Summary
כאן, אנו מעסיקים שיטת החילוץ (PHWE) בלחץ מים חמים, אשר מנצל מכונת אספרסו ביתית שלא שונתה להכיר סטודנטים מוצרים טבעיים כימיה במעבדה. מוצגים שני ניסויים: PHWE של eugenol, acetyleugenol בין שיני PHWE של seselin, (+)-epoxysuberosin מצמח האוסטרלי reflexa קוראה.
Abstract
שיטת החילוץ (PHWE) שפותח לאחרונה בלחץ מים חמים אשר מנצל מכונת אספרסו ביתית שלא שונתה כדי להקל על מוצרים טבעיים המחקר מצא גם יישומים ככלי הוראה יעילה. באופן ספציפי, טכניקה זו שימש להכיר סטודנטים, שלישי-שנה שנייה את ההיבטים של מוצרים טבעיים כימיה במעבדה. בדו ח זה מוצגים שני ניסויים: PHWE של eugenol, acetyleugenol ציפורן, את PHWE של seselin, (+)-epoxysuberosin של מינים אנדמיים צמח אוסטרלי קוראה reflexa. על ידי שימוש PHWE בניסויים אלה, התמצית ציפורן גסה, מועשר eugenol, acetyleugenol, הושג ב- 4-9% w/w של ציפורן על-ידי סטודנטים שנה שנייה, seselin, (+)-epoxysuberosin היו מבודדים של התשואות של עד 1.1% w/w ו- 0.9% w/w מ Reflexa ג על ידי סטודנטים שנה ג'. התרגיל לשעבר פותחה כתחליף עבור הניסוי בזיקוק אדים מסורתי המספק מבוא טכניקות החילוץ והפרדה, בזמן הפעילות האחרון בהשתתפות שיטות הלימוד מונחה-חקירה במטרה לדמות bioprospecting מוצרים טבעיים. זה נובע בעיקר מן הטבע מהירה של טכניקה זו PHWE ביחס שיטות החילוץ המסורתית כי לעיתים קרובות אינם תואמים אילוצי זמן המשויך שמוכר לתואר ראשון. שיטה זו מהירה ומעשית PHWE ניתן לבודד ביעילות קורסים שונים של מולקולות אורגניות מתוך מגוון רחב של מיני צמחים. הטבע משלימים של טכניקה זו ביחס שיטות מסורתיות יותר גם הוכח בעבר.
Introduction
בידוד וזיהוי של מוצרים טבעיים הם חשיבות היסוד מהקהילה המדעית והחברה יותר בדרך כלל. 1 Bioprospecting, החיפוש אחר בעל ערך מולקולות אורגניות בטבע, נשאר תהליך הכרחי על גילוי סמים של הפניות חדשות וכן סוכני טיפולית פוטנציאל. ההערכה היא כי, מ- 1981-2014, ~ 75% של כל מולקולה קטנה שאושרו תרופות היו מוצרים טבעיים, טבעי המוצר-derived והטבעי המוצר בהשראה. 1 יתר על כן, מוצרים טבעיים בעלי הגיוון האדיר מבניים וכימיים. מסיבה זו, הם מייצגים גם יקר פיגומים כימי שיכול לשמש ישירות סינתזה אורגנית או בפיתוח של זרזים של ליגנדים כיראלי. 2 , 3
באופן מסורתי, יחסית אינטנסיבית הליכים כגון השרייה, שאורכה, מיצוי Soxhlet בקיטור היה עמוד התווך של המחקר התמקד בידודו של מטבוליטים משניים מצמחים. 4 טכניקות החילוץ מודרני יותר, כולל חילוץ הממס מואצת, התמקדו הפחתת השאיבה פעמים ומיסוד פרוטוקולים ירוק יותר. 4 , 5 בשנת 2015, בלחץ מים חמים החילוץ (PHWE) שיטה מקורית דווח. 6 טכניקה זו מועסקים מכונת אספרסו ביתית שלא שונתה כדי להקל על החילוץ מהיר ויעיל במיוחד של חומצה shikimic של כוכב האניס. מכונות אספרסו יש כבר באופן ספציפי מעוצבים ומתוכננים לחלץ מולקולות אורגניות כראוי פולי קפה טחון. כדי להשיג את, אלה מכשירים חום מים בטמפרטורות עד 96 ° C ו- לחצים של בר 9 בדרך כלל. 7 . עם זאת, זה אולי לא מפתיע כי מכונות אספרסו יכול להיות מנוצל כדי לחלץ ביעילות מוצרים טבעיים מטווח של חומר צמחי.
מחקרים מאוחרים יותר הכוללים מגוון רחב של מיני צמחים יבשתי הוכיחו את הקיבולת של טכניקה זו PHWE לחלץ ביעילות מוצרים טבעיים על פני מגוון רחב יחסית קוטביות. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 יתר על כן, תרכובות המכילות קבוצות פונקציונליות רגיש במידה מסוימת, כגון aldehydes, epoxides, glycosides פוטנציאל epimerizable stereogenic מרכזי לא הושפעו בדרך כלל על ידי תהליך החילוץ. הטבע משלימים של טכניקה זו ביחס שיטות מסורתיות יותר גם הוכח. 12 , 16 PHWE זו שיטה גם כבר מועסקים לבודד רב גרם כמויות של מוצרים טבעיים, אשר שימשו להכנת מוצר טבעי הרומן נגזרים, סינתזה מולקולה מורכבת באופן כללי יותר. 8 , 11 , 17
זה זוהה כי שיטה PHWE חדשה, יכול להוות כלי שימושי הוראה יכול לשלב במעבדה לתואר ראשון. זה נובע בעיקר מן הטבע מהירה של טכניקה זו ביחס שיטות החילוץ המסורתית לעיתים קרובות אינם תואמים אילוצי זמן המשויך שמוכר לתואר ראשון. כתוצאה מכך, טכניקה זו החליפה את הניסוי מעבדה כימיה לתואר ראשון מסורתי התמקדו החילוץ של eugenol מן ציפורן העסקת בקיטור ב אוניברסיטה של טסמניה. 9 , 18 מאז, וריאציות של ניסוי זה אומצו על ידי אוניברסיטאות אחרות ניסוי ששונה התמקדות PHWE של ציפורן עכשיו התכונות בתוכנית מעבדה כימיה לתואר ראשון ב אוניברסיטת סידני (וידאו אינפרא ).
כדי להדגים את המעשיות ואת הכדאיות של העסקת את הגישה PHWE החדשה הזו לצורכי הוראה, שני פרוטוקולים מוצגים במסגרת מחקר זה. החלק הראשון של דו ח זה מדגיש ניסוי על PHWE של eugenol, acetyleugenol של ציפורן, המהווה חלק של התוכנית שנה שנייה לתואר ראשון מעבדה ב אוניברסיטת סידני (איור 1). ניסוי זה משמש כדי להכיר סטודנטים לכימיה מוצרים טבעיים תוך פיתוח מיומנויות מעשיות היסוד. החלק השני כולל ניסוי על PHWE של מינים אנדמיים צמח אוסטרלי קוראה reflexa המהווה חלק של התוכנית מעבדה שנה שלישית לתואר ראשון באוניברסיטה של טסמניה (איור 2). הניסוי הזה נועד לדמות bioprospecting מוצרים טבעיים ולחזק וטכניקות מעבדה הליבה. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מומלץ כי כל הפרוצדורות מתבצעות בשכונה fume. התלמידים חייבים ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בכל עת במעבדה, חייבים להתייעץ עם הסדינים נתוני בטיחות (מרחביות) המשויכים כל ריאגנט לפני השימוש.
1. PHWE ציפורן: בידוד של eugenol, acetyleugenol
- מיצוי של eugenol, acetyleugenol של ציפורן
- מקום גס ציפורן טחון (12.5 גרם) גביע 250 מל.
- להוסיף הקפה הטחון ציפורן חול (12.5 גרם) ומערבבים היטב.
- אוספים של portafilter (לדוגמה תא) ולטעון את הסל עם תערובת חול ציפורן שלם. בקלילות לדחוס את הדגימה עם tamper.
הערה: לא לדחוס את התערובת מדי או לזרימה דרך. - מקם את portafilter לתוך המכונה האספרסו ולמקם גביע נקי 250-mL מתחתיו. להוסיף 30% אתנול/H2O פתרון מיכל המים של מכונת אספרסו, אם זה פחות מחצי מלאה.
- להשתמש את מכונת אספרסו כדי לאסוף 100 מ של התמצית.
הערה: עיין מורה אם המכונה נראה מהחורים סתום. - אפשר את portafilter לסיים נוטף ולאחר מכן הסר אותו ממכונת אספרסו.
התראה: grinds והסביבה מתכת יהיה חם. - בעזרת מרית, להסיר את הקפה הטחון ציפורן portafilter וזורקים לפח האשפה.
- לשטוף מוצקים שיורית מ portafilter עם H2O תחת ברז לכיור ולחזור בשביל האדם הבא לשימוש.
- מגניב ציפורן לחלץ באמבט קרח עד הטמפרטורה הפחיתה כדי לפחות 30 ° C.
- מקם את התמצית לתוך משפך 250-mL, להוסיף 30 מ של הקסאן ומנערים בעדינות.
- המקום המשפך הפרדת בתוך מלחציים הטבעת התאימה ל עמדה אביק ולאפשר הרבדים מימית ואורגניים להפריד ואז לאסוף את השכבה המימית (נמוך יותר) בחזרה לתוך כשהספל 250 מל.
הערה: זה יכול לקחת 10 דקות עבור השכבות להפריד. התלמידים מתבקשים לבצע אופטימיזציה ממס של TLCs בזמן ההמתנה לצורך הקמת מכשול ההפרדה הראשונה להתרחש (ראה שלבים 1.2). - להעביר את השכבה (העליון) אורגני (המכיל את המוצר) בקבוקון חרוט נקי 250-mL, ואז שופכים את השכבה התחתונה (מימית) בחזרה לתוך משפך מפריד.
- לחלץ את השכבה המימית נוספים פעמיים עם הקסאן (2 x 30 מ"ל).
- לשלב את השכבות (העליון) אורגני לתוך הבקבוק אותו לאחר כל החילוץ.
- אחרי החילוץ נוזל-נוזל השלישי, שופכים את תמצית אורגנית משולב לתוך משפך מפריד, לשטוף עם 100 מ של H2O ע י ניעור נמרצות. לאסוף את השכבה (העליון) אורגני לתוך בקבוקון חרוט נקי 250-mL ויבש על ידי הוספת MgSO4 ו לטמיון את הבקבוקון.
- לסנן את התערובת שהתפתח דרך נייר סינון מחורץ הכלול משפך זכוכית לתוך בקבוקון סיבוב המדרגה 250-mL שנשקל מראש.
הערה: השאריות מוצק (רטוב MgSO4) יכול להיות מושלך על הפסולת. - להתנדף הממס (הקסאן) מן פילטרט של שנאספו באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: 60 מעלות צלזיוס, לחץ ואקום: 350 mbar) ולשקול מחדש את הבקבוקון המכיל שמן תוצאות.
- אופטימיזציה של מערכת הממס דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC)
הערה: כקבוצה, סטודנטים שיוקצה מערכת הממס מ 100:0 אצטון: ציקלוהקסאן 0:100 אצטון: ציקלוהקסאן על ידי אותו מורה כדי לזהות את יחס מספק את הרזולוציה המרבית של eugenol מן acetyleugenol.- להשיג פתרון הפניה TLC של eugenol טהור ו- acetyleugenol.
הערה: הפתרונות הדרושים של הפניה TLC של eugenol טהור, acetyleugenol הוכנו על ידי טכנאי המעבדה לפני הפעלת מעבדה. - על צלחת TLC, לסמן על בסיס ~1.5 ס מ מהתחתית עם עיפרון רך. סמן את שלוש נקודות המרווחות באופן שווה.
- השתמש תצפיתן TLC לזהות טיפה אחת של eugenol טהור TLC פתרון התייחסות ליין אחד, במקום אחד של acetyleugenol טהור TLC פתרון הפניה בנתיב השלישי, מקום של כל הנתיב השני (במקום שיתוף).
- לבדוק נוכחות של eugenol, acetyleugenol בצלחת TLC על-ידי הצגת הלוח תחת מנורת UV (254 ננומטר) ב TLC במלונות הקבינט.
הערה: צריך להיות כתמים שחורים קטנים (1-2 מ מ רחב) על הצלחת שבו נצפו הפתרונות הפניה TLC. אם קיימות אין כתמים או הכתמים מופיעים דהווים, להחיל בנקודה אחרת של הפתרון המתאים TLC עד כתם שחור נצפית תחת אור UV. - להוסיף 10 מ של תערובת הממס שהוקצה צנצנת TLC נקי, יבש.
הערה: ודא שהגובה הממס בצנצנת לא תחרוג ~ 1 ס מ. - באמצעות פינצטה, מקם את הצלחת מוכן TLC לתוך הצנצנת TLC. . סגור את המכסה של הצנצנת
הערה: הממס חייב לשקר מתחת לקו הבסיס של צלחת TLC. - לאפשר הממס לנסוע למעלה הצלחת TLC. ברגע הממיס הוא ~ 1 ס מ מהחלק העליון של הצלחת, הסר את לוחית TLC של הצנצנת עם פינצטה ולסמן את הקו של חזית הממס עם עיפרון.
- לאפשר הממס להתאדות מהצלחת TLC (~ 1 דקות) ולאחר מכן הצג את הצלחת TLC תחת מנורת UV (254 ננומטר). באמצעות עיפרון, מעגל נקודות שחורות שנצפו על הצלחת TLC.
- לחשב את גורם השמירה (Rf) של eugenol, acetyleugenol על-ידי חלוקת המרחק טיילתי ליד המתחם על ידי המרחק טיילתי ליד הממס.
- חישוב ההפרש בין ערכיf R עבור eugenol לבין acetyleugenol (ΔRf).
- לשתף את התוצאות עם שאר הכיתה. להקליט את ערכי השמירה נרכשה על ידי תלמידים אחרים עם יחס הממס אחרים.
- לזהות באיזו מערכת הממס יהיה עדיף לנתח eugenol גולמי פתרון והשלבים הבאים טיהור.
הערה: היחס הטוב ביותר של הממס TLC תספק הפירוד הגדול ביותר בין eugenol acetyleugenol מסומן על ידי הערךf ΔR הגדול ביותר. אם ΔRf מותווים נגד קומפוזיציה הממס, הגרף צריך דומה עקומת פעמון.
- להשיג פתרון הפניה TLC של eugenol טהור ו- acetyleugenol.
- ההפרדה של eugenol, acetyleugenol על ידי מיצוי נוזל-נוזל
- להוסיף הקסאן (10 מ"ל) גולמי eugenol המכילות תמצית המתקבל שלב 1.1.17, שופכים את הפתרון שהתפתח לתוך משפך 250 מל.
- לשטוף את הבקבוק העגול-התחתון עם הקסאן (10 מ"ל), להוסיף את זה לרשימת המשפך.
- לחלץ את הפתרון הקסאן עם מ' 3 מימית NaOH (2 x 25 מ ל) באמצעות מיצוי נוזל-נוזל. לאסוף, לשלב את שכבות התחתון מימית בבקבוקון חרוט 250-מל מ כל החילוץ. לאסוף את השכבה אורגני בבקבוקון חרוט 50-mL ויבש על ידי הוספת MgSO4 ו לטמיון את הבקבוקון.
התראה: NaOH הוא מאכל. הימנע מכל מגע עם העור.
הערה: Acetyleugenol נשאר ברובד אורגני, eugenol עכשיו נמצא תמצית מימית אלקליין (הפקדות). - שומרים על האורגני בשכבה (אורגניים פתרון A) לניתוח TLC בשלב מאוחר יותר.
- מערבולת את הבקבוקון חרוט המכיל את השבר מימית אלקליין מהשלב 1.3.3 באמבט קרח-מים ולהוסיף לאט 10 M HCl מימית עד אמולסיה לבן נוצר; בדוק את החומציות בנייר אדום קונגו, באמצעות פיפטה להעביר טיפה של הפתרון על הנייר pH (זה צריך לבטל כחול).
זהירות: HCl היא מאכל. הימנע מכל מגע עם העור. תוספת של HCl יכול לגרום מבעבעים נמרצת, HCl אמור להתווסף בקפידה, מחזיק את הבקבוק חרוט על קרח.
הערה: סך של 20-30 מ של HCl (10 מ' של פתרון מימית) יידרש. - לחלץ את תחליב מימית חלבי עם הקסאן (2 x 30 מ"ל), באמצעות מיצוי נוזל-נוזל ב 250 מ ל, להפריד את הבקבוק. ודא כי הטמפרטורה של תמצית מימית בטמפרטורת החדר או להלן לפני הוספת את הקסאן. משלבים תמציות הקסאן שני לתוך בקבוקון חרוט נקי 100 מ.
הערה: eugenol עכשיו יהיה משולב אורגני (העליון) שכבות (אורגניים פתרון B). - להוסיף MgSO4 יבש אורגני פתרון ב'
- לנתח אורגניים פתרון A, אורגני פתרון B, eugenol טהור TLC הפניה והפניה acetyleugenol TLC מאת TLC באמצעות אופטימיזציה TLC הממס היחס שזוהתה בהפעלה הקודמת.
- לסנן אורגניים פתרון A ו- B באמצעות נייר סינון מחורץ לתוך נפרד מראש שנשקל 250-mL סיבוב המדרגה מבחנות. למחוק את שאריות מוצק (רטוב MgSO4) ב הפסולת.
- הסר הממס המבחנות סיבוב המדרגה באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: 60 מעלות צלזיוס, לחץ ואקום: 350 mbar).
- להוסיף דיאתיל אתר (5 מ ל) כל הבקבוק העגול-התחתון ולהעביר את מטוהרים acetyleugenol (אורגניים פתרון A) eugenol (אורגניים פתרון B) לתוך המבחנה ללא תווית, preweighed באמצעות משפך.
- יש לשטוף את הבקבוק עם עוד דיאתיל אתר (5 מ"ל) לתוך הבקבוקון. להתאדות הממס באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: 50 מעלות צלזיוס, לחץ ואקום 800 mbar) עם צרופת המבחנה. להקליט את התשואה, לתייג את המבחנה כראוי.
- לנתח אורגניים פתרון A, אורגני פתרון B, eugenol טהור TLC הפניה והפניה acetyleugenol TLC מאת TLC באמצעות אופטימיזציה TLC הממס היחס שזוהתה בהפעלה הקודמת.
הערה: פתרונות מימית ניתן להעמיד לכיור לסילוק. הקסאן ואתר פסולת צריך להיות מסולק ללא כלור אורגני פסולת לבקבוקים.
2. PHWE של reflexa קוראה : בידוד של seselin, (+)-epoxysuberosin
-
שיעור 1. PHWE של reflexa קוראה
- לטחון את העלים reflexa קוראה (10 גרם) במטחנת תבלינים חשמלית ולאחר מכן להעביר את חומר צמחי הקרקע כדי גביע 250 מל.
הערה: שחיקה צריך לקחת 20-30 שניות. - להוסיף ~ דור 2 של חול גס כדי כשהספל המכיל חומר צמחי.
- מיקס, חפיסת לתוך הסל portafilter (לדוגמה תא). לדחוס את הדגימה עם tamper.
הערה: חזק מדי בלי לארוז את הדגימה. - הוסף ~ 300 מ של 35% אתנול/H2O פתרון למיכל מכונת אספרסו.
- מקם את portafilter לתוך המכונה האספרסו ולמקם גביע נקי 250-mL מתחתיו.
- לאסוף ~ 100 מ ל תמצית, לחכות דקה ~ 1 ולאחר מכן לאסוף 100 מ ל נוסף.
התראה: המכונה, תמציות יהיה חם בשלב זה. - להתאדות האתנול באמצעות המאדה וחותכים את תערובת זו באמבט קרח (אמבט טמפרטורת המים: ~ 40 ° C).
- להעביר את תמצית מימית משפך ולחלץ עם אתיל אצטט (4 x 50 מ"ל).
הערה: הזמן עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר אמולסיות להפריד בין עקירות. - משלבים תמציות אורגניות, יבש על-ידי הוספת MgSO4 , מתערבל את הבקבוק, סינון באמצעות משפך זכוכית sintered, מתאדים באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: ~ 35 ° C) כדי לספק את תמצית גולמי.
- לקבל ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית (NMR) של 1H (ראו את המדריך לקבלת סיוע). 11
- לבצע ניתוח TLC של התמצית גולמי כדי לקבוע מערכת הממס המתאים כדי לבודד את תרכובות חולצו.
הערה: TLC ניתוח מתבצע על ידי אנלוגיה להליכים המפורטים בשלב 1.2.
- לטחון את העלים reflexa קוראה (10 גרם) במטחנת תבלינים חשמלית ולאחר מכן להעביר את חומר צמחי הקרקע כדי גביע 250 מל.
-
שיעור 2. הפרדת seselin (+)-epoxysuberosin על ידי טור פלאש כרומטוגרפיה11,19
הערה: פרוטוקול הבאים כרוכה בשימוש של כרומטוגרפיה עמודה פלאש לצורך הקמת מכשול ההפרדה של תרכובות אורגניות. נא להתייעץ עם מדריך כדי להדגים כיצד לארוז עמודה פלאש סיליקה ג'ל.- במקום העמודה (~ 30 מ מ קוטר) מלחציים לגריל עמדה אביק. המקום בקבוקון חרוט 100-mL מתחת לעמודה.
- מלא את העמודה עם סיליקה ג'ל (60 כיתה פלאש μm) לרמה של ~ 10 ס מ ולאחר מכן להוסיף hexanes (~ 100 מ"ל) לעמודה.
- מקום פקק זכוכית בעמודה, הסר את העמודה המלחציים ומנערים להשיג של slurry. למקם את העמודה המלחציים ולאפשר ואז את תערובת להתיישב.
- לפתוח את הברז של העמודה, באמצעות מתאם גז מחובר לקו אוויר דחוס, ריק העמודה לעזוב ~ 2 מ מ של הממס מעל המיטה של סיליקה ג'ל. להסיר את מתאם גז אז לסגור את הברז.
- השתמש את hexanes שליקט את הבקבוקון חרוט (~ 5 מ"ל) כדי לשטוף כל סיליקה ג'ל מהקירות של העמודה עם פיפטה פסטר מצויד מחצה גומי.
- חזור על שלב 2.2.4 ולאחר מכן להוסיף העמודה שכבה קטנה של חול (~ 1 ס מ).
- להוסיף דיכלורומתאן (~ 1 מ"ל) הבקבוקון המכיל את הגולמי לחלץ משלב 2.1.9. בזהירות לטעון את הפתרון שהתפתח על העמודה באמצעות פיפטה של פסטר מצויד מחצה גומי. לפתוח את הברז של העמודה ולאפשר את הדגימה כדי לספוח על גבי בג'ל סיליקה.
- חזור על שלב 2.2.7 נוספים פעמיים.
- להוסיף בזהירות hexanes (~ 20 מ"ל) העמודה. חזור על שלב 2.2.4.
- להוסיף בזהירות (~ 180 מ"ל של 15% אתיל אצטט/hexanes פתרון). פתח הברז של העמודה, באמצעות מתאם גז מחובר לקו אוויר דחוס, ריק העמודה לעזוב ~ 2 מ מ של הממס מעל המיטה של סיליקה ג'ל, איסוף השברים לתוך מבחנות 10-mL.
הערה: זה יאפשר seselin להיות מבודדים. - לשלב את השברים מבחנה המכילה seselin בבקבוקון התחתון עגול 250-mL, מתאדים באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: ~ 35 ° C).
הערה: TLC ניתוח משמשת לקביעה זו, מבוצע על ידי אנלוגיה להליכים המפורטים בשלב 1.2. - להוסיף בזהירות (~ 75 מ"ל של 25% אתיל אצטט/hexanes פתרון). פתח הברז של העמודה, באמצעות מתאם גז מחובר לקו אוויר דחוס, ריק העמודה לעזוב ~ 2 מ מ של הממס מעל המיטה של סיליקה ג'ל, איסוף השברים לתוך מבחנות 10-mL.
הערה: פעולה זו תאפשר (+)-epoxysuberosin להיות מבודדים. - לשלב את השברים מבחנה המכילה (+)-epoxysuberosin עגול 250-mL בתחתית הבקבוק ולא להתאדות באמצעות המאדה (אמבט טמפרטורת המים: ~ 35 ° C).
הערה: TLC ניתוח משמשת לקביעה זו, מבוצע על ידי אנלוגיה להליכים המפורטים בשלב 1.2. - דוגמאות של תרכובות מבודד מנותחים באמצעות NMR ספקטרוסקופיה. 11
הערה: NMR ספקטרוסקופיה ניסויים מבוצעים על ידי טכנאי מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PHWE ציפורן. כאשר מנסים לבצע את הצעד מיצוי נוזל-נוזל, התלמידים נתקלו לעתים קרובות אמולסיות (התוספת של מלח היה בדרך כלל לא יעיל). בשלב זה התלמידים הונחו כדי לאפשר את התערובת לעמוד בתוך המשפך הפרדת בזמן שהם חקרו את ההשפעות של הרכב eluent על ההפרדה של eugenol, acetyleugenol על ידי TLC. יצוין, שכי הקסאן. הרבה עם heptane ב או דיכלורומתאן שלב שאיבת נוזל-נוזל. 9 תלמידים הוקצו TLC יחס בממיסים של אציטון, ציקלוהקסאן, מסופק עם סטנדרטים טהור של eugenol acetyleugenol ולאחר מכן ביצע ניתוח TLC (איור 3). התוצאות שלהם היו ייערכו על לוח, ההשפעות של הרכב ממס על הגורם השמירה (Rf) ו- eluent של האופטימלית, נחשבו דיון קבוצתי (טבלה 1). קומפוזיציות הממס אופטימום המזוהה על-ידי תלמידים בדרך כלל נע בין 5-20% אצטון/ציקלוהקסאן עם ΔRf בין 0.1-0.2.
בעקבות TLC eluent אופטימיזציה, סטודנטים חזר עקירות eugenol שלהם. תמצית ציפורן גסה (המורכב בעיקר של eugenol ו acetyleugenol) היתה מבודדת ב- 4-9% w/w. בפגישה השנייה של ניסוי זה, התלמידים לנצל חומצה בסיס מאפיינים שונים של שתי מולקולות אורגניות הגדולות להפריד ביניהם על ידי מיצוי נוזל-נוזל. בדרך כלל, eugenol היתה מבודדת בתשואה של % 45-65 w/w של התמצית גולמי בעוד acetyleugenol היה בבידוד תשואה של 5-10% w/w של התמצית גולמי. סטודנטים מנוצל ואז את eluent אופטימיזציה (המזוהה כמתואר לעיל) כדי לקבוע את ההצלחה של מיצוי נוזל-נוזל שלהם על ידי השוואה של תמציות שלהם כדי הדגימות טהור הפניה על-ידי TLC (איור 3). התלמידים ניתח גם לחלץ ציפורן גסה שלהם, ואת דוגמאות מטוהרים שלהם eugenol, acetyleugenol על-ידי ביצוע פורייה-(FTIR) ספקטרוסקופיית. 9 פסגות הממס או מים נצפו לעתים ב- IR ספקטרה עקב הליכי עבודה שבוצעה כהלכה (או הכנת הדוגמא המסכן).
לתארים מתקדמים מחויבת כ מחצית שלהם נפט גולמי מבודד שאיבת נוזל-נוזל שתוארו לעיל ונחשפו החלק השני עמודה פלאש כרומטוגרפיה (מידע נוסף מסופק מידע תמיכה). למרות השלמת מיצוי נוזל-נוזל והשלבים כרומטוגרפיה עמודה פלאש בהפעלה ארבע שעות יחיד עשוי להופיע שאפתני למדי זה היה השגה עבור רוב התלמידים מתקדמים התחייבות הניסוי הזה. ההפרדה המלאה של eugenol מ- acetyleugenol על ידי טור פלאש כרומטוגרפיה הושגה רק לעתים רחוקות בשל גורמים קרובים השמירה שלהם (איור 4). עם זאת, תלמידים הצליחו בדרך כלל לאסוף כמה שברים המכיל eugenol טהור. לתארים מתקדמים נשאלו ואז להגיב על שתי טכניקות טיהור שונים במסגרת הדו ח שלהם.
PHWE של קוראה reflexa. התלמידים לבצע את PHWE של reflexa קוראה בסיוע מינימלי של המדריך מעבדה. במהלך השלב מיצוי נוזל-נוזל אמולסיות בדרך כלל נוצר ואת התלמידים לעיתים קרובות נדרשו כדי לאפשר את התערובת לעמוד את משפך מפריד (ח ~0.25) עם עצבנות תקופתי של התערובת עם מוט זכוכית. הטיהור כרומטוגרפי של התמצית גולמי הושלמה בנוחות בתוך ארבע שעות מעבדה ההפעלה על-ידי תלמידים. Seselin (+) ו- epoxysuberosin היו מבודדים של התשואות של עד 1.1% w/w ו- 0.9% w/w, בהתאמה, מבודד דוגמאות הן תרכובות נותחו על ידי 1H ו- 13C NMR, FTIR ספקטרוסקופיה (איור 2). ואילו הסטודנטים התחייבה FTIR ספקטרוסקופיה ניסויים ודוגמאות מוכן עבור NMR ספקטרוסקופיה, טכנאי מעבדה ביצע ניסויים ספקטרוסקופיה NMR. התוצאות המתקבלות על-ידי תלמידים היו בקנה אחד עם העבודה שפורסמו בעבר. 11
למרות זאת לא הוצגה בדו ח זה, בפועל, ניסוי זה כולל גם החלק השני כי האתגרים זן צמחים לא נחקרה העסקת PHWE (מידע נוסף מסופק בתמיכה התלמידים לבצע את החילוץ מידע).
איור 1. PHWE ציפורן. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. PHWE של קוראה reflexa. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . צלחת TLC נציג שהוכנו על ידי סטודנט. (10% אצטון / • תנאי ציקלוהקסאן). ליין 1 (ה): eugenol תקן; ליין 2 (גולמי): גולמי ציפורן תמצית; ליין 3 (א): acetyleugenol רגיל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| אצטון / ציקלוהקסאן (%v/v) | זאת אומרת אצטיל-eugenol Rf | אצטיל-eugenol Rf (σ) | זאת אומרת eugenol Rf | eugenol Rf (σ) | זאת אומרת ΔRf | מספר ניתוחים TLC |
| 0 | 0.06 | 0.08 | 0.04 | 0.06 | 0.02 | 12 |
| 5 | 0.34 | 0.11 | 0.27 | 0.09 | 0.07 | 15 |
| 10 | 0.45 | 0.07 | 0.34 | 0.05 | 0.12 | 20 |
| 20 | 0.51 | 0.07 | 0.41 | 0.06 | 0.10 | 20 |
| 30 | 0.58 | 0.10 | 0.49 | 0.12 | 0.10 | 19 |
| 40 | 0.63 | 0.08 | 0.56 | 0.08 | 0.07 | 16 |
| 50 | 0.76 | 0.08 | 0.73 | 0.08 | 0.03 | 17 |
| 60 | 0.77 | 0.13 | 0.73 | 0.15 | 0.04 | 12 |
| 70 | 0.84 | 0.13 | 0.81 | 0.13 | 0.03 | 11 |
| 80 | 0.90 | 0.06 | 0.87 | 0.08 | 0.02 | 10 |
| 90 | 0.88 | 0.06 | 0.87 | 0.05 | 0.01 | 11 |
| 100 | 0.87 | 0.13 | 0.86 ולגובה | 0.14 | 0.02 | 6 |
טבלה 1- טבלת גורמי שמירת חלוקה לרמות את השפעת eluent הרכב ב- Rf.
איור 4 . TLC נציג לוחות שהוכנו על ידי התלמידים. משמאל: צלחת TLC ניתוח התוצאה של השלב מיצוי נוזל-נוזל (10% אצטון / • תנאי ציקלוהקסאן). ליין 1 (ה): eugenol הפניה תקן; ליין 2 (לב): eugenol המכילות אורגני לחלץ; ליין 3 (א): תקן הפניה acetyleugenol; ליין 4 (לן): acetyleugenol המכילות תמצית אורגנית. מימין: צלחת TLC ניתוח התוצאה של עמודה פלאש כרומטוגרפיה צעד (10% אצטון / • תנאי ציקלוהקסאן). מספרים על הצלחת TLC מתייחסות למספר שבר מבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך קלאסית לבידוד eugenol מן ציפורן מאת בקיטור כבר חלק מהתוכנית מעבדה ביניים כימיה ב אוניברסיטת סידני במשך עשרות שנים, אבל היה מודרניזציה להעסיק מתודולוגיה PHWE 2016 (איור 1). 9 , 18 זה מסופק עם הטבות מס. ראשית, ניצול מכונות אספרסו ביתיים בסביבת מעבדה מיד ריתק, העוסקים סטודנטים על ידי הממחישות את היישום של שיטה חלופית-קלאסי אפקט מחקר מדעי מסורתיים. בנוסף, שיטה חדשה להפחית את משך הזמן להשלמת החילוץ וזמין שילוב של תרגילים נוספים לתוך איטרציה חדש זה של הניסוי. באופן ספציפי, פעולה זו מותרת דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) כדי להיות מוצג (וגם פלאש כרומטוגרפיה עמודה עבור לתארים מתקדמים).
הניסוי מתמקד PHWE ציפורן תוכנן כמו מעבדה מבוא שתתנסו לתלמידי שנה שנייה לתואר ראשון בכימיה ומסיבה זו expository תכונות הלימוד. 9 יותר תיאורית, המתכון-סגנון זה ההליך מאפשר לתלמידים עם ניסיון מוגבל בכימיה אורגנית להשלמת ביעילות את החילוץ של eugenol של ציפורן. בניסוי זה, הם מושגים כמו חומצה בסיס מיצוי של תרכובות חומצי, ניצול TLC לזהות את הרכב eluent מתאימים עבור כרומטוגרפיה, ושימוש המאדה הציג או מחוזק ע י שילוב של וידאו מעבדה מראש ופשוט הפגנות והדרכה אישית. רכיבים משלימים שנלקחו במהלך המפגשים שהוקצה שני, התלמידים בזרם מתקדם של הכימיה מתווך גם המופרדים eugenol, acetyleugenol באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, לקבוע את זהותו של הרכיבים שחולצו באמצעות חום ואהבה. בפגישה השנייה, תלמידים אפשר להשוות באופן ביקורתי את שיטות ההפרדה שני. ככלל, תלמידים הצליחו להשלים את הניסוי הכולל בתוך התקופות שהוקצה ארבע שעות שני עם הדרכה מינימלי.
הניסוי מתמקד PHWE ואת הבידוד של seselin, (+)-epoxysuberosin מ reflexa קוראה פותחה עבור סטודנטים שנה ג' לתואר ראשון בכימיה סטודנטים מנוסים יותר. ראוי לציין, התרגיל למידה היתה תוצאה של מחקר שמקורם במעבדות מחקר. 11 איטרציה הראשון של הניסוי סופחה לתוך התוכנית מעבדה כימיה לתואר ראשון שנה ג' באוניברסיטה של טסמניה בשנת 2015. אחרי שנתיים של מהדורות והערכה מחדש, ניסוי זה בוצע על ידי מחלקה שנה שלישית לתואר ראשון בפעם השלישית ב-2017.
ניסוי זה תוכנן במיוחד פעילות מודרכת-וסקרנות השואפת לדמות כמה מן הגישות המועסקים מעבדות מחקר מוצרים טבעיים ותכונות מינימלי הוראות בכתב. זוהי חוויית לימוד מכוון תלמיד, המדריך מעבדה ממלא תפקיד מרכזי בקליטת תלמידים כפי שהם פועלים דרך הניסוי על-ידי מתן כיוון כנדרש. בניסוי זה, לתלמידים לפתח מיומנויות מעבדה מפתח הכרומטוגרפיה ולהעסיק NMR ספקטרוסקופיה לביצוע מבנה הבהרה. חוויה מעבדה זו מחזקת את הרעיון של bioprospecting אשר מוצג בפני התלמידים בכיתה ואת זה ניתן להרחיב מחקרים על חומר צמחי בעבר מחקר כלשהו כדי לספק חוויה יותר ייצוגית של מוצרים טבעיים bioprospecting. Reflexa ג הוא מין אנדמי צמח אוסטרלי, עם זאת, הרבה דגימה זו מכדי עלה המתאים חומר ממינים אחרים מפעל יבשתי בניסוי זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את בית הספר למדעי הטבע - כימיה, אוניברסיטת של טסמניה ואת הספר לכימיה, אוניברסיטת סידני עבור תמיכה כספית. B.J.D., ג'יי ג'יי תודה הממשלה האוסטרלית על מחקר הכשרה תוכנית מלגות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| espresso machines | Breville/Sunbeam | Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| rotary evporators | Buchi and Heidolph | ||
| cloves (plant material) | Dijon Food Pty Ltd | Cloves must be ground in a food processor for students. | |
| Correa reflexa (plant material) | sample obtained in Tasmania | Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania | |
| sand | Ajax | 1199 | |
| ethanol | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| hexanes | Ajax | 251 | |
| magnesium sulfate | Ajax | 1548 | |
| diethyl ether | Merck | 1009215000 | |
| silica on aluminium TLC plates | Merck | 1055540001 | |
| eugenol | Merck | 1069620100 | |
| eugenyl acetate | Aldrich | W246905 | |
| acetone | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| cyclohexane | ChemSupply | CA019 | |
| silica gel 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63um (230-400mesh) |
| Congo red paper | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% hydrochloric acid | Ajax | 256 |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
- Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
- Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
- Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
- Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
- Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
- Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
- Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
- Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
- Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
- Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
- Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
- Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
- Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
- Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
- Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
- Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. , 2923-2925 (1978).
