Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

الرقمية البلمرة المتسلسل (PCR) أداة مفيدة للكشف عن حساسية عالية من النوكليوتيدات واحدة المتغيرات والمتغيرات في عدد نسخ الحمض النووي. هنا، علينا أن نظهر الاعتبارات الرئيسية لقياس المتغيرات نادرة في الجينوم البشري باستخدام PCR الرقمية مع تنسيق رقاقة في أنبوب.

Abstract

التحليل الكمي للتباينات الوراثية البشرية أمر حاسم لفهم الخصائص الجزيئية للحالات الطبية الخطيرة، مثل الأورام. لأن رقمي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) تمكين التحديد الكمي الدقيق للمتغيرات في عدد نسخ الحمض النووي، وأصبحت أداة أساسية للكشف عن الاختلافات الوراثية نادرة، مثل الطفرات المقاومة للعقاقير. ومن المتوقع أن تتاح في الممارسة السريرية التشخيص الجزيئي باستخدام PCR الرقمية (دبكر) في المستقبل القريب؛ وهكذا، كيفية القيام بكفاءة دبكر مع المواد الجينية البشرية موضوعا ساخنا. هنا، نحن نقدم وسيلة للكشف عن mosaicism القولونية غدومي العائلية (APC) جسدية استخدام دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، الذي يسمح لردود الفعل دبكر الثمانية التي ستجري في نفس الوقت. وينبغي توخي الحذر عند ملء وختم الخليط رد فعل على رقائق البطاطس. يوضح هذا المقالة كيفية تجنب أكثر-والتقليل من أقسام إيجابية. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم إجراء بسيط لتجميع المنتج دبكر من الأقسام على الرقائق، التي يمكن استخدامها بعد ذلك لتأكيد التضخيم محددة. نأمل أن يساعد هذا التقرير أساليب تشجيع دبكر مع الأسلوب رقاقة في أنبوب في الأبحاث الجينية.

Introduction

PCR الكمي (qPCR) يستخدم غالباً لتقدير التباين الوراثي البشري، بما في ذلك المتغيرات النوكليوتيدات واحدة (سنفس) والحمض النووي نسخ عدد الاختلافات (كنفس). في قبكر، تتم تفاعل البلمرة في كل أنبوبة بنفس الطريقة كما هو الحال في PCR نقطة النهاية التقليدية، وتكتسب إشارة تضخيم من الأنبوب بعد كل دورة حرارية. على النقيض من ذلك، في دبكر، دبكر نقطة النهاية في هذا التقرير، بمعنى الخليط PCR يتم تحميلها في العديد من الدوائر المجهرية، وصف الأقسام، حيث تعتبر قوالب الحمض النووي الحاضر أو الغائب في إضعاف الحد، وكل قسم يتم تقييم المحتوية على مزيج PCR سلبية أو إيجابية بعد بكر كاملة. وفي حين أنه من السهل تقدير أنه لا توجد أية قوالب الحمض النووي في الأقسام السلبية، الواضح كم عدد نسخ الحمض النووي قوالب موجودة في الأقسام إيجابية. ولذلك، يقدر العدد قوالب الحمض النووي في الأقسام إيجابية استناداً إلى توزيع بواسون، باستخدام العدد من أقسام السلبية1. دبكر أكثر تكلفة وقد أصغر مجموعة ديناميكية بالمقارنة مع قبكر، ولكن هذا الأسلوب يتيح القياس الكمي مطلق ويوفر أعلى حساسية و دقة أكبر2.

واحد من التطبيقات الرئيسية دبكر هو التحقق المتغيرات المحددة حسب تسلسل الجيل القادم (خ ع). لا سيما في حالة نادرة المتغيرات، معنى الكسور الخيار منخفض، التحقق من صحة أمر حاسم نظراً لتسلسل الأخطاء التي قد تحدث في خ ع3. بينما سانغر التسلسل وقبكر أدوات مفيدة للتحقق من سنفس وكنفس، وحساسيتها منخفضة مقارنة دبكر. ولذلك، التكنولوجيا دبكر في الطلب على الدراسات الجينية التي تتعامل مع المتغيرات ونادرة. في الآونة الأخيرة، أصبح الكشف عن طريق خزعة سائلة النادرة المتغيرات المتصلة بخصائص السرطان، مثل مقاومة العقاقير، موضوعا ساخنا في التشخيص الجزيئي والعلاج4. التكنولوجيا دبكر يبدو مناسباً للدراسات خزعة سائلة ومن المتوقع أن تكون التطبيقات السريرية الهامة في المستقبل القريب، على الرغم من التحسينات المتعلقة بالنطاق الديناميكي والتكلفة مطلوبة لا يزال يتعين تنفيذها.

ويمكن تصنيف التكنولوجيا المتاحة تجارياً دبكر تقريبا في الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية، والمستندة إلى شرائح؛ والفرق كيف تكون القوالب الحمض النووي مقسمة5،،من67. في دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، يوزع الخليط بكر بعمل شعري في الأقسام الموجودة على شريحة. الرقائق مبنية في شرائط ثمانية أنابيب، سوف يكون على دراية فيها العديد من الموظفين في المعمل، وهكذا، يمكن أن يعامل ثماني عينات في وقت واحد8. في الخطوة القراءة، فإنه يأخذ < ح 1 لعلاج 96 عينات عن طريق الكشف عن الصورة بأكملها في شرائح ولا كل قسم. منذ دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب إنتاجية عالية بالمقارنة مع غيرها من نظم دبكر، سهولة الاستخدام والإنتاجية هي من المزايا الرئيسية لمستخدميها.

في هذا التقرير، mosaicism جسدية الجين APC في مريض مع المرجلات غدومي متفرقة كحالة ممثلة وتتم مقارنة نتائج دبكر وفئة الخدمات العامة الوطنية. والغرض الرئيسي من هذا التقرير بوضوح تحديد مقدار متغير النوكليوتيدات واحدة باستخدام دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب. ونأمل أن هذا التقرير مفيد للباحثين المهتمين باعتماد دبكر منهاج العمل الخاصة بهم.

Protocol

تصميم الدراسة وافقت "مجالس المراجعة المؤسسية مدرسة" الطب في جامعة هاماماتسو (ز-260-4). تم الحصول على الموافقة الخطية من المريض ووالديه.

1-مراقبة الجودة للحمض النووي

ملاحظة: تم استخراج الحمض النووي (جدنا) من الدم الطرفية باستخدام الأسلوب تنقية الحمض النووي المستندة إلى غشاء والسليكا راسخة. مقدما أدناه الإجراءات، تقرر تركيز جدنا باستخدام جهاز المطياف الضوئي.

  1. إعداد نموذج جدنا بتركيز 10 – 100 نانوغرام/ميليلتر.
  2. إضافة 10 ميليلتر من المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي لقطاع 8-أنبوب.
  3. أضف 1 ميليلتر من سلم الحمض النووي أو جدنا للأنابيب. دوامة المخلوط لمدة 1 دقيقة باستخدام المرفق الميكروسكوبية.
  4. تحميل الأنبوب والجهاز جل الماصة نصائح في الصك التفريد (جدول المواد)، وبدء التشغيل بالضغط على زر 'ابدأ'.
    ملاحظة: سوف تعمل نظام التفريد تلقائياً بنقرة واحدة على زر ابدأ.
  5. التأكد من أن علامة الدنيا الواردة في المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي يتم تعيين بشكل صحيح في اليكتروفيروجرامس. إذا كان يتم تعيينه بشكل غير صحيح، يدوياً تعيين العلامة في 'الوضع اليكتروهيروجرام' من البرنامج.
    ملاحظة: عدد سلامة الحمض النووي (DIN) سيتم تلقائياً حساب. وتأتي قيمة الدين من سلامة الحمض النووي. ارتفاع وانخفاض قيم الدين تشير إلى جدنا سليمة جداً والمتدهورة بشدة، على التوالي.
  6. تحديد حجم منطقة جدنا (> 200 bp) في 'وضع المنطقة' من البرنامج لحساب تركيز جدنا (> 200 bp) تلقائياً.

2-التمهيدي وتصميم مسبار

  1. حساب القيم ذوبان درجة الحرارة (Tm) باستخدام أي أداة الوصول المفتوح تحت الظروف التالية: القواعد 10 – 25، 50 مم نا+/K+ودنتبس 0.80 مم 3 مم Mg2 + (جدول المواد). تصميم الإشعال إلى الأمام وعكس لتضخيم منطقة الجينوم المحتوية على الآليلات المستهدفة مع قيمة Tm حوالي 60 درجة مئوية وطول أمبليكون في 100 – 300 بي بي.
    ملاحظة: الرجوع إلى الجدول 1 لتركيز النوكليوتيد.
  2. تصميم مؤمن الحمض النووي (LNA) يسبر الآليلات مرجع ومتغير استناداً إلى الشروط التالية: (ط) 1 – 6 لناس موجودة في كل التحقيق؛ (ثانيا) صبغة فلورسنت وتقضي موجودة في 5 '-3'--تيرمينوسيس من كل التحقيق، وعلى التوالي؛ (ثالثا) الفرق بين قيمm T المسابير المتطابقة وغير المتطابقة > 10 درجة مئوية؛ (رابعا) تيم القيم من المسابر المتطابقة وغير المتطابقة أعلى وأقل من تلك التي للإشعال، على التوالي [مثلاً، التمهيدي إلى الأمام: 60.8 درجة مئوية، وعكس التمهيدي: 59.8 درجة مئوية، مرجع اليل مسبار (مطابقة/متطابقة): 62.6/45.3 درجة مئوية، والبديل مسبار اليل (مطابقة/متطابقة): 61.7/50.5 درجة مئوية]. وحسبت قيمm T باستخدام أداة الوصول المفتوح وتستخدم أيضا لخطوة 2، 1.
  3. التأكد من أن تصميم كبسولة تفجير والمسابير لا تشمل مجمع الأشكال المتعددة في النوكليوتيدات واحدة مع تردد > 0.1% كما هو محدد من قواعد البيانات [مثلاً، قاعدة "واحدة نوكليوتيد تعدد الأشكال" (dbSNP)].

3-الرقمية [بكر]

  1. إعداد الإشعال وتحقيقات، وحلول جدنا الأسهم في تركيزات المبينة في الجدول 1 مع مخزن مؤقت الشركة المصرية للاتصالات وتخزينها في-20 – 4 درجة مئوية.
  2. مزيج الكواشف في درجة حرارة الغرفة في إجمالي حجم 15 ميليلتر لتركيز نهائي كما هو موضح في الجدول 1.
    1. إضافة 3 ميليلتر من الماء المقطر بدلاً من جدنا في عنصر تحكم لا قالب (المجلس الوطني الانتقالي).
    2. إعداد 3.5 x كمية الخليط PCR في ثلاث نسخ لحساب الخطأ بيبيتينج.
  3. "الماصة؛" الخليط PCR صعودا وهبوطاً لمزجها.
  4. تعيين منصة التحميل على رقائق بنيت في قطاع غزة 8-أنبوب وتعيينها على الملقم الآلي. التأكد من أن هناك اتصال بين الرقاقة ومنصة التحميل.
  5. تناسب تحميل شريط تمرير على النظام الأساسي وعقد المنزلق بسداده الخروج من المحمل.
  6. "الماصة؛" 15 ميليلتر من خليط بكر على المنصة قرب غيض من شريط التمرير (الشكل 1أ).
  7. تشغيل المحمل بالضغط على زر المحمل (لحوالي 1 دقيقة).
    ملاحظة: أنها ليست مشكلة إذا بقيت كمية صغيرة من الخليط بكر على المنصة. فمن الممكن تشغيل تسلسلياً المحمل.
  8. تعيين الرقاقة-في--أنبوب مليئة بمزيج PCR في فتحه جانبية لمحسن الختم. دفع غطاء الشريحة وحافة الغطاء العلوي لعدم كسر الرقاقة (الشكل 1ب).
  9. تشغيل محسن الختم (تقريبا 2 دقيقة). أعد تشغيل محسن الختم لمدة 1 دقيقة تسلسلياً إذا بركة سائل لا تزال مرئية لأنه يتسبب ختم غير مكتملة تلوث عبر الإشارات الإيجابية (الأرقام 1 ود 1).
  10. إضافة ميليلتر 230 من ختم السائل، وكاشف القائم على النفط، إلى الأنابيب.
    ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة الرقائق الآن في السائل.
  11. تعيين الأنابيب في cycler الحرارية. قم بتشغيل cycler الحرارية كما هو موضح في الجدول 2 (لحوالي 2 ح). ضبط درجة الحرارة أو مدة بكر إذا كان هناك توزيع غير متكافئ لأقسام الإيجابية (الشكل 1).
    ملاحظة: من المستحسن تعيين معدل الانحدار إلى حوالي 1 ° C/s.
  12. ترك هذه الأنابيب في cycler الحرارية لمدة 15 دقيقة على الأقل للحد من الضوضاء خط الأساس.
    ملاحظة: الأنابيب يمكن أن تترك بين عشية وضحاها كذلك. تم الكشف عن الإشارات الأسفار حتى اليوم التالي.
  13. تعيين الأنابيب على الرقصة الكشف وصب 6 مل ماء المقطر في الرقصة. إذا كانت مرئية فقاعات الهواء داخل وخارج الأنابيب، مسح عليها (1F الأرقام وز 1).
  14. تحميل الرقصة إلى الجهاز وتشغيله بالنقر على الزر 'تشغيل' للبرنامج بعد اختيار علامات التبويب فلوريسسيني، والتجربة، وعينه/المجلس الوطني الانتقالي (جدول المواد).
    ملاحظة: الكشف عن لون مزدوج من ثمانية عينات بكثافة افتراضي يأخذ حوالي 4-5 دقائق.
  15. تأكيد موقف المؤامرة، والرسم البياني ومؤامرة مبعثر 2D.
    ملاحظة: iIf كثافة fluorescence الأقسام سلبية عالية، وضبط كثافة بنقرة على زر إعدادات البرنامج بحيث أنها تقع ضمن نطاق 30 – 70.
  16. حساب الكسر اليل البديل (VAF) باستخدام الصيغة التالية:
    Equation 1
    هنا، السيرة الذاتية، والجمهورية التشيكية هي أرقام نسخ المتغير واليل المرجعية، على التوالي.
    ملاحظة: يتم حسابها تلقائياً في البرنامج على أساس إحصاءات بواسون.

4-جمع منتج PCR

  1. إزالة السائل ختم من الأنبوب.
  2. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات للأنبوب. الدوامة بشدة ل 30 s والطرد المركزي الأنبوب بإيجاز.
  3. نقل حل الشركة المصرية للاتصالات إلى أنبوب آخر، وإضافة 30 ميليلتر من خلات الصوديوم م 3 و 200 ميليلتر من الإيثانول.
  4. بارد الحل في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. الطرد المركزي الحل لمدة 30 دقيقة في 16,000 س ز وإزالة المادة طافية.
  6. إضافة 300 ميليلتر من الإيثانول 80% إلى الأنبوب ودوامه.
  7. الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة في 16,000 س ز وإزالة المادة طافية. تسمح متسرعا أيردري لمدة 5 دقائق.
  8. حل متسرعا في 1-5 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بعد التجفيف.
  9. إذا لزم الأمر، بتقييم حجم المنتج باستخدام أداة التفريد الإشارة إلى الخطوة 1. تحميل 1 ميليلتر من حل الجهاز جل لحساسية عالية (جدول المواد).

Representative Results

لقد استعرضنا mosaicism جسدية الجين APC في مريض مع المرجلات غدومي متفرقة وفقا للإجراءات المذكورة أعلاه. في دراسة سابقة، و الجيش الشعبي الكونغولي c.834 + 2T > تم العثور على الطفرات ج في المريض، ولكن ليس في والديهم، استخدام سانغر التسلسل وخ ع9. تصاميم أجهزة الإشعال والمجسات المستخدمة في نتائج تمثيلية مبينة في الجدول 3. تم استخراج الحمض النووي من الدم في بروباند والآباء والأمهات، وستة مانحين صحية. قيم الدين من تسعة العينات جدنا تراوحت إلى 6.7 – 7.9 (الشكل 2 و الجدول 4). الاتحاد الماليزي وعرافة استخدمت الأصباغ الفلورية الآليلات C و T، على التوالي. البقع الخضراء والصفراء على قطع الموقف تمثل أقسام الاتحاد الماليزي-إيجابية وست عشري-إيجابية، على التوالي (الشكل 3أ). بقع زرقاء تمثل أقسام السلبية للاتحاد الماليزي وست عشري. خلفية سوداء يناظر أقسام حيث لم يتم إضافة خليط رد فعل. تم الكشف عن أقسام إيجابية كثيرة من الآليلات C و T في بروباند، في حين تم الكشف عن أقسام الإيجابية القليلة من اليل ج في الأب بروباند أو المجلس الوطني الانتقالي، وكانت عدم الكشف عن اليل في الأقسام الأخيرة وإيجابية من T. فصل الإشارات بين الآليلات C و T كان واضحا في سكاتيربلوت (2-د) ثنائية الأبعاد، والإشارات الأكثر إيجابية من الهيكس والاتحاد الماليزي باستثناء بعضها البعض (الشكل 3ب). كان VAF بروباند 13.2 في المائة، ومماثل لتحديد استخدام خ ع (12.7%) (الجدول 4). وكانت فافس بروباند للآباء والأمهات والمانحين صحي < 0.1%. حد الكشف آسيا والمحيط الهادئ c.834 + 2T > طفرة ج تقدر 0.3% استخدام 3 × الانحراف المعياري للقياسات المتكررة مع 10 – 11 نانوغرام من مجموع جدنا10.

حجم amplicon في مقايسة دبكر APC c.834 + 2T > ج وكان من المتوقع أن تكون 123 شركة بريتيش بتروليوم. للتأكد من أن المنتج دبكر تم تضخيمها كعصابة واحدة، جمعت المنتج دبكر من رقاقة أسيد. استخدام التفريد، وضوح تم الكشف عن عصابة واحدة، وكان حجم المنتج متسقا مع التنبؤ (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1 : نقطة ملاحظة للمقايسة دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب. (أ) هذا الفريق يوضح كيفية إعداد قطاع 8-أنبوب في الملقم الآلي. (ب) هذا الفريق يظهر رقائق مكسورة. (ج) هذا الفريق يوضح كيف الرقاقة السطوح فقط بعد (ط) تحميل و (ثانيا) الختم. (ثالثا) بركة سائل مرئياً في حالة ختم غير مكتملة. (د) هذا الفريق يظهر المؤامرة الموقف فيما يتعلق تلوث عبر. (ه) هذا الفريق يظهر المؤامرة الموقف في حالة توزيع غير متكافئ. كيف الهواء (F) هذا الفريق يظهر فقاعات على سطح الأنبوب مغمورة بالمياه. (ز) هذا الفريق يظهر فقاعات الهواء داخل الأنبوب. في جميع أنحاء الشكل الكامل، تشير إلى قطع شرائح كسر رؤوس الأسود والأبيض والهواء فقاعات، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : اليكتروفيروجرامس الممثل من جدنا الدم. ويبين اليكتروفيروجرامس جدنا الدم مع قيم الدين من 6.7 و 7.9 في أعلى وأسفل لوحة، على التوالي. تشير العلامة النجمية إلى علامة أقل. الدين: عدد سلامة الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : نتائج الممثل الجيش الشعبي الكونغولي mosaicism جسدية استخدام دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب. Scatterplots (ب) لا-قالب عنصر التحكم (المجلس الوطني الانتقالي) وفي بروباند والأب يرد هنا ومؤامرات (A) الموقف. عرافة والاتحاد الماليزي تناظر الآليلات مرجع والبديل، على التوالي. الخطوط الأفقية والرأسية تشير إلى المستويات الدنيا شدة HEX والاتحاد الماليزي، على التوالي. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيو et al. 10- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : مجموعة من المنتجات دبكر من رقاقة أساييد. المنتجات دبكر المجمعة وتتركز تعرضوا للتفريد. وكان حجم الهدف المتوقع 123 شركة بريتيش بتروليوم. وقد تم تعديل هذا الرقم من كاهيو et al. 10-المجلس الوطني الانتقالي: لا قالب عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كاشف تركيز
حل الأسهم
وحدة التخزين (ميكروليتر) التركيز النهائي وأوصى
التركيز النهائي
خالية من الدناز/رناسي الماء المقطر - 1.75 - -
2 x ميكس سيد بكر - 7.5 - -
مسبار LNA اليل الرئيسية 2 ميكرومتر 0.5 66.7 شمال البحر الأبيض المتوسط 3.33-100 نانومتر
مسبار LNA للقصر اليل 2 ميكرومتر 0.5 66.7 شمال البحر الأبيض المتوسط 3.33-100 نانومتر
التمهيدي إلى الأمام 1 ميكرومتر 0.5 33.3 نيوتن متر 3.33-50.0 شمال البحر الأبيض المتوسط
عكس التمهيدي 1 ميكرومتر 0.5 33.3 نيوتن متر 3.33-50.0 شمال البحر الأبيض المتوسط
20 x دبكر الحل - 0.75 - -
جدنا 3.33 نانوغرام/ميكروليتر 3 666 جزء من الغرام/ميكروليتر 20 بيكوغرام/ميكروليتر – 2,000 بيكوغرام/ميكروليتر1

الجدول 1: الكواشف المستخدمة لفحص دبكر. 1 حسب المتوقع من الدقة والحساسية.

الخطوة درجة الحرارة الوقت دورات
الأولى تجريدها 95 درجة مئوية 5 m 1
تؤذي
الصلب والتمديد
95 درجة مئوية
58 درجة مئوية
50 s
90 s
42
التمديد النهائي 70 درجة مئوية 5 m 1

الجدول 2: شروط cycler الحرارية.

الاسم التسلسل1 تيم القيمة2
التمهيدي إلى الأمام 5-جتكاجاجتججاجااتك-3 60.8 درجة مئوية
عكس التمهيدي 5-تكتاجاككاتكتجكتكاتاكت-3 59.8 درجة مئوية
مسبار LNA اليل T 5-عرافة-على [أ] ككتجاككا-إيبفق-3 ' مطابقة: 62.6 ° C
متطابقة: 45.3 درجة مئوية
مسبار LNA اليل ج 5-الاتحاد الماليزي-TTT [ز] 3-ككتجاكك-إيبفق ' مطابقة: 61.7 درجة مئوية
متطابقة: 50.5 درجة مئوية

الجدول 3: تصميم أجهزة الإشعال والمسابير. 1 الأحرف المسطرة وبين قوسين هي LNA والبديل المستهدفة، على التوالي. 2 تحسب وفقا للخطوة 2 من البروتوكول.

خ ع3 دبكر4
نموذج1 الأنسجة إدخال الحمض النووي (الحرس الوطني) الدين2 VAF (%) البديل (نسخ) مرجع (نسخ) VAF (%)
يعني تحديد وضع اللاجئ
المجلس الوطني الانتقالي - - - - 1.23 0 N/A N/A
بروباند الدم 11.3 7.6 12.7 379 2.48 × 103 13.2 0.0353
الأب الدم 10.3 7.7 0.0167 1.08 3.42 × 103 0.0341 0.439
الأم الدم 10.8 7.6 0.0136 0.956 3.04 × 103 0.0313 0.637
1-الجهات المانحة الدم 11.7 7.3 - 1.64 3.01 × 103 0.0543 0.414
2-الجهات المانحة الدم 10.5 7.6 - 1.06 2.90 × 103 0.0406 0.539
3-الجهات المانحة الدم 17.6 7.9 - 4.24 5.65 × 103 0.0713 0.783
4-الجهات المانحة الدم 12.3 7.6 - 2.38 4.16 × 103 0.0666 0.557
5-الجهات المانحة الدم 19.2 7 - 1.48 6.79 × 103 0.0213 0.571
6-الجهات المانحة الدم 14.4 6.7 - 3.44 4.67 × 103 0.0728 0.729

جدول 4: نتائج دبكر الاعتداء على آسيا والمحيط الهادئ جسدية mosaicism. 1 المجلس الوطني الانتقالي: لا قالب التحكم؛ : مانح صحية. 2 الدين: عدد سلامة الحمض النووي. 3 إيويزومي et al. 9، همهمة الجينوم var. 2 15057 (2015). 4 التجارب التي تم تشغيلها في x 3 ثلاث والمتكررة بشكل مستقل؛ البيانات يتم التعبير عنها كقيمة متوسط؛ تحديد وضع اللاجئ: الانحراف المعياري النسبي؛ N/A: غير قابل للتطبيق. وقد تم تعديل الجدول من كيو et al. 10.

Discussion

قيمة الدين غالباً ما يستخدم لتقييم تلف الحمض النووي (مثلاً، جدنا من الفورمالين--الثابتة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين) قبل القياس الكمي أو التسلسل، لأنه يمكن أن يؤدي تدهور متقدم من جدنا في البيانات ذات الجودة المنخفضة. ، وهكذا أصبح تقييم الدين خطوة هامة في مجال مراقبة نوعية جدنا البشرية11. حيث تم تخزينها جدنا استخدمت في التجربة التمثيلية عند 4 درجة مئوية لمدة 4-11 بعد استخراجه من الدم، تحددت قيم الدين لمراقبة الجودة قبل الإنزيم دبكر. يوصي بهذه الخطوة لا سيما إذا كانت المواد التي يشتبه في أن يكون معطوباً. كما تقرر تركيز جدنا بالتفريد. لمجموعة ديناميكية من دبكر ليست واسعة بالنسبة قبكر بسبب القيود المفروضة على الأقسام، قياس تركيز جدنا خطوة هامة مقايسة دبكر ناجح. المبلغ لإدخال الحمض النووي كان يرتبط بعدد نسخ مجموع الآليلات البديل ومرجع في مقايسة دبكر (التربيعي = 0.935؛ الجدول 4)، التفريد مفيد لقياس تركيز جدنا قبل الفحص دبكر.

التحميل وختم عمليات خطوات هامة لتحقيق نتائج ناجحة. من الأهمية بمكان تأكيد تصاعد مناسبة من خليط بكر على المنصة وتأمين الاتصال بين الرقاقة ومنهاج العمل (الشكل 1أ). نتوء PCR خليط من شريط التمرير يمكن أن يسبب توزيع غير صالح على رقاقة. يؤكد توزيع الأقسام الإيجابية والسلبية على مؤامرة موقف ضروري أيضا لإجراء تحليل دقيق، لأنه يفترض في إحصاءات بواسون أن قوالب الحمض النووي هي مقسمة عشوائياً إلى الدوائر1. في النتائج التمثيلية، ووزعت أقسام الإيجابية في جميع أنحاء شرائح (الشكل 3). هذه النتيجة يفي بالحاجة إلى إحصاءات بواسون، ويعكس أن التحميل وختم الإجراءات كانت فعالة. عند وضع الأنابيب محسن الختم، يمكن تقسيم الرقائق إذا دفعت أيضا بشدة الجزء المركزي من الغطاء العلوي (الشكل 1ب). لتجنب هذا الأمر، دفع بلطف على حافة الغطاء العلوي. إذا كان هناك كتلة مصطنعة من أقسام الإيجابية (الشكل 1د)، قد يمكن المبالغة عدد نسخ نتيجة تلوث المتبادل بين الأقسام. وينبغي تحسين إجراءات ختم إذا كان مرئياً بركة سائل على السطح (الشكل 1ج) (مثلاً، بواسطة التسلسل إعادة تشغيل محسن الختم لمدة 1 دقيقة). إذا كان هناك توزيع غير متكافئ لأقسام الإيجابية (الشكل 1)، عدد النسخ قد الاستهانة بسبب عدم كفاية التضخيم أو تلوث المياه والسوائل الختم. وينبغي تعديل شروط بكر في هذه الحالة [مثلاً، بضبط درجة الحرارة أو فترة الاسترداد (الخطوة 3.11 من البروتوكول)، أو بضمان أن ختم السوائل والمياه تدفقت الرقصة نظيفة]. يتم الكشف عن الإشارات الأسفار من قطاع غزة 8-أنابيب مغمورة في الماء المقطر. إذا كان الالتزام فقاعات الهواء إلى سطح الأنبوب، هناك إمكانية أنها قد تتداخل مع الكشف عن إشارة (الشكل 1F). ولذلك، يجب أن يتم مسح فقاعات باستخدام أداة مثل تلميح ماصة غرامة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل فقاعات الهواء داخل الأنابيب عندما يتم تعيين في الرقصة (الشكل 1ز). إذا كانت الفقاعات داخل الأنابيب كبيرة بما يكفي لتغطية الرقاقة، ينبغي أيضا تطهيرها. وقد مسح الفقاعات إذا فهي تترك لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قد يتم الكشف عن بعض أقسام إيجابية في المجلس الوطني الانتقالي. لتجنب تلوث من قوالب الحمض النووي، الحفاظ على مقاعد البدلاء نظيفة، وإذا كان ذلك ممكناً، جعل مساحة نظيفة مع وحدة تصفية مروحة. في حالة الاشتباه في تلوث قوالب الحمض النووي، دقة تنظيف الفضاء و/أو تجاهل والكواشف المستخدمة. وفي المقابل، إذا لم يتم الكشف عن أقسام إيجابية من اليل مرجع حضور جدنا، تأكيد تركيزات جدنا والإشعال، وتحقيقات. جدير بالذكر أن استخدمت الإشعال بتركيز أقل في التجربة التمثيلية، بالمقارنة مع التقليدية بكر (الجدول 1)12. من المهم أيضا تأكيد معدل المنحدر، الذي نادراً ما يتم تبديل في PCR التقليدية.

ما الذي يجعل دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب فريدة من نوعها هو تقسيم الخليط بكر داخل ال8،العالمي 8-أنبوب قطاع13. نقل تقسيم الدوائر في أنبوب PCR ليس مطلوباً في هذا النظام، مما يقلل من مخاطر التلوث. وهناك أيضا ميزة في نظام دبكر مع رقاقة في أنبوب تنسيق؛ فإنه يأخذ < 4 ح لإنهاء فحوصات 96 في هذا النظام دبكر، بينما يستغرق على الأقل 5 ساعات للانتهاء من نفس العدد من فحوصات في دبكر المستندة إلى الحبرية14. وعلاوة على ذلك، تمكن قطاع 8-أنبوب العالمي استخدام cycler الحرارية التقليدية، خلافا لآخر دبكر القائم على رقاقة15، الأمر الذي يتطلب من cycler حرارية مع كتلة مسطحة. أيضا، يمكن تطبيق المعرفة المتراكمة والمواد الكاشفة لبكر التقليدية إلى نظام دبكر. وهذا سيكون مفيداً لتوسيع نطاق تطبيقات دبكر.

تجدر الإشارة إلى أن دبكر نقائص عديدة. في دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، رقم القسم من شرائح منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تلك الموجودة في غيرها من منصات دبكر. سيطلب المزيد من التحسين للجهاز رقاقة زيادة النطاق الديناميكي، الذي يعتمد على عدد الأقسام. نظراً لأن المساحة الداخلية للأنبوب عالمية محدودة، مطلوب تصميم اختراق للجهاز رقاقة لزيادة عدد الأقسام. أتمتة الإجراءات دبكر أسرة في المستقبل سوف يقلل كثيرا من الأخطاء البشرية، أسفر عن نتائج يمكن الاعتماد عليها أكثر. بسبب طابعها الفائق وحساسية عالية، يتوقع دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب ليتم تطبيقها على علاج عدد من عينات الخزعات السائلة والحمض النووي البيئية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة معونات ل Scientific Research (C) من "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) (رقم 15 ك 08397) إلى Tomoaki كيو، والمنح المقدمة من الوكالة اليابانية "الأبحاث الطبية" والتنمية (AMED) (رقم 927960719)، معونات للبحوث الاستكشافية (رقم 16 ك 15256)، الإنفاق للمشاريع المرتبطة بها ميزانية الحوافز الخاصة للترويج لإصلاح الجامعة الوطنية في إدارة نفقات المنح (رقم 1019253)، ومؤسسة أبحاث التدخين إلى هاروهيكو سوجيمورا. يشكر المؤلفون الدكتور إيوايزومي والدكتور كوراتشي لدعمهم السريرية. وكان الممولين أي دور في إعداد المخطوطة. رقم 3و رقم 4و الجدول 4 يتم تكييفها وطبعها من مقال قبل كيو et al. 10، بإذن من السفير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter