chimioluminescent substrat. Mélanger des quantités égales de substrat et le tampon des deux bouteilles, juste avant utilisation. Ajoutez le substrat en haut de la membrane pour couvrir l’ensemble membrane avec une pipette 1 mL et incuber pendant 1 min. Les taches doivent être photographiés au sein de 1 à 10 min de l’ajout du substrat.
  6. Avec une pincette émoussé, placer soigneusement la membrane sur la plate-forme du système d’imagerie (voir Table des matières), en évitant une grande partie du liquide. Sélectionnez un mode live view et choisissez les taches et chemiluminiscence dans le menu. À l’aide d’acquisition manuelle, acquérir des expositions multiples à différents moments. Ces fichiers peuvent être visualisées et quantifiées à l’aide de logiciels d’imagerie.

3. génération des souris Knockout

  1. Croix de souris de c-Fosfl/fl ROSACreERT2 souris pour générer de sourisfl/fl ROSACreERT2c-Fos13. Pour créer les chez des souris double-knockout (KO), nichent sourisfl/fl ROSACreERT2c-Fos avec Dusp1- / - souris pour générer ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - souris13. Génotype les souris par clips queue suivi d’ACP, tel que décrit ci-dessous.
  2. Génotypage :
    1. Pour préparer l’ADN, clip une infime partie de la queue avec des ciseaux et mettez-la dans un tube de 1,5 mL. Cautériser la queue avec des ciseaux chauffants. Ajouter 200 µL de 50 mM NaOH à la queue coupée dans le tube et laisser incuber à 95 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 h.
    2. Vortex le tube bien et, ensuite, neutraliser par ajouter 50 µL de 1 M Tris-HCl pH 6,8 et vortex à nouveau. Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 1 minute.
    3. Effectuer PCRs dans 20 µL des réactions dans 0,2 mL, tubes PCR à paroi mince en utilisant 1 x Taq polymérase maître mélange contenant le colorant, 0,5 µM de chaque amorce, 1 µL d’ADN et de l’eau. Placer les tubes dans le thermocycleur et exécuter les cycles appropriés comme indiqué dans le tableau 2.
    4. Exécuter le produit PCR sur gel d’agarose à 2 % et de l’image à l’aide d’un système de documentation de gel.

4. isolement de c-Kit+ cellules de moelle osseuse

  1. Sacrifier les souris selon les lignes directrices.
    Remarque : Ici, les souris ont été exposées au dioxyde de carbone (CO2) à une fonction à l’AVMA recommandé débit jusqu'à ce que la mort a été déterminée par l’arrêt de la respiration et le rythme cardiaque, suivie de la dislocation cervicale.
  2. Récolter lesOS de la souris — deux fémurs, deux tibias, deux iliaques. Nettoyer tous les tissus des os en raclant avec un scalpel. Mettre les os dans du PBS 1 x contre le rhume sur la glace — 5 mL dans un tube de 15 mL. Versez le contenu du tube dans un mortier et écraser avec un pilon.
  3. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube 50 mL à bouchon à vis avec une pipette de 10 mL, attachée, à l’aide d’une pipette. Laver le mortier et pilon plusieurs fois avec du PBS 1 x contre le rhume, collecte et en ajoutant la suspension cellulaire dans le tube de 50 mL. Tourner vers le bas de la moelle osseuse à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant via un vide avec une pipette de verre connectés. Suspendre le culot cellulaire dans 5 mL de solution de 1 PBS x avec une pipette.
  4. Avec une pipette, ajouter lentement suspendu la moelle osseuse vers le haut de 5 mL de la température ambiante (la température est critique) polysucrose, prenant bien soin à ne pas déranger l’interface. Essorage à 400 x g à température ambiante pendant 20 min avec le frein mis hors tension.
  5. Recueillir l’interface nuageux total de cellules mono-nucléaire (TMNC) avec une pipette et mettez-la dans un nouveau tube de 15 mL. Compléter le volume jusqu'à 10 mL avec du PBS 1 x pour le lavage, prenant 20 µL de comptage et tourner à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant et sauver le culot sur la glace pour l’étape 4.6.1.
  6. Effectuer le c-Kit+ cellule d’isolement.
    1. Suivre un protocole faisant de kit pour le c-Kit+ cellule d’isolement. Resuspendre le culot dans 80 µL de PBS 1 x + EDTA + BSA à 107 cellules. Pour obtenir la suspension cellulaire, ajouter 20 µL de cellules total de7 CD117 microbilles/10. Mélanger bien au vortex et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Compléter le volume à 10 mL en ajoutant 1 x PBS + EDTA + BSA et un essorage à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min.
    2. Retirez le surnageant via un vide et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL/108 cellules total de PBS 1 x + EDTA + BSA. Utilisation du support de l’aimant avec la colonne magnétique attachée, ajouter 3 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA et laisser s’écouler par gravité dans un tube de prélèvement de 15 mL.
    3. Une fois la première addition de tampon terminée passant par la colonne, ajouter la suspension cellulaire à la colonne, ce qui lui permet de circuler à travers par gravité dans le tube de prélèvement de 15 mL. Cette redistribution est la fraction cellulaire non désirés.
    4. Laver la colonne 3 fois avec PBS 1 x 3 mL + EDTA + BSA chaque fois, ce qui lui permet de circuler à travers par gravité dans le tube de prélèvement. Supprimer la colonne de l’aimant et placez-la sur le haut d’un tube de 15 mL.
    5. Ajouter 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA et rincer avec le piston fourni avec la colonne. Enlever le piston et répéter la chasse d’eau avec 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA supplémentaire. Compter les cellules dans le volume total à l’aide de méthodes standard.
    6. Tournez en bas des cellules à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans IMDM complet (IMDM + 10 % BF + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) pour la culture. Culture de que ces cellules pour la nuit en 2 x 106 cellules/1 mL de médias complet de la cellule IMDM en les plaçant dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.

5. transduction

  1. Transfection rétrovirale plasmide
    1. Fraîchement décongeler les cellules HEK293 définie de l’après-midi avant dans un bain-marie à 37 ° C. Faites tourner le cryotube contenant les cellules HEK à 435 x g à température ambiante pendant 3 min. retirer le surnageant via un vide et suspendre le culot dans 1 mL de DMEM supplémenté de 10 % des BF, la pénicilline, la streptomycine et la glutamine.
    2. Compter les cellules et ajouter le volume approprié à un plat de 10 cm traité (~ 4 x 106 HEK293T cellules). Ajouter 14 mL des médias DMEM 10 au plat et mélangez-le bien en le faisant glisser verticalement pour une répartition égale. Placer le plat dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur du jour au lendemain.
    3. Le lendemain matin, vérifiez la confluence des cellules sous un microscope inversé léger (50 % ou plus fonctionne bien).
    4. Combiner l’ADN (plasmide retroviral désirée), PclEco (plasmide d’emballage), 2 M CaCl2et H20 dans un tube de 1,5 mL (= 500 µL) à l’aide d’une micropipette dans les montants suivants : 7,5 µg d’ADN (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µg de pCLeco, 62 µL de CaCl 2 M2 et de l’eau pour un volume final de 500 µL. ajouter 500 µL de 2 x HBS dans un autre tube de 1,5 mL.
    5. Ajouter l’ADN mélanger quelques gouttes dans le tube de 1,5 mL contenant 500 µL de 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES et 1,5 mM Na2HPO4) tout en mélangeant. Atteindre cet objectif en définissant un vortex à la vitesse la plus basse et tenir le tube HBS sur elle pour un mélange constant tout en ajoutant le mélange de transfection.
    6. Laissez le mélange de transfection à incuber pendant 20 à 30 min à température ambiante. Pendant l’incubation, ajouter 25 chloroquine nM aux cellules HEK et placez-les dans l’incubateur. Après l’incubation, ajouter le mélange de transfection goutte aux cellules HEK et, ensuite, doucement agiter les médias pour mélanger la transfection tout au long de la plaque.
    7. Incuber les cellules avec le mélange pendant environ 8 h en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Modifier les médias sur ces cellules en ajoutant très lentement 14 mL de frais DMEM 10 médias. Pipetage lentement contre la paroi du plat contribue à prévenir tout décapage des cellules HEK. Incuber les cellules pendant la nuit dans les 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
    8. Recueillir le surnageant viral avec une seringue de 10 mL, aspirer le surnageant dans la seringue et fixer la seringue-filtre de 0,45 µm. Plonger le surnageant viral dans un nouveau tube de prélèvement. Prendre la première collection de viral surnageant ~ 16 h plus tard.
  2. La transduction et la fibronectine concentration virale
    1. Ajouter 2 mL d’un fragment de fibronectine humaine recombinante 0,1 mg dans du PBS 1 x plaques de culture de 6 puits non traitée. Préparer la fibronectine autant que nécessaire, qui dépend du nombre de cellules et de génotypes. Eh bien, on peut transmettre suffisamment 10 million de cellules c-Kit+ . Incuber la plaque pendant une nuit à 4 ° C.
    2. Le lendemain, retirer la fibronectine provenant des puits avec une pipette, pipette de 2 mL de BSA stérile de 2 % dans du PBS 1 x à bloquer la plaque et incuber 30 min à température ambiante. Supprimer la BSA via un vide et laver soigneusement par pipetage 2 mL de solution 1 PBS x puis supprimer via un vide.
    3. Ajouter immédiatement fraîchement recueillie et filtrée (avec 0,45 µm) surnageant viral, jusqu'à 5 mL. Centrifuger à 435 g à 32 ° C pour 2 h. retirer le surnageant via un vide et répétez cette étape avec supplémentaire surnageant viral fraîchement récolté et tourner de nouveau. Retirez le surnageant via un vide et laver les puits en ajoutant 2 mL de solution de 1 PBS x ; Ensuite, supprimer via un vide.
    4. Ajouter que la souris c-Kit+ cellules qu’ont été cultivée pendant la nuit (étape 4.6.6) à virale de la microplaque de bien mélanger les suspensions cellulaires et eux pipetage dans la plaque de fibronectine concentré virale maintenant. Tourner à 1 200 g à 25 ° C pendant 90 min. mettre les cellules en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
    5. posttransduction 48 h, les cellules de granule par centrifugation à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min et les remettre en suspension dans le tampon de FACS #1 (solution 1 PBS x + 0,5 % de BSA) à 6 x 10,6/ml. Déterminer le pourcentage de cellules positives BCR-ABL1 en mesurant le pourcentage de YFP positive à l’aide de cytométrie en flux.
    6. Acquérir des événements avec la procédure standard. Tout d’abord, porte les cellules vivantes basés sur la diffusion vers l’avant et latérale. Puis, porte les YFP positive des cellules vivantes à l’exclusion de la YFP-negativecells déterminé par le contrôle négatif (Figure 4).

6. formant des colonies UnitAssays

  1. Dégelez la méthylcellulose avec cytokines de souris à température ambiante pendant 1 à 2 h. Aliquot 3 mL de méthylcellulose dans un tube de FACS à l’aide d’une seringue de 5 mL sans aiguille. Trier les cellules YFP-positif sur un trieur de cellules.
  2. Faire tourner les cellules vers le bas et suspendre le culot dans médias complet IMDM. Compter les cellules pour être plaqué et diluer pour obtenir 5 000 cellules YFP positives dans 100 µL de médias complet IMDM.
  3. Ajouter 100 µL de la suspension cellulaire contenant 5 000 cellules YFP-positives et les inhibiteurs appropriés à 3 mL de méthylcellulose (voir Table des matières). Vortex en haut à mélanger pendant 10 à 30 s.
  4. Après la majeure partie de l’air ont échappé à bulles, utiliser une seringue de 1 mL à 1 mL de médias en trois plaques répétées 3 cm sur plaque en éjecte le support sur un côté et en inclinant lentement la plaque dans un mouvement circulaire de se répandre uniformément.
  5. La concentration finale des inhibiteurs d’utiliser sont imatinib à 3 µM, DFC à 0,2 µM et BCI à 0,5 µM, seuls ou en combinaison. Chaque fois que nécessaire, supprimez c-Fos en ensemençant les cellules avec 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) ajouté à la méthylcellulose.
  6. Après ensemencement, mettre les plaques dans une grande boîte de pétri avec une capsule ouverte contenant 2 mL d’eau stérile au milieu. Couvrir la grande boîte de Pétri et incuber soigneusement à la 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Enregistrer le nombre de colonies après une semaine d’électrodéposition en comptant le nombre total de colonies sous un microscope.
  7. Analyser quelques colonies de plaques appropriées pour la suppression de c-Fos par PCR. Recueillir les colonies en les suçant avec une pointe de P1000. Déloger les cellules de 500 µL de PBS 1 x en lavant la pointe dans du PBS plusieurs fois. Faites tourner les suspensions cellulaires à 6 000 x g pendant 1 min et extrait le culot cellulaire à l’aide d’un kit d’isolation de l’ADN génomique de l’ADN.
  8. Utiliser l’ADN génomique pour PCR avec des amorces MFO-FP3 et MFO-RP5, tel que décrit dans le tableau 2. Analyser les produits PCR sur un gel d’agarose à 2 % et une image à l’aide d’un système de documentation de gel.
  9. Pour une présentation graphique des colonies, tacher les colonies, à l’aide de chlorure d’Iodonitrotétrazolium. Dissoudre 10 mg de chlorure d’Iodonitrotétrazolium dans 10 mL d’eau pour obtenir une solution de 1 mg/mL. Filtre de stériliser la solution en utilisant un raccord Luer lock avec filtre 0,2 µm attaché à une seringue de 10 mL dans des conditions stériles sous une hotte de culture de tissus.
  10. Dans la hotte de la culture de tissus, ajouter 100 µL de solution colorante goutte autour de la plaque de l’UFC ; Veillez à ne pas glisser ou perturber les colonies. Incuber les boîtes de nuit à un 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules. Les colonies seront vire au brun rougeâtre foncé. À l’aide d’un fond blanc dans la hotte de la culture de tissus stériles, prendre des photos de la plaque d’UFC tachée.

7. transplantation et analyse de la mortalité

  1. Mortellement irradier les souris avec un rayonnement de split en utilisant un 137 Cs base Gamma-ray à un dosage de 7,0 Gy suivie de 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h d’intervalle avant la transplantation.
  2. Transplant 4 x 104 unsorted YFP-positive (calculée sur le pourcentage de YFP) 3 x 105 cellules de moelle osseuse normale comme entreprise dans chaque souris à queue vein injection.
  3. Après une semaine de la transplantation, déterminer la prise de greffe en analysant les cellules YFP-positive du sang périphérique à l’aide de FACS.
  4. Effectuer une purge de veine de queue et des analyses de FACS.
    1. Réchauffer la cage des souris sous une lampe chauffante avec attention de ne pas surchauffer ou brûler.
    2. Empêcher une souris dans une drisse de souris et entailler la veine caudale avec une lame stérile. Le lait doucement la queue d’antérieur postérieur, ce qui permet une goutte de sang à s’accumuler. Recueillir le sang avec un tube capillaire hépariné jusqu'à ce qu’il est rempli (frais virés autour de 75 à 100 µL). Plonger le sang du tube capillaire rempli dans un tube de prélèvement de sang contenant de l’EDTA et bien mélanger.
    3. Lyse des globules rouges en ajoutant 30 – 40 µL de sang à 3 mL de tampon de lyse RBC 1 x (150 mM de chlorure d’ammonium, bicarbonate de potassium 10 mM et 0,13 mM EDTA). Bien mélanger, renversant le tube plusieurs fois. Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min. Spin à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant via un vide et suspendre le culot dans 2 mL de solution de 1 PBS x pour un lavage.
    4. Tourner à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et le suspendre dans un tampon FACS #1. Réaliser FACS analyse comme décrit ci-dessus dans l’étape 5.2.5–5.2.66. Magasin à court terme le sang restant dans le tube de prélèvement, qui peut être utilisé à diverses autres fins, à 4 ° C.
  5. Transplanté de souris qui a montré de 10 à 40 % des cellules positives YFP dans le sang périphérique ont été utilisés pour l’expérience. Les souris qui avaient moins de 2 % des cellules YFP-positives ont été exclus de l’étude.
  6. Préparer le tamoxifène 20 mg/ml dans de l’huile de maïs à 60 ° C avec agitation intermittente jusqu'à dissolution complète et conserver à 4 ° C dans l’obscurité pendant la durée du traitement. Après une semaine de la transplantation, supprimer l’allèle de c-Fosfl/fl en injectant du tamoxifène (100 mg/kg dans l’huile de maïs) par voie intrapéritonéale (i.p.) dans les souris, chaque jour pendant trois jours consécutifs. Il est important que les souris sont pesés pour déterminer combien tamoxifène à injecter. Après le traitement tamoxifène (le cas échéant), les souris pour les traitements médicamenteux de groupe (n = 5/groupe).
  7. Surveiller les souris pour la survie et la progression de la leucémie et déterminer leucémiques fardeau (cellules YFP positives par FACS) hebdomadaire jusqu'à huit semaines chez les survivants des souris.
  8. Analyser le sang pour la suppression de c-Fos où cela est nécessaire, comme décrit ci-dessus à l’article 6. Enregistre le nombre de survivants souris chaque jour et tracer la courbe de survie à la fin de l’expérience en utilisant un logiciel graphique.

8. transgéniques modèle de leucémie BCR-ABL1

  1. Isolement de LSK
    1. Maintenir la souris transgénique Scl-tTA sur chow doxycycline pour empêcher l’expression de BCR-ABL1. Quatre semaines avant la transplantation, prendre les souris hors de la doxycycline chow pour BCR-ABL1 expression.
    2. Isoler les TMNCs du Scl-tTA souris transgéniques comme décrit ci-dessus à l’article 4. Suspendre les TMNCs dans un tampon FACS #2 (solution 1 PBS x + 0,5 % de BSA + 2 mM EDTA) d’obtenir 106 cellules/mL.
    3. Appauvrissent les TMNCs pour les cellules de la lignée positive en ajoutant 10 µL de biotine cocktail de la cellule de détection lineage (biotine-conjugués anticorps monoclonaux contre CD5 [rat IgG2a], CD11b [rat IgG2a], CD45R [B220] [rat IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rat IgG2a] et Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) par 1 x 106 cellules. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 10 min dans le noir, suivi d’un lavage avec 5 mL de tampon de FACS #2 et tourner complètement à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant et suspendre les cellules de 400 µL de tampon de FACS #2.
    4. Ajouter 5 µL de anti-biotine anticorps-FITC conjugué, 1,2 µL de PECy7 Ly-6 a/E (Sca1) et 2,4 µL de CD117 (c-Kit) APC anticorps pour jusqu'à 108 millions de cellules. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min. lavage en mettant le volume jusqu'à 5 mL avec le tampon de FACS #2 ; puis, centrifuger à 1 200 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL de tampon de FACS #2.
    5. Filtrer la suspension de cellules dans un tube avec bouchon à filtre bleu FACS.
    6. Cellules vivantes porte à l’aide de dispersion vers l’avant et latérale. Ensuite, sélectionnez les cellules de lin– qui a montré des IFM (signifie l’intensité de la fluorescence de moins de 102) pour obtenir LSK cellules de c-Kit+ et Sca1+ sur un bi-exponentielle tracer du parent de Lin– et les trier (Figure 7 C).
    7. Recueillir les cellules triées et eux centrifuger à 1 200 x g à 4 ° C pendant 5 min.
  2. Transplantation
    1. Mortellement irradient les souris BoyJ avec une dose de rayonnement de split de 7,0 Gy suivie de 4,75 Gy après 3 h, avant la transplantation.
    2. Injecter 3 x 103 à 5 x 103 BCR-ABL1-LSK él 0,3 x 106 cellules de moelle osseuse d’assistance provenant de souris WT BoyJ via la veine caudale (i.v.) dans les souris irradiées de la BoyJ.
    3. Post-transplantation de quatre semaines, analyser les souris bénéficiaires pour CD45.1 et CD45.2. Obtenir le TMNC du sang périphérique en queue veine saignement comme indiqué au point 7.4. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS. Incuber les cellules avec 1 µL de chaque de l’anticorps CD45.1-FITC et CD45.2-PE à température ambiante pendant 1 h.
    4. Laver les cellules en mettant le volume à 3 mL avec le tampon de FACS et essorage à 1 200 g à 4 ° C pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension il dans 200 µL de solution 1 PBS x.
    5. Analyser le pourcentage de CD45.1 et CD45.2 en premier déclenchement l’issu des nuages de points avant et latéraux, suivie par blocage des cellules positives-FITC et à PE basés sur l’exemple sans coloration des cellules vivantes.
    6. Les souris du groupe en quatre groupes (n = 6 par groupe). Commencer le traitement par l’imatinib (75 mg/kg 2 fois par jour) seuls ou en combinaison avec DFC + BCI (les deux médicaments ont été administrés à une dose de 10 mg/kg 2 fois par jour).
    7. De même, traiter des autres groupes avec des combinaisons de curcumine (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) et imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg), imatinib (75 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) pendant trois mois, 2 fois par jour, par injection i.p.
    8. Analyser les souris 1 fois par mois pendant six mois pour chimérisme leucémique en déterminant le pourcentage de CD45.2 positive de cellules dans le sang périphérique de queue veineuse saignement tel que décrit à l’étape 7,4.

9. en Vivo évaluation de BCI et activité de DFC

  1. Analyse de Phospho-p38
    1. Prenez trois souris leucémiques (âgés de 8 à 12 semaines) qui ont été transplantées avec cellules de c-Kit+ BCR-ABL1-exprimant, comme décrit à l’article 7. Injecter les souris avec BCI (10 mg/kg) par injection i.p. quatre semaines après la transplantation.
    2. Mesurer les niveaux de sang périphérique phospho-p38 TMNC grâce au kit de cytométrie de flux phosphorylation selon les instructions du fournisseur. Recueillir le sang de chaque souris avant et 6 h après l’injection de drogues. Isoler les TMNCs par l’appauvrissement de RBC et les fixer comme suit.
    3. Ajouter 4 mL de solution de lyse RBC par 100 µL de sang périphérique. Mélanger et laisser incuber sur glace pendant 5 min lyser les globules rouges. centrifuger les cellules à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez la lyse 1 x plus.
    4. Après la deuxième étape de lyse, laver les granules cellulaires avec 1 mL de 2 % de BSA dans du PBS. Fixer les cellules en ajoutant 100 µL des solutions de fixation et permeabilization et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité. La cellule a granulé par centrifugation à 1 200 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    5. Laver les boulettes avec 1 mL de 1 x lavage perméabilisation. Bloquer les cellules en ajoutant 300 µL de 2 % de BSA dans le tampon de lavage perméabilisation à température ambiante pour 20 min. diviser les cellules en trois égales aliquotes de 100 µL de chaque (~ 1 x106).
    6. Ajouter 1 µL d’anticorps p-38 total, 1 µL d’anticorps phospho-p38 ou 1 µL d’isotype IgG contrôle, respectivement à chaque aliquote de cellules fixes et incuber une nuit à 4 ° C.
    7. Laver les cellules 1 x 5 ml de BSA 2 % dans du PBS et incuber avec l’anticorps secondaire (1 µL d’Alexa Fluor-488 conjugué) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les cellules 1 x nouveau et suspendez-les dans 200 µL de PBS 1 x.
    8. Acquérir les données de FACS et les analyser par le logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
    9. Déduire l’IMF du contrôle IgG provenant de l’ITSM des échantillons expérimentaux. Les valeurs MFI de phospho-p38 sont ensuite normalisées à celle du total p-38 pour déterminer les niveaux de phospho-p38 après l’injection de BCI.
  2. Analyse de l’expression génétique quantitative des gènes cibles de c-Fos
    1. Prenez trois souris leucémiques (âgés de 8 à 12 semaines), qui ont été transplantées avec BCR-ABL1-c-Kit+ les cellules exprimant tel que décrit à l’article 7. Recueillir le sang périphérique de chaque souris et les souris puis injecter 10 mg/kg chacun de DFC + BCI.
    2. Recueillir le sang périphérique 6 h après l’injection de drogues. Isoler les TMNCs par l’appauvrissement de RBC, tel que décrit ci-dessus. Les TMNCs de granule et suspendez-les dans un tampon de lyse axée sur le phénol (voir Table des matières).
    3. Effectuer l’analyse RT-qPCR (tel que décrit à l’article 1) pour Bcl2l11, FRV et IL-6 en utilisant des amorces de gène-spécifique (voir tableau 1).

10. à long terme qui lance Culture Cell Assay

Remarque : Un test LTCIC a été réalisé comme décrit plus haut25.

  1. Cultiver une lignée de cellules de fibroblastes de souris MS-5 en MEMα à confluence dans une fiole de vitroplants T175. Trypsinize les cellules comme décrit ci-dessus pour HEK293T. Suspendre les cellules en MEMα à 2 x 106 cellules/mL. Prenez 10 x 106 cellules dans un tube conique de 50 mL et irradier à 80 Gy. Diluer les cellules à 0,5 x 106 cellules/mL dans MEMα additionné de médias FBS (M10) de 10 %. Plaque 2 mL par puits dans une plaque de 12 puits et incuber il en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur du jour au lendemain.
  2. Le lendemain, préparer l’hémisuccinate de sodium d’hydrocortisone en dissolvant 2,5 mg dans 5 mL de MEMα (solution à 1 M). Filtre-stériliser la solution d’hydrocortisone en utilisant un filtre de seringue 0,2 µm dans le capot de la biosécurité. Diluer l’hydrocortisone par dilution en série en MEM pour obtenir une solution de 100 µM. Ajouter 250 µL de cela dans 25 mL de milieu de culture à long terme humain (HLTM) (voir la Table des matières) juste avant d’utiliser, pour obtenir une concentration finale de 1 µM.
  3. Tournez en bas la CML-CD34+ et TMNCs UCP3 et suspendez-les dans la HLTM au vortex brève et déterminer les chefs d’accusation par un hémocytomètre.
  4. Passer l’aspirateur sur les médias M10 de la plaque de 12 puits ensemencée avec des cellules du stroma et remplacez-le par le 1 mL de cellule patient (LMC-CD34+ [10 000] et UCP3 TMNCs [1 x 106]) suspension dans HLTM. Utilisez trois puits par combinaison de médicaments par type de cellule.
  5. Diluer les stocks de médicaments à 2 x la concentration nécessaire dans HLTM. Ajouter 1 mL des médias avec des médicaments dans les cellules mentionnées ci-dessus pour obtenir une concentration de drogue 1 x. Remplacer la moitié des médias par HLTM fraîchement préparé chaque semaine pendant cinq semaines.
  6. À la fin de la période de test de LTC-IC de six semaines, prélever les cellules non adhérentes dans un tube de cultures. Trypsinize cellules adhérentes et les combiner avec les cellules non adhérentes correspondantes.
  7. Laver les cellules et les analyse pour UFC en méthylcellulose moyen contenant 30 % sérum de veau foetal, érythropoïétine (3 unités/mL), SF (50 ng/mL) et IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes/macrophage (GM-CSF) (20 ng / mL). déterminer les chefs d’accusation par un hémocytomètre.
  8. Plaque de 5 x 104 cellules en trois répétitions. Geler les cellules restantes dans le DMSO de FBS et 10 % 20 % vers le bas. Disposer les plaques dans une grande boîte de pétri avec une capsule ouverte contenant de l’eau au milieu. Couvrir la grande boîte de pétri avec soin et il incuber dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant deux semaines.
  9. Marquer les colonies des deux semaines plus tard. Dans certains cas, qu’une partie de la récolte est essayée pour UFC). Calculer que le nombre total des LTCIC présent dans la suspension de la cellule initiale par extrapolation basée sur l’UFC obtenus d’une partie de la récolte de la cellule. La production moyenne d’UFC par FLC-IC est 8.
    Remarque : Par exemple, si initialement 1 x 106 cellules ont été cultivées dans un puits, après cinq semaines, 0,5 x 106 cellules ont été récoltées et pour l’UFC, 5 x 104 cellules étaient plaqués et 50 UFC ont été obtenus. Cela équivaut à 500 UFC/1 million de cellules plaqué. Divisez ce nombre par 8 pour obtenir la LTCIC, qui est de 62,5.

11. humanisé modèle de souris à l’aide de CML CD34 cellules+

  1. A irradier les souris gamma NOD scid semaines 8, exprimant IL3 humaine, GM-CSF et SCF (commissions), avec une dose unique de 7,0 Gy (700 rads) avec 50 propulseurs en l/min.
  2. Injecter 3 x 106 CD34+ les cellules sélectionnées de patients en phase chronique de LMC BCR-ABL1 dans les souris irradiées par injection intraveineuse.
  3. Après deux semaines de la transplantation, déterminer leucémique prise de greffe de moelle osseuse de FACS en utilisant des anticorps spécifiques à la souris et l’homme contre CD45.
  4. Effectuer une analyse de FACS.
    1. Prendre l’aspirat de moelle osseuse des fémurs des souris transplantées. Lyse des globules rouges à l’aide de tampon de lyse de RBC comme décrit ci-dessus et de recueillir les TMNCs par centrifugation. Laver le culot 1 x avec du PBS 1 x contre le rhume.
    2. Bloquer les cellules avec blocs de FcR humaine et souris FcR suivi par coloration avec anti-homme CD45 FITC et anti-souris CD45 APCCy7 durant la nuit à 4 ° C. Effectuer l’analyse de FACS sur LSRII et analyser les données à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
  5. Regrouper les souris dans quatre différentes cohortes (n = 6/groupe) pour le traitement avec le véhicule, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (tous deux à 10 mg/kg), ou imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (tous deux à 10 mg/kg). Diluer les médicaments en stock dans du PBS 1 x (véhicule) et de leur administrer en leur injectant i.p. 2 fois par jour.
  6. Traiter les souris pendant six semaines et déterminer la charge leucémique toutes les deux semaines, jusqu'à huit semaines après la transplantation, comme décrit ci-dessus dans 11,4.

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Representative Results

Dépendance de l’oncogène a été impliquée dans l’efficacité thérapeutique des inhibiteurs. Cependant, les mécanismes de la dépendance de l’oncogène de conduite ne sont pas comprises. Nous avons effectué plusieurs analyses d’expression de gène impartiale afin d’identifier la composante génétique impliqué dans l’orchestration de la dépendance. Ces analyses ont révélé l’upregulation de trois gènes c-Fos, Dusp1 et Zfp36, dans les cellules cancéreuses qui ne sont pas tributaires de l’oncogène de signalisation pour la survie et, donc, sont insensibles au traitement TKI. La diminution de l’expression de c-Fos et Dusp1 par précipitation induite par le Sharn est suffisante pour restaurer la sensibilité aux médicaments en résistant TKI autrement les cellules.

Pour valider le rôle de c-Fos et Dusp1 comme cible thérapeutique dans la leucémie, leur surexpression a été tout d’abord confirmée en utilisant BaF3 les cellules exprimant l’oncogène BCR-ABL1. Facteur de croissance de signalisation dans les cellules BaF3-BA abroge la dépendance de l’oncogène ; en conséquence, ils ne répondent pas au traitement TKI. Analyse de l’expression quantitative de la RT-qPCR et éponger occidental a confirmé que les deux c-Fos et Dusp1 sont induits par la BCR-ABL1 et leur expression est encore augmentée par le facteur de croissance IL-3 (Figure 1 a - 1C).

Pour étudier le rôle de c-Fos et Dusp1 in vivo, souris dépourvues de c-Fos (conditionnel souris modèle c-Fosfl/fl avec Rosa26-CreERT2) ou Dusp1 (droites KO Dusp1- / -) et les souris dépourvues de c-Fos et Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) ont été développés. Ces souris ont été génotypés par PCR à l’aide de l’ADN génomique de la queue et la PCR distingue facilement le c-Fosfl/fl, Dusp1 KO des souris WT (Figure 2A). La suppression induite de c-Fos par traitement tamoxifène a été confirmée par PCR, par l’apparition d’une bande par rapport à aucune bande chez les souris non traitées par le tamoxifène (Figure 2B).

Pour évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1, les cellules de moelle osseuse c-Kit+ de la WT, Dusp1- / -, c-Fosfl/fl, et Dusp1- / -/c-Fosfl/fl ont été isolés et transduites avec MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP rétrovirus ; une représentation schématique de la procédure est illustrée à la Figure 3. YFP+ exprimant (utilisé comme marqueur pour l’expression de la BCR-ABL1) auraient été triées par FACS (Figure 4) pour plus amples in vitro (CFU) et des essais in vivo. Les résultats montrent que la suppression de c-Fos et Dusp1 seul inhibée numéros de CFU (< 50 %). Fait intéressant, cellules dépourvues de c-Fos et Dusp1 ont été sensiblement compromis dans leur capacité de formatrices et traitement imatinib anéanti tous les UFC, ce qui suggère que la perte de c-Fos et Dusp1 est synthétiquement létale à BCR-ABL1 expression (Figure 5 ).

Les essais in vitro de la CFU permettent aux chercheurs de tester rapidement le phénotype de la KO et l’activité des inhibiteurs de petites molécules. Cependant, outre l’analyse in vivo confirmera la validité des objectifs. Pour la validation in vivo, nous avons utilisé tout d’abord un rapide transduction transplantation modèle1 où BCR-ABL1 provoque une mortalité dans les deux ou trois semaines. Cinquante mille cellules de YFP-positives, ainsi que 300 000 – 500 000 dérivés de la moelle osseuse des cellules mononucléaires de la souris normale, ont été injectées à des souris mortellement irradiés pour induire la LMC. Les souris portant les cellules c-Fosfl/fl ou cellules c-Fosfl/flDusp1- / - ont été injectés par le tamoxifène après 10 jours de transplantation pour supprimer le c-Fos. Souris qui ont reçu des cellules- / - WT ou Dusp1 développé une leucémie et a succombé à la mort dans les deux à quatre semaines, tandis que la suppression de c-Fos seul a montré un retard significatif dans le développement de la maladie et le traitement de TKI près de 50 % des souris a sauvé de la mort. Fait intéressant, les souris transplantées avec cellules dépourvues de c-Fos et Dusp1 ont survécu plus longtemps, et le traitement de TKI guérie toutes les souris de la CML (Figure 6 a - 6c). Les souris qui ont survécu progressivement perdu les cellules YFP+ , comme indiqué dans c-Fos et double KO lorsque traités par l’imatinib (Figure 6-6F), suggérant la clairance du BCR-ABL1 cellules positives.

Étant donné que la LMC est une maladie des cellules souches, et compte tenu de l’incapacité des rétrovirus pour cibler les cellules hématopoïétiques primitives et repos, il est impératif pour vérifier si le ciblage de c-Fos et Dusp1 serait suffisant pour éliminer les cellules souches leucémiques. Tétracycline-inducible BCR-ABL1 des souris transgéniques où tTA est exprimée par un exhausteur de Scl, spécifiquement exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques, ont été précédemment utilisés pour étudier le rôle des gènes cibles en CSL. Les tétracycline-inducible BCR-ABL1 des souris transgéniques (Figure 7 a-7 b) ont été utilisés pour étudier le rôle de c-Fos et Dusp1 en CSL. Les cellules LSK de ces souris ont été triées à l’aide de FACS et injecté dans les souris destinataires (Figure 7C). Après un mois de la greffe, greffe leucémique a été marqué, suivie du traitement de la toxicomanie. Le fardeau leucémique et les niveaux de LSK on a déterminé tous les mois pendant six mois. Souris traitement par l’imatinib seul ont montré une suppression de la leucémie, mais se sont retrouvés avec le MRD. Par conséquent, interruption du traitement, tel qu’observé dans la clinique, a abouti à la rechute de la maladie. En revanche, des souris traitées avec une combinaison de médicaments imatinib + DFC (inhibiteur de c-Fos) + BCI (inhibiteur de la Dusp1) complètement éradiqué les cellules leucémiques et les souris ont été guéris de la LMC (Figure 7 et 7E).

Pour établir l’affichage pharmaco-dynamique de c-Fos et inhibiteurs de la Dusp1 et à l’étude de leur effet sur la cible, niveaux de phospho-p38 (marqueur de l’inhibition Dusp1) ont été mesurés et l’expression des gènes c-Fos-réglementées, telles que l’IL-6, bcl2l11 et FRV, On a quantifié. Nous et autres avons établi que l’inhibition de la Dusp1 aboutit à l’activation de p38 (mesurée par la phosphorylation accrue de p38)13. Phospo-p38 concentrations ont été mesurées par FACS dans les cellules de sang prélevés chez les souris traitées à la drogue. Comme prévu, les niveaux de phospho-p38 a augmenté (Figure 8A) et l’expression des gènes c-Fos-réglées (IL-6, bcl2l11 et FRV) ont été réprimés dans les souris traitées au médicament (Figure 8B). Ces résultats suggèrent que les inhibiteurs inhibent leur cible et la survie de souris est due à l’inhibition de c-Fos et Dusp1.

Pour la pertinence, l’efficacité de c-Fos et inhibiteurs de la Dusp1 ont été testés à l’aide d’échantillons de patients in vitro (FLC-IC) et des essais in vivo (xénogreffes de souris). Le traitement avec DFC + BCI n’est pas efficace sur les cellules souches leucémiques. Toutefois, une combinaison de DFC + BCI + imatinib éradiquer sélectivement les cellules souches leucémiques dans les deux tests tout en épargnant les cellules normales de la tige (Figure 9 a - 9 C). Ces résultats établissent que c-Fos et Dusp1 sont essentiels pour la transformation leucémique et une expression élevée de ces gènes abroge la dépendance oncogène aboutissant à la rechute de la maladie et la résistance aux médicaments. Par conséquent, un ciblage combinatoire de c-Fos et Dusp1 ainsi que de l’oncogène pilote sera plus efficace et, peut-être, une stratégie curative pour nombreux cancers. Nous prévoyons que les méthodes décrites ici peuvent en général être appliquées pour la validation et l’identification des cibles supplémentaires.

Figure 1
Figure 1 : c-Fos et Dusp1 sont surexprimés en réponse au facteur de croissance IL-3. qPCR analyse d’une surexpression de (A) c-Fos et Dusp1 (B) dans les cellules BaF3-BA cytokine traitées. L’expression relative a été déterminée après normalisation de β-actine. Les barres d’erreur représentent l’écart de trois échantillons répétés. Analyse par Western blot (C) des cellules BaF3-BA traités avec l’IL-3 et sondés avec c-Fos total ou anticorps P-c-Fos et Dusp1. Anticorps anti-actine fut utilisée comme contrôle de chargement. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Kesarwani Al.13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Génotypage des souris c-Fosfl/flDusp1 et Rosa cre-ER. Analyse (A), PCR de l’ADN de la queue. Attendre les bandes sont de poids ou de la c-Fosfl/fl-transportant CreER transgene et souris Dusp1 KO. Les tailles sont indiquées sur la gauche. (B), PCR analyse d’une bande plus petite après la suppression de c-Fos avec traitement tamoxifène. M = 1 Ko + échelle d’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schématique du modèle transduction et transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : FACS montrant la fréquence des cellules YFP+ du sang d’un transplanté et une souris WT (témoin négatif). Les panneaux supérieurs montrent un diagramme de dispersion des cellules et le processus de blocage. Les panneaux inférieurs montrent des histogrammes de YFP vs diffusion latérale. Cellules avec une IMF de > 103 étaient considérés comme YFP +. Un blocage similaire a été utilisée pour les cellules de la moelle osseuse après transduction pour calculer la pourcentage de transduction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Plaques représentant de placage à l’UFC. Les plaques montrent les colonies tachés avec chlorure d’iodonitrotétrazolium. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : c-Fos et carences Dusp1 nuire au développement de la leucémie. (A-C) Les courbes de survie de souris transplantées avec c-Kit+ BCR-ABL1 cellules de WT, Dusp1- / -c-Fos- / -et c-Fos- / - Dusp1- / - souris. (D-E) Pourcentage de cellules YFP + tel que déterminé par FACS dans le sang périphérique des souris transplantées tirée après la transplantation chaque semaine. Augmentent les niveaux de la YFP et les souris succombent à la mort comme dans les versions WT et Dusp1 KO. Les souris qui survivent progressivement perdent les cellules YFP+ comme indiqué dans c-Fos et double KO lorsque traités par l’imatinib. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Kesarwani . et al. 13. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : c-Fos et Dusp1 sont requis pour la survie de la CSL. (A) représentation schématique du transgène utilisé chez des souris transgéniques exprimant BCR-ABL1 dans les cellules souches. (B) le modèle expérimental pour étudier les effets de Dusp1 et de c-Fos inhibition par DFC et BCI in vivo. FACS (C) les parcelles de la stratégie de blocage de balançoire utilisée pour le tri des cellules LSK destinés à la transplantation. (D) pourcentage des cellules positives BCR-ABL1 (déterminé par le pourcentage de CD45.2 de souris donneur) chez les souris pendant et après le traitement avec des inhibiteurs. (E), FACS diagrammes montrant le chimérisme CD45 dans des cellules vivantes, ainsi que dans le compartiment de cellules LSK. Veuillez noter le manque de CD45.2 au total et dans le compartiment de LSK chez les souris traitées. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Kesarwani Al.13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: activité In vivo du DFC et BCI. (A) ligne graphique montrant les niveaux de phospho-p38 après traitement de BCI. (B) RT-qPCR montrant l’expression des gènes c-Fos cible dans le sang périphérique des souris après le traitement de la DFC. Les points représentent les trois répétitions de chaque souris (n = 3). Le nombre au-dessus des diagrammes représentent la p-valeur calculée par de Student t-test. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Kesarwani Al.13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Rôle de c-Fos et l’inhibition de la DUSP1 dans un échantillon de patients humain. (A) pourcentage d’UFC, déterminée par l’essai de LTC-IC de deux patients atteints de LMC et un donneur sain traités avec le véhicule ou les combinaisons de médicaments indiqués. (B) le pourcentage de cellules leucémiques humaines (hCD45) dans la moelle osseuse de souris de commissions à la semaine 2 (à gauche) et 4 (à droite) la semaine du traitement. (C) ce panneau affiche représentant FACS parcelles, montrant une réduction dramatique des cellules de hCD45 chez les souris traités tout en épargnant la souris cellules montrés comme mCD45. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Kesarwani Al.13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La plus grande partie des cellules cancéreuses, la réponse thérapeutique au TKI est médiée par un blocus de tyrosine-kinase-oncoprotéine signaux dont la tumeur est accro. Cependant, relativement peu est connu sur une minorité de cellules cancéreuses contribuant au MRD comment échapper à la dépendance et la thérapie d’oncogène4. Des études récentes ont révélé que la signalisation du facteur de croissance Médie pharmacorésistance dans la leucémie et de tumeurs des organes pleins. Ceci suggère que différents mécanismes moléculaires pourraient sous-tendre résistance intrinsèque10,11,12. Pour comprendre le mécanisme et d’identifier les gènes cibles de développement thérapeutique, nous avons réalisé des profils d’expression du génome entier complète à l’aide de la souris (BaF3) et les cellules humaines (K562). Des échantillons primaires de souris leucémiques ou les patients atteints de LMC n’étaient pas utilisés car nous avons soupçonné que, comme des échantillons de moelle osseuse primaire sont significativement hétérogènes, ils peut masquer l’identité des gènes/objectifs pertinents. Même les cellules purifiés par humoral tri (cellules souches et progénitrices) présentent une hétérogénéité significative. Par conséquent, une lignée cellulaire purifiée est probablement mieux adaptée pour l’identification de la cible éviter n’importe quelle complexité indésirable imposée par une hétérogénéité génétique. L’analyse de l’expression du génome entier indiqué que c-Fos, Dusp1 et Zfp36 sont couramment positivement en cellules résistantes aux médicaments. Une fois les cibles identifiées, leur validation devient un élément essentiel de reconnaître leur rôle dans le contexte génétique donné. À l’aide de surexpression de l’ARNC et études knockdown génétiques dans les cellules de BaF3 a révélé que l’inhibition de c-Fos et Dusp1 est suffisante et nécessaire pour la sensibilité TKI efficace. Peut-être une des étapes plus critiques dans la validation de la cible est de valider la pertinence des gènes/cibles identifiées dans les échantillons primaires de souris et l’homme. Dans ce protocole, nous fournissons utilisation étape par étape de multiples modèles génétiques et éclairerait mieux mécaniste pour l’affinement de l’évaluation de médicaments/cible.

Un dépistage rapide au niveau cellulaire utilisant l’UFC ou le dosage LTCIC aide les chercheurs à tester plusieurs combinaisons de médicaments, ainsi que les concentrations, rapidement avant d’aller au plus des méthodes de transplantation chronophage. Étant donné que la LMC est une maladie des cellules souches, et compte tenu de l’incapacité des rétrovirus pour cibler les cellules hématopoïétiques primitives et repos, il est impératif de tester à l’aide de modèles qui portent directement sur leur rôle dans la survie de la LSC. Pour y remédier, nous avons utilisé une souris transgénique de tétracycline-inducible BCR-ABL où tTA est exprimée par un enrichisseur de Scl. Néanmoins, les modèles génétiques sont déficients en récapitulant la maladie humaine. Par conséquent, il est nécessaire de tester les échantillons de patients primaires dans des modèles murins humanisés. Toutefois, pour être en mesure de faire une étude à long terme pour la détection de MRD au fil du temps, une xénogreffe stable est nécessaire qui, selon les souris et les cellules types, peuvent varier. Après quatre mois de transplantation, les cellules CD34 + humaines étaient épuisés même sans le traitement de la toxicomanie, qui est une limitation dans les modèles de souris plus humanisés. De meilleurs modèles souris humanisée élaborent pour tester les cellules humaines en souris26. Nous recommandons fortement détermination de l’activité sur la cible des inhibiteurs comme n’importe quel effet hors cible peut provoquer une toxicité pour les cellules normales, limitant son application supplémentaire. Toutefois, si la cible en aval n’est pas connue, différentes approches devraient être utilisés. Par exemple, identifier les mutants résistants aux médicaments à l’aide de mutagénèse aléatoire de la protéine cible peut gérer directement si l’inhibiteur est le27de la cible.

Le protocole présenté ici offre une méthode complète pour l’identification des cibles et de validation à l’aide de multiples systèmes de modèles in vitro et in vivo . Ces méthodes peuvent être facilement adaptés à d’autres cibles et les types de cancer. Plus mécaniste recensée sur cibles, et le raffinement dans le ciblage de médicament peut aider à développer mieux les modalités thérapeutiques pour le traitement efficace et/ou curative.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants à G. Q. Daley pour fournir les cellules BaF3 et WEHI et T. Reya pour la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP construit. Les auteurs sont reconnaissants à M. Carroll pour fournir les échantillons de patients de la crise blastique CML. Cette étude a été financée par des dons à M.A. de la NCI (1RO1CA155091), la Leukemia Research Foundation et la fondation de V et du NHLBI (R21HL114074-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Materials
RPMI Cellgro (corning) 15-040-CV
DMEM Cellgro (corning) 15-013-CV
IMDM Cellgro (corning) 15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment Takara T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) Stem Cell 3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) Stem Cell 4434
4-Hydroxytamoxifen Sigma H6278
Recombinant Murine SCF Prospec CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand Prospec CYT-340
Recombinant Murine IL-6 Prospec CYT-350
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17
DFC LKT Laboratories Inc. D3420
BCI Chemzon Scientific NZ-06-195
Imatinib LC Laboratory I-5508
Curcumin Sigma 458-37-7
NDGA Sigma 500-38-9
Penn/Strep Cellgro (corning) 30-002-CI
FBS Atlanta biological S11150
Trypsin EDTA 1x Cellgro (corning) 25-052-CI
1x PBS Cellgro (corning) 21-040-CV
L-Glutamine Cellgro (corning) 25-005-CL 5 mg/mL stock in water
Puromycin Gibco (life technologies) A11138-03
HEPES Sigma H7006
Na2HPO4.7H2O Sigma S9390
Protamine sulfate Sigma P3369 5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%) Sigma T8154
DMSO Cellgro (corning) 25-950-CQC
WST-1 Roche 11644807001
0.45 μM acro disc filter PALL 2016-10
70 μm nylon cell stariner Becton Dickinson 352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) Simga 1083
PBS Corning 21040CV
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail Roche CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5762
Nitrocullulose Membrane Bio-Rad 1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) Thermo Scientific 34075
CD5 eBioscience 13-0051-82
CD11b eBioscience 13-0112-75
CD45R (B220) BD biosciences 553092
CD45.1-FITC eBioscience 11-0453-85
CD45.2-PE eBioscience 12-0454-83
hCD45-FITC BD Biosciences 555482
Anti-Biotin-FITC Miltenyi 130-090-857 
Anti-7-4 eBioscience MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) eBioscience 13-5931-82
Anti-Ter-119 eBioscience 13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 BD  558612
CD117 APC  BD  553356
BD Pharm Lyse BD  555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) BD  554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow) BD  554723
phospho p38 Cell Signaling Technologies 4511S
total p38 Cell Signaling Technologies 9212
Mouse IgG control BD  554121
Alexa Flour 488 conjugated  Invitrogen A-11034
Calcium Chloride Invitrogen K278001
2x HBS Invitrogen K278002
EDTA Ambion AM9261
BSA Sigma A7906
Blood Capillary Tubes Fisher 22-260-950
Blood Collection Tube Giene Bio-One 450480
Newborn Calf Serum Atlanta biological S11295
Erythropoiein Amgen 5513-267-10
human SCF Prospec CYT-255
Human IL-3 Prospec CYT-210
G-SCF Prospec CYT-220
GM-CSF Prospec CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay) Stem Cell Technologies 5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate Stem Cell Technologies 7904
MEM alpha Gibco 12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 Becton Dickinson 329461
Mortor pestle Coor tek  60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM) Butler Schien 29405
SOC New England Biolabs B90920s
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar) Difco 214050
Terrific broth Becton Dickinson 243820
Agarose Genemate E-3119-500
Doxycycline chow TestDiet.com 52662 modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline 
Tamoxifen Sigma T5648
Iodonitrotetrazolium chloride  Sigma I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit Qiagen 69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) Promega M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit) Qiagen 217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) Ambion, Life Technologies AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) Invitrogen 18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) Bio-Rad 1725270
CD117 MicroBead Kit Miltenyi 130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R Eppendorf
TC-10 automated cell counter Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2 Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) Bio-RAD 17001401
Hemavet (boold counter) Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer) BD 
Fortessa I (FACS analyzer) BD 
FACSAriaII (FACS Sorter) BD 
Magnet Stand Miltenyi
Irradiator  J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA Mark I Model 68A source Cs 137
Mice
ROSACreERT2 Jackson Laboratory
Scl-tTA  Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ  mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6  Jackson Laboratory
NSGS mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-  Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Made in house
Cells
BaF3 Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells University Hospital, University of Cincinnati

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References

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  24. SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
  25. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
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Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène
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Kesarwani, M., Kincaid, Z., Azam, M. Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (143), e58194, doi:10.3791/58194 (2019).

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