Summary
هنا، نحن نوظف أسلوب استخراج (فو) ماء الساخن مضغوط، الذي يستخدم آلة اسبرسو منزلية غير معدلة لتعريف الطلاب الجامعيين بكيمياء المنتجات الطبيعية في المختبر. يتم عرض تجربتين هما: فو الاوجينول وأسيتيليوجينول من القرنفل وفو سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين من النباتات الأسترالية محدبة كوريا.
Abstract
قد أيضا العثور على أسلوب استخراج (فو) وضعت مؤخرا ماء الساخن مضغوط الذي يستخدم آلة اسبرسو منزلية غير معدلة لتيسير البحث بالمنتجات الطبيعية التطبيقات كأداة تعليمية فعالة. على وجه التحديد، قد استخدمت هذا الأسلوب لإدخال الطلاب الجامعيين في السنة الثانية والثالثة إلى جوانب كيمياء المنتجات الطبيعية في المختبر. ويرد في هذا التقرير، تجربتين هما: فو الاوجينول وأسيتيليوجينول من القرنفل وفو سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين من الأنواع النباتية المتوطنة الأسترالية محدبة كوريا. عن طريق استخدام فو في هذه التجارب، حصل استخراج النفط الخام القرنفل، أثرت في الاوجينول وأسيتيليوجينول، في 4-9% w/w من القرنفل من الطلاب الجامعيين في السنة الثانية وسيسيلين (+)-ابوكسيسوبيروسين كانت معزولة في غلة تصل إلى 1.1% w/w و 0.9% w/w من جيم-محدبة من طلاب السنة الثالثة. ممارسة السابقة قد وضعت كبديل لتوفير مدخل إلى تقنيات الاستخراج والانفصال، بينما النشاط الأخير ظهرت أساليب التدريس توجيه التحقيق في محاولة لمحاكاة التجربة تقطير البخار التقليدية المنتجات الطبيعية التنقيب البيولوجي. هذا مستمد أساسا من الطابع السريع لهذه التقنية فو بالنسبة إلى أساليب الاستخراج التقليدية التي غالباً ما تكون غير متوافق مع ضيق الوقت المرتبطة بتجارب المختبرات الجامعية. يمكن استخدام هذا الأسلوب فو السريع والعملي لكفاءة عزل فئات مختلفة من الجزيئات العضوية من مجموعة من الأنواع النباتية. كما تبين سابقا الطبيعة التكميلية لهذا الأسلوب مقارنة بالأساليب التقليدية.
Introduction
عزل وتحديد المنتجات الطبيعية ذات أهمية أساسية للمجتمع العلمي والمجتمع عموما. 1 التنقيب البيولوجي، البحث عن قيمة الجزيئات العضوية الموجودة في الطبيعة، وتظل عملية لا غنى عنها في اكتشاف خيوط جديدة من المخدرات والعقاقير العلاجية المحتملة. ويقدر، من عام 1981-2014، كانت ~ 75 ٪ من جميع العقاقير الصيدلانية المعتمدة جزيء صغير المنتجات الطبيعية، الطبيعية المستمدة من المنتجات الطبيعية أو المنتجات المستوحاة. 1 علاوة على ذلك، تمتلك المنتجات الطبيعية الهائلة التنوع الهيكلي والكيميائية. لهذا السبب، فإنها تمثل أيضا قيمة السقالات الكيميائية التي يمكن استخدامها مباشرة في توليف العضوية أو في وضع يغاندس مراوان والمواد الحفازة. 2 , 3
تقليديا، كانت إجراءات الوقت كثيفة نسبيا مثل تعطن واستخراج سوكسهليت والتقطير بالبخار الدعامة الرئيسية للبحوث التي تركز على عزل نواتج الأيض الثانوية من النباتات. 4 تقنيات الاستخراج الحديثة، بما في ذلك استخراج المذيبات المعجلة، ركزت على تخفيض أوقات الاستخراج ووضع بروتوكولات أكثر اخضرارا. 4 , 5 في عام 2015، ذكر طريقة استخراج (فو) ماء الساخن مضغوط الأصلي. 6 توظيف هذه التقنية آلة اسبرسو منزلية غير معدلة لتيسير استخراج حمض شيكيميك سريعة وفعالة لا سيما من الينسون. صممت آلات اسبرسو تحديداً وإجراء هندسة عكسية لاستخراج الجزيئات العضوية من حبوب البن الأرضي على نحو ملائم. ولتحقيق هذا، وهذه الصكوك تسخين الماء عند درجات حرارة تصل إلى 96 درجة مئوية وفي الضغوط من شريط 9 عادة. 7 مع وضع هذا في الاعتبار، ربما لا غرابة أن اسبرسو آلات يمكن أن تستخدم بكفاءة استخراج المنتجات الطبيعية من بين مجموعة من المواد النباتية.
قد أثبتت الدراسات اللاحقة التي تشمل مجموعة متنوعة من أنواع النباتات الأرضية قدرة هذه التقنية فو على كفاءة استخراج المنتجات الطبيعية عبر مجموعة واسعة نسبيا من الأقطاب. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 وعلاوة على ذلك، المركبات المحتوية على المجموعات الوظيفية حساسة نوعا ما، مثل الألدهيدات، ايبوكسيدات، جليكوسيدات، ويحتمل أن تكون ستيريوجينيك ابيميريزابل مراكز كانت تتأثر عادة بعملية الاستخراج. كما تجلى الطابع التكميلي لهذا الأسلوب مقارنة بالأساليب التقليدية. 12 , 16 أيضا وقد استخدم "فو هذا" الأسلوب لعزل كميات غرام متعددة من المنتجات الطبيعية، التي استخدمت لتحضير مشتقات المنتجات الطبيعية الرواية وفي تركيب جزيء معقدة أكثر عموما. 8 , 11 , 17
اعتبر أن هذا الأسلوب فو جديدة يمكن أن تخدم كأداة تعليمية مفيدة يمكن إدراجها في المختبرات الجامعية. هذا مستمد أساسا من الطابع السريع لهذه التقنية بالنسبة لأساليب الاستخراج التقليدية التي غالباً ما تكون غير متوافق مع ضيق الوقت المرتبطة بتجارب المختبرات الجامعية. ونتيجة لذلك، هذا الأسلوب محل التجربة مختبر الكيمياء الجامعية التقليدية تركز على استخراج الاوجينول من القرنفل توظيف التقطير بالبخار في جامعة تسمانيا. 9 , 18 ومنذ ذلك الوقت، الاختلافات في هذه التجربة اعتمدتها جامعات أخرى وتجربة تعديل التركيز على فو القرنفل الآن الميزات في برنامج مختبر الكيمياء الجامعية في جامعة سيدني (راجع أدناه ).
من أجل البرهنة على إمكانية التطبيق العملي والجدوى من توظيف هذا النهج فو جديدة لأغراض تعليمية، تعرض اثنين من البروتوكولات كجزء من هذه الدراسة. الجزء الأول من هذا التقرير يسلط الضوء على تجربة على فو الاوجينول وأسيتيليوجينول من القرنفل وجزء من برنامج السنة الثانية المختبرات الجامعية في جامعة سيدني (الشكل 1). ويقدم هذه التجربة لتعريف الطلاب على كيمياء المنتجات الطبيعية أثناء تطوير المهارات العملية الأساسية. ويضم الجزء الثاني تجربة على فو الأنواع النباتية الأسترالية المتوطنة محدبة كوريا الذي جزء من برنامج السنة الثالثة المختبرات الجامعية في جامعة تسمانيا (الشكل 2). تم تصميم هذه التجربة لمحاكاة المنتجات الطبيعية التنقيب البيولوجي وتعزيز التقنيات المختبرية الأساسية. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: فمن المستحسن أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء دخان. يجب على الطلاب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات في المختبر ويجب استشارة كشوف بيانات السلامة (SDS) المرتبطة بكل كاشف قبل الاستخدام.
1-فو قرنفل: عزل الاوجينول وأسيتيليوجينول
- استخراج الاوجينول وأسيتيليوجينول من القرنفل
- ضع خشونة الأرض قرنفل (12.5 غ) في كوب 250 مل.
- إضافة الرمال (12.5 غ) إلى يطحن القرنفل ومزيج جيد.
- جمع من بورتافيلتير (حجرة العينة) وتحميل السلة مع خليط القرنفل والرمل كامل. ضغط العينة مع العبث إصابات طفيفة.
ملاحظة: لا يتم ضغط الخليط كثيرا أو لا سوف تدفق السائل من خلال. - ضع بورتافيلتير في آلة اسبرسو وكوب 250 مل نظيفة تحته. إضافة حل2س إيثانول/ح 30% إلى خزان المياه آلة اسبرسو إذا كان أقل من نصف كامل.
- استخدام آلة اسبرسو لجمع 100 مل الاستخراج.
ملاحظة: استشارة مدرب إذا ظهر الجهاز يكون انسداد. - تسمح بورتافيلتير إنهاء نازف ومن ثم إزالته من آلة اسبرسو.
تنبيه: يطحن والمناطق المحيطة بها المعادن ستكون ساخنة. - باستخدام ملعقة، إزالة يطحن القرنفل من بورتافيلتير وتجاهل في سلة النفايات.
- شطف من المواد الصلبة المتبقية من بورتافيلتير مع ح2س تحت حنفية في بالوعة وإعادته للشخص القادم لاستخدامها.
- بارد القرنفل استخراج في حمام الثلج حتى انخفضت درجة الحرارة إلى مالا يقل عن 30 درجة مئوية.
- ضع النص المقتبس في قمع سيباراتوري 250 مل وإضافة 30 مل الهكسين وهزه برفق.
- مكان القمع فصل في المشبك خاتم مزودة بموقف معوجة والسماح للطبقات المائية والعضوية لفصل ثم جمع الطبقة المائية (السفلي) العودة إلى كوب 250 مل.
ملاحظة: يمكن أن يستغرق 10 دقائق للطبقات لفصل. وينصح الطلاب القيام بعمليات التحسين المذيبات من تلكس أثناء انتظار الفصل الأول تحدث (انظر الخطوات 1، 2). - نقل الطبقة العضوية (العليا) (الذي يحتوي على المنتج) قارورة نظيفة 250 مل مخروطية، وصب الطبقة السفلي (المائية) ثم العودة إلى القمع سيباراتوري.
- استخراج الطبقة المائية زيادة مرتين مع الهكسين (2 × 30 مل).
- دمج الطبقات (العلوي) العضوية في قارورة نفس بعد كل استخراج.
- بعد استخراج سائل الثالث، من أجل استخراج العضوية المشتركة في القمع سيباراتوري، وتغسل مع 100 مل ح2س طريق تهتز بقوة. جمع الطبقة (العلوي) العضوية إلى قارورة مخروطية تنظيف 250 مل والجاف بإضافة مجسو4 ويحوم في قارورة.
- قم بتصفية الخليط التي تلت ذلك عن طريق مخدد ورق الترشيح الواردة في قمع زجاج قارورة مستديرة القاع 250 مل قبل موزون.
ملاحظة: يمكن تجاهل هذه البقايا الصلبة (رطب مجسو4) في النفايات. - تتبخر المذيبات (الهكسين) من فيلتراتي التي تم جمعها باستخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: 60 درجة مئوية، وضغط الفراغ: 350 [مبر]) وإعادة وزن قارورة تحتوي على النفط الناتجة عن ذلك.
- الأمثل لنظام طبقة رقيقة اللوني (TLC) المذيبات
ملاحظة: كمجموعة، الطلاب سيتم تعيين نظام المذيبات من الأسيتون: الحلقي 100:0 إلى 0:100 الأسيتون: الحلقي بالمدرب لتحديد النسبة التي توفر الحد الأقصى من الاوجينول من أسيتيليوجينول القرار.- الحصول على حل مرجع TLC الاوجينول نقية وأسيتيليوجينول.
ملاحظة: أعد فنيي مختبر قبل الدورة مختبر TLC مرجع الحلول اللازمة الاوجينول نقية وأسيتيليوجينول. - على صفيحة TLC، علامة خط الأساس ~1.5 سم من الأسفل مع قلم رصاص ناعمة. وضع علامة على إيقاف ثلاث نقاط متباعدة بالتساوي.
- استخدام نصاب TLC على الفور قطره واحدة من الاوجينول نقية TLC حل مرجعي في حارة واحدة وبقعة واحدة لحل مرجع أسيتيليوجينول نقية TLC في الممر الثالث وبقعة من كل منهما في المسلك الثاني (الفور المشارك).
- التحقق من وجود الاوجينول وأسيتيليوجينول على لوحة TLC بعرض اللوحة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) في TLC عرض مجلس الوزراء.
ملاحظة: هناك يجب أن يكون بقع سوداء صغيرة (1-2 مم) على اللوحة حيث تم اكتشاف الحلول مرجع TLC. إذا كانت هناك لا بقع أو البقع تظهر باهتة، تطبيق آخر بقعة من TLC الحل المناسب حتى يتم ملاحظة بقعة سوداء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. - أضف 10 مل المخلوط المذيب المخصصة لجره TLC نظيفة وجافة.
ملاحظة: ضمان عدم تجاوز الارتفاع المذيبات في الجرة ~ 1 سم. - استخدام الملقط، ضع لوحة TLC المعدة في جرة TLC. أغلق غطاء الجرة.
ملاحظة: يجب أن يكمن المذيب أسفل الخط الأساسي لصفيحة TLC. - تسمح المذيب السفر حتى صفيحة TLC. بمجرد المذيب ~ 1 سم من الجزء العلوي من اللوحة، إزالة لوحة TLC من الجرة بملاقط وعلامة خط الجبهة المذيبات مع قلم رصاص.
- تسمح المذيبات تتبخر من صفيحة TLC (~ 1 دقيقة) ثم عرض لوحة TLC تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر). باستخدام قلم رصاص، دائرة البقع السوداء على صفيحة TLC.
- حساب معامل الاستبقاء (Rو) الاوجينول وأسيتيليوجينول بقسمة المسافة بالمجمع بالمسافة بالمذيبات.
- حساب الفرق بين قيم Rو الاوجينول وأسيتيليوجينول (ΔRو).
- مشاركة النتائج مع بقية الفئة. تسجيل الاحتفاظ بالقيم المكتسبة قبل غيرهم من الطلاب مع غيرها من النسب المذيبات.
- تحديد نظام المذيبات الذي سيكون أفضل لتحليل الحل الاوجينول الخام وخطوات تنقية اللاحقة.
ملاحظة: سوف توفر أفضل نسبة المذيبات TLC فصل أكبر بين الاوجينول وأسيتيليوجينول إلى بواسطة أكبر قيمةو ΔR. إذا كان يتم رسمه ΔRو ضد تكوين المذيبات، يجب أن يشابه الرسم البياني منحنى جرس.
- الحصول على حل مرجع TLC الاوجينول نقية وأسيتيليوجينول.
- فصل الاوجينول وأسيتيليوجينول باستخراج سائل
- إضافة الهكسين (10 مل) لاستخراج النفط الخام الذي يحتوي على الاوجينول التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.17، وصب الحل التي تلت ذلك في قمع سيباراتوري 250 مل.
- شطف قارورة مستديرة القاع مع الهكسين (10 مل) وهذا إضافة إلى القمع سيباراتوري.
- استخراج الحل الهكسين مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم المائية (2 x 25 مل) عن طريق استخراج السائل والسائلة. جمع ودمج الطبقات السفلي مائي في قارورة مخروطية الشكل 250 مل من استخراج كل. جمع الطبقة العضوية في قارورة مخروطية 50 مل والجاف بإضافة مجسو4 ويحوم في قارورة.
تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم التآكل. تجنب أي اتصال مع الجلد.
ملاحظة: يبقى أسيتيليوجينول في الطبقة العضوية، بينما الاوجينول الآن في استخراج مائي القلوية (الطبقات السفلي). - الاحتفاظ العضوية طبقة (حل العضوية A) لتحليلها في وقت لاحق TLC.
- دورق مخروطي يحتوي على جزء مائي قلوي من الخطوة 1.3.3 في حمام الماء المثلج دوامة وإضافة 10 M HCl مائي ببطء حتى تتشكل شكل مستحلب أبيض؛ تحقق لها الحموضة بورق أحمر الكونغو، استخدام ماصة نقل قطره من الحل على ورقة الأس الهيدروجيني (أنه ينبغي أن يتحول الأزرق).
تنبيه: HCl التآكل. تجنب أي اتصال مع الجلد. يمكن أن يسبب إضافة HCl محتدما قوية، ينبغي إضافة HCl بعناية، الاحتفاظ بقارورة مخروطية على الجليد.
ملاحظة: سيكون مطلوباً ما مجموعة 20-30 مل HCl (م 10 محلول مائي). - استخراج مستحلب مائي حليبي مع الهكسين (2 × 30 مل)، استخدام استخراج السائل والسائلة في 250 مل فصل قارورة. تأكد من أن درجة حرارة استخراج مائي في درجة حرارة الغرفة أو أدناه قبل إضافة الهكسين. الجمع بين مقتطفات الهكسين اثنين في قارورة مخروطية نظيفة 100 مل.
ملاحظة: سيتم الاوجينول الآن في الجمع بين العضوية (الأعلى) الطبقات (حل العضوية ب). - إضافة مجسو4 الجافة الحل العضوية باء
- تحليل الحل العضوية بالعضوية حل ب ومرجع TLC الاوجينول نقية وأسيتيليوجينول إشارة TLC TLC استخدام نسبة المذيبات TLC الأمثل تم تحديدها في الدورة السابقة.
- تصفية الحل العضوية A و B من خلال ورق الترشيح مخدد إلى منفصلة قبل وزنه 250 مل القاع المستديرة قوارير. تجاهل هذه البقايا الصلبة (رطب مجسو4) في النفايات.
- إزالة المذيب من قوارير الجولة لأسفل باستخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: 60 درجة مئوية، وضغط الفراغ: 350 [مبر]).
- إضافة الاثير ثنائي إثيل (5 مل) لكل قارورة مستديرة القاع ونقل أسيتيليوجينول المنقي (حل العضوية A) والاوجينول (حل العضوية ب) إلى قنينة غير مسمى، بريويغيد استخدام قمع.
- شطف قارورة مع زيادة إثيل الاثير (5 مل) إلى القنينة. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: 50 درجة مئوية، وضغط الفراغ 800 [مبر]) مع مرفق قنينة. سجل العائد وتسمية القنينة على نحو ملائم.
- تحليل الحل العضوية بالعضوية حل ب ومرجع TLC الاوجينول نقية وأسيتيليوجينول إشارة TLC TLC استخدام نسبة المذيبات TLC الأمثل تم تحديدها في الدورة السابقة.
ملاحظة: يمكن صب المحاليل أسفل الحوض للتخلص منها. الهكسين والأثير ينبغي التخلص من النفايات في زجاجات النفايات العضوية غير المكلورة.
2-فو محدبة كوريا : عزل سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين
-
الدورة 1. فو من كوريا محدبة
- طحن أوراق محدبة كوريا (10 جرام) في مطحنة التوابل كهربائية وثم نقل المواد النباتية البرية كوب 250 مل.
ملاحظة: طحن ينبغي أن يستغرق 20-30 ثانية. - إضافة ~ ز 2 من الرمل الخشن للكأس التي تحتوي على المواد النباتية.
- ميكس وحزمة في السلة من بورتافيلتير (حجرة العينة). ضغط العينة مع العبث.
ملاحظة: لا حزمة العينة مسرف. - إضافة ~ 300 مل من 35% الإيثانول/ح2س الحل إلى خزان آلة اسبرسو.
- ضع بورتافيلتير في آلة اسبرسو وكوب 250 مل نظيفة تحته.
- جمع ~ 100 مل استخراج، انتظر دقيقة ~ 1 ومن ثم جمع زيادة 100 مل.
تنبيه: مقتطفات وآله سوف تكون ساخنة عند هذه النقطة. - بارد هذا الخليط في حمام الثلج وتتبخر الإيثانول استخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: ~ 40 درجة مئوية).
- نقل مائي استخراج لقمع سيباراتوري واستخراج مع وخلات الإيثيل (4 × 50 مل).
ملاحظة: قد تحتاج الوقت للسماح للمستحلبات للفصل بين عمليات الاستخراج. - ضم مقتطفات العضوية والجاف بإضافة مجسو4 ويحوم في قارورة، عامل التصفية باستخدام قمع زجاج متكلس، وتتبخر باستخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: ~ 35 درجة مئوية) لتوفير استخراج النفط الخام.
- الحصول طيف رنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) 1ح (انظر المدرب للمساعدة). 11
- القيام بتحليل TLC لاستخراج النفط الخام لتحديد نظام مذيب مناسب لعزل المركبات التي تم استخراج.
ملاحظة: يتم تحليل TLC بالقياس إلى الإجراءات المحددة في الخطوة 1.2.
- طحن أوراق محدبة كوريا (10 جرام) في مطحنة التوابل كهربائية وثم نقل المواد النباتية البرية كوب 250 مل.
-
الدورة 2. الفصل بين سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين بعمود فلاش اللوني11،19
ملاحظة: بروتوكول التالية تنطوي على استخدام كروماتوغرافيا العمود فلاش لفصل المركبات العضوية. يرجى استشارة مدرب لشرح كيفية حزمة عمود فلاش السليكا هلام.- مكان العمود (~ 30 ملم في القطر) في المشبك مزودة بموقف معوجة. مكان 100 مل قارورة مخروطية الشكل أسفل العمود.
- ملء العمود مع هلام السليكا (60 ميكرومتر فلاش الصف) إلى مستوى ~ 10 سم ثم قم بإضافة هيكسانيس (~ 100 مل) للعمود.
- ضع سداده زجاجية في العمود وإزالة العمود من المشبك ويهز للحصول على الطين. وضع العمود في المشبك وثم السماح الخليط تسوية.
- فتح برنامج المشورة التقنية العمود، واستخدام محول غاز يعلق على خط هواء المضغوط، فارغة العمود إلى مغادرة ملم ~ 2 من المذيبات أعلاه سرير هلام السليكا. إزالة محول الغاز ثم أغلق الصنبور.
- استخدام هيكسانيس التي تم جمعها في دورق مخروطي (~ 5 مل) لغسل أسفل أي هلام السليكا من جدران العمود مع ماصة باستور مزودة الغشاء المطاطي.
- كرر الخطوة 2.2.4 ثم قم بإضافة طبقة صغيرة من الرمال (~ 1 سم) إلى العمود.
- إضافة الميثان (~ 1 مل) لقارورة تحتوي على النفط الخام استخراج من الخطوة 2.1.9. تحميل حل التي تلت ذلك على العمود باستخدام ماصة باستور مزودة الغشاء المطاطي بعناية. فتح برنامج المشورة التقنية العمود والسماح بالعينة الجسميات على هلام السيليكا.
- كرر الخطوة 2.2.7 أخرى مرتين.
- إضافة هيكسانيس (~ 20 مل) بعناية للعمود. كرر الخطوة 2.2.4.
- أضف بعناية (~ 180 مل حل وخلات الإيثيل/هيكسانيس 15%). فتح برنامج المشورة التقنية من العمود، واستخدام محول غاز يعلق على خط هواء المضغوط، فارغة العمود إلى مغادرة ملم ~ 2 من المذيبات أعلاه سرير هلام السليكا، جمع الكسور في أنابيب الاختبار 10 مل.
ملاحظة: هذا سوف يسمح سيسيلين أن تكون معزولة. - الجمع بين الكسور أنبوبة الاختبار المحتوية على سيسيلين في قارورة 250 مل قاع جولة وتتبخر باستخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: ~ 35 درجة مئوية).
ملاحظة: يستخدم لتحديد هذا التحليل TLC وتتم بالقياس إلى الإجراءات المحددة في الخطوة 1، 2. - أضف بعناية (~ 75 مل حل وخلات الإيثيل/هيكسانيس 25%). فتح برنامج المشورة التقنية من العمود، واستخدام محول غاز يعلق على خط هواء المضغوط، فارغة العمود إلى مغادرة ملم ~ 2 من المذيبات أعلاه سرير هلام السليكا، جمع الكسور في أنابيب الاختبار 10 مل.
ملاحظة: هذا سوف يسمح (+)-ابوكسيسوبيروسين أن تكون معزولة. - الجمع بين الكسور أنبوبة الاختبار التي تحتوي على (+)-ابوكسيسوبيروسين في جولة 250 مل أسفل قارورة وتتبخر باستخدام مبخر دوراني (المياه درجة حرارة الحمام: ~ 35 درجة مئوية).
ملاحظة: يستخدم لتحديد هذا التحليل TLC وتتم بالقياس إلى الإجراءات المحددة في الخطوة 1، 2. - ويتم تحليل عينات المركبات المعزولة باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي. 11
ملاحظة: يتم تنفيذ تجارب التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي قبل فني مختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فو قرنفل. عند محاولة تنفيذ الخطوة استخراج السائل والسائلة، التي غالباً ما تصادف مستحلبات (إضافة محلول ملحي كان عادة غير فعالة) الطلاب. في هذه المرحلة، كانت تعليمات الطلاب للسماح الخليط على الوقوف في قمع فصل حين قاموا باستكشاف آثار تكوين الوينت على الفصل بين الاوجينول وأسيتيليوجينول من TLC. تجدر الإشارة إلى أن الهكسين يمكن أن يكون محل هيبتان أو الميثان في الخطوة استخراج سائل. 9 الطلاب وخصصت نسبة المذيبات TLC الأسيتون والحلقي والمقدمة مع المعايير نقية الاوجينول وأسيتيليوجينول وثم إجراء تحليل TLC (الشكل 3). تم تبويب نتائجها على لوح أبيض، واعتبرت آثار تشكيل المذيبات على الاحتفاظ بالعامل (Rf) والوينت الأمثل في إحدى مناقشات المجموعات (الجدول 1). التراكيب المذيبات المثلى التي حددها الطلاب عادة ما تتراوح بين 5-20% الأسيتون/الحلقي مع ΔRو بين 0.1-0.2.
في أعقاب TLC الوينت الأمثل، عاد الطلاب إلى الاستخراج الاوجينول بهم. تم عزل استخراج النفط الخام القرنفل (تتألف أساسا من الاوجينول وأسيتيليوجينول) في 4-9% w/w. في الدورة الثانية لهذه التجربة، استغلال الطلاب خصائص الجزيئات العضوية الرئيسية اثنين فصلها باستخراج سائل حمض-قاعدة مختلفة. بشكل عام، تم عزل الاوجينول في عائد من 45-65% w/w من استخراج النفط الخام بينما تم عزل أسيتيليوجينول في عائد من 5-10% w/w من استخراج النفط الخام. ثم استخدمت الطلاب الوينت الأمثل (التعرف على النحو المبين أعلاه) تحديد مدى نجاح على استخراج سائل بالمقارنة مقتطفات للعينات النقية المرجعية قبل TLC (الشكل 3). أيضا تحليل الطلبة على استخراج النفط الخام القرنفل، والعينات النقية الخاصة بهم الاوجينول وأسيتيليوجينول عن طريق إجراء تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FTIR) التحليل الطيفي. ولوحظت قمم المذيبات أو المياه 9 أحياناً في أطياف الأشعة تحت الحمراء بسبب إجراءات العمل حتى تنفذ بشكل سيئ (أو إعداد عينة الفقراء).
طلاب الدراسات العليا ارتكبت حوالي نصف النفط الخام معزولة لاستخراج سائل الموصوفة أعلاه وتعرض جزء آخر إلى العمود فلاش اللوني (يرد مزيد من المعلومات في المعلومات الداعمة). وكان هذا على الرغم من أن إكمال استخراج سائل والعمود فلاش اللوني الخطوات في جلسة استمرت أربع ساعات قد تظهر بدلاً من ذلك الطموح قابلة للتحقيق بالنسبة لطلاب الدراسات العليا إجراء هذه التجربة. كان نادراً ما يتحقق فصل الاوجينول كاملة عن أسيتيليوجينول بعمود فلاش اللوني بسبب عوامل الاحتفاظ بوثيقة (الشكل 4). ومع ذلك، كان الطلاب عموما قادرة على جمع الكسور قليلة يحتوي على الاوجينول نقية. ثم طلب الطلاب المتقدمين إلى التعليق على تقنيات تنقية مختلفة اثنين كجزء من تقاريرها.
فو من محدبة كوريا- أداء الطلاب فو من محدبة كوريا مع الحد الأدنى من المساعدة للمدرب المختبر. أثناء الخطوة استخراج سائل مستحلبات عادة تشكيل والطلاب غالباً ما يلزم بالسماح المخلوط بالوقوف في القمع سيباراتوري (ح ~0.25) مع الإثارة الدورية للمخلوط بقضيب زجاج. تنقية الكروماتوغرافي من استخراج النفط الخام اكتمل بشكل مريح داخل الدورة أربع ساعات المختبر بالطلاب. سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين كانت معزولة في غلة تصل إلى 1.1% w/w و 0.9% w/w، على التوالي، وتم تحليل العينات المعزولة من كل من المركبات قبل 1ح و 13مطيافية الرنين المغناطيسي النووي ج وفتير (الشكل 2). في حين قام الطلاب بتجارب التحليل الطيفي فتير والعينات المعدة للتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي، فنيي المختبرات أجرى تجارب التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. النتائج التي حصل عليها الطلاب تتفق مع الأعمال المنشورة سابقا. 11
على الرغم من أن هذا ليس قد قدم في هذا التقرير، في الممارسة العملية، هذه التجربة أيضا ملامح جزء ثاني أن التحديات الطلاب القيام بالاستخراج أنواع النباتية التي لم تدرس توظيف فو (مزيد من المعلومات يتم توفيرها دعم المعلومات).
الشكل 1. فو قرنفل. 9 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. فو من محدبة كوريا- 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . صفيحة TLC ممثل أعدها طالب. (الأسيتون 10%/شطف الحلقي). لين 1 (ﻫ): الاوجينول القياسية؛ لين 2 (الخام): الخام القرنفل استخراج؛ لين 3 (أ): أسيتيليوجينول القياسية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأسيتون/الحلقي (%v/v) | يعني أسيتيل-الاوجينول آرو | أسيتيل-الاوجينول Rو (σ) | يعني الاوجينول آرو | الاوجينول Rو (σ) | يعني ΔRو | عدد من التحليلات TLC |
| 0 | 0.06 | 0.08 | 0.04 | 0.06 | 0.02 | 12 |
| 5 | 0.34 | 0.11 | 0.27 | 0.09 | 0.07 | 15 |
| 10 | 0.45 | 0.07 | 0.34 | 0.05 | 0.12 | 20 |
| 20 | 0.51 | 0.07 | 0.41 | 0.06 | 0.10 | 20 |
| 30 | 0.58 | 0.10 | 0.49 | 0.12 | 0.10 | 19 |
| 40 | 0.63 | 0.08 | 0.56 | 0.08 | 0.07 | 16 |
| 50 | 0.76 | 0.08 | 0.73 | 0.08 | 0.03 | 17 |
| 60 | 0.77 | 0.13 | 0.73 | 0.15 | 0.04 | 12 |
| 70 | 0.84 | 0.13 | 0.81 | 0.13 | 0.03 | 11 |
| 80 | 0.90 | 0.06 | 0.87 | 0.08 | 0.02 | 10 |
| 90 | 0.88 | 0.06 | 0.87 | 0.05 | 0.01 | 11 |
| 100 | 0.87 | 0.13 | 0.86 | 0.14 | 0.02 | 6 |
الجدول 1- جدول عوامل الاستبقاء تحدد أثر تكوين الوينت على Rو.
الشكل 4 . لوحات TLC الممثل أعدها الطلاب. يسار: صفيحة TLC تحليل نتائج الخطوة استخراج سائل (الأسيتون 10%/شطف الحلقي). لين 1 (ﻫ): الاوجينول المعيار المرجعي؛ لين 2 (ليب): استخراج الاوجينول المحتوية على العضوية؛ لين 3 (أ): معيار مرجعي أسيتيليوجينول؛ لين 4 (ليون): استخراج العضوية المحتوية على أسيتيليوجينول. حق: صفيحة TLC تحليل نتائج الخطوة كروماتوغرافيا العمود فلاش (الأسيتون 10%/شطف الحلقي). أرقام على لوحة TLC تتعلق بعدد كسر أنابيب الاختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء التقليدي لعزل الاوجينول من القرنفل بالتقطير بالبخار كان جزءا من برنامج مختبر الكيمياء المتوسطة في جامعة سيدني لعقود ولكن تم تحديثها باستخدام منهجية فو عام 2016 (الشكل 1). 9 , 18 هذا مستحقات رقم. أولاً، استخدام آلات اسبرسو الأسر المعيشية في بيئة المختبر فورا فتنت ويشارك الطلاب بتوضيح تطبيق طريقة بديلة غير الكلاسيكية، وعلى أثر دراسة علمية تقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب الجديد تقليل الوقت المستغرق لإكمال الاستخراج، وتمكين دمج تدريبات إضافية في هذا التكرار الجديد من التجربة. على وجه التحديد، وهذا سمح كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) لإدخال (وفلاش كروماتوغرافيا العمود لطلاب الدراسات العليا).
وقد صمم التجربة مع التركيز على فو القرنفل كمختبرات تمهيدية لطلاب السنة الثانية كيمياء المرحلة الجامعية ولهذا السبب أنها تجربة ميزات أساليب التدريس تفسيرية. 9 أكثر إلزاماً، الوصفة-نمط هذا الإجراء يسمح للطلاب ذوي الخبرة محدودة نوعا ما في الكيمياء العضوية لإكمال كفاءة استخراج الاوجينول من القرنفل. في هذه التجربة، وعرض مفاهيم مثل استخراج حمض-قاعدة للمركبات الحمضية باستخدام TLC لتحديد تكوين الوينت مناسبة للفصل اللوني، واستخدام مبخر دوراني أو معززة بمزيج من الخط قبل معمل الفيديو التدريب وفي شخص المظاهرات. في المكونات التكميلية المضطلع بها خلال دورتي المخصصة، الطلاب في تيار متقدمة للكيمياء الوسيط أيضا مفصولة كروماتوغرافيا العمود الاوجينول وأسيتيليوجينول وتحديد هوية العناصر المستخرجة باستخدام "tlc". في الدورة الثانية، من الطلاب خطيرة مقارنة طرق فصل اثنين. وبوجه عام، كان الطلاب قادراً على إتمام التجربة الشاملة ضمن فترتين مدة أربع ساعات المخصصة مع الحد الأدنى من التعليم.
التجربة مع التركيز على فو وعزل سيسيلين و (+)-ابوكسيسوبيروسين من محدبة كوريا وضعت لطلاب السنة الثالثة كيمياء المرحلة الجامعية الطلاب أكثر خبرة. جدير بالذكر أن هذه العملية التعليمية كان نتيجة لدراسة الناشئة في مختبر أبحاث. 11 أدرج أول تكرار التجربة في برنامج مختبر الكيمياء السنة الثالثة الجامعية في جامعة تاسمانيا في عام 2015. بعد عامين من التنقيحات وإعادة التقييم، أجريت هذه التجربة حسب فئة الثالثة-السنة جامعية للمرة الثالثة في عام 2017.
هذه التجربة كانت مصممة خصيصا كنشاط تسترشد التحقيق-على أساس أن تسعى جاهدة لمحاكاة بعض النهج المستخدمة في مختبرات أبحاث المنتجات الطبيعية وميزات الحد الأدنى تعليمات مكتوبة. هذه تجربة تعلم الموجه بالطالب والمدرب المختبر يلعب دوراً رئيسيا في مساعدة الطلاب وهم يعملون من خلال التجربة بتوفير التوجيه كما هو مطلوب. في هذه التجربة، تنمية المهارات المختبرية الأساسية في الفصل اللوني للطلاب وتوظيف مطيافية الرنين المغناطيسي النووي القيام بتوضيح الهيكل. هذه التجربة المعملية ويعزز مفهوم التنقيب البيولوجي الذي يقدم للطلاب في الفصول الدراسية، ويمكن تمديد هذه الدراسات على المواد النباتية تدرس سابقا لتوفير تجربة أكثر تمثيلاً للمنتجات الطبيعية التنقيب البيولوجي. جيم-محدبة أنواع النباتية متوطنة أسترالية، ومع ذلك، هذه العينة يمكن أن تكون بديلاً للمواد المناسبة أوراق من الأنواع النباتية البرية الأخرى في هذه التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يعترف أصحاب مدرسة العلوم الطبيعية-الكيمياء، جامعة تاسمانيا ومدرسة للكيمياء، جامعة سيدني للدعم المالي. B.J.D. وج. ج. أشكر "الحكومة الأسترالية" "بحوث التدريب برنامج المنح الدراسية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| espresso machines | Breville/Sunbeam | Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| rotary evporators | Buchi and Heidolph | ||
| cloves (plant material) | Dijon Food Pty Ltd | Cloves must be ground in a food processor for students. | |
| Correa reflexa (plant material) | sample obtained in Tasmania | Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania | |
| sand | Ajax | 1199 | |
| ethanol | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| hexanes | Ajax | 251 | |
| magnesium sulfate | Ajax | 1548 | |
| diethyl ether | Merck | 1009215000 | |
| silica on aluminium TLC plates | Merck | 1055540001 | |
| eugenol | Merck | 1069620100 | |
| eugenyl acetate | Aldrich | W246905 | |
| acetone | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| cyclohexane | ChemSupply | CA019 | |
| silica gel 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63um (230-400mesh) |
| Congo red paper | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% hydrochloric acid | Ajax | 256 |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
- Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
- Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
- Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
- Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
- Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
- Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
- Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
- Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
- Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
- Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
- Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
- Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
- Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
- Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
- Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
- Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. , 2923-2925 (1978).
