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Cancer Research

डिजिटल पोलीमरेज़ एक छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस रोगी में आनुवंशिक भिंनता के लिए श्रृंखला प्रतिक्रिया परख चिप का उपयोग कर-a-ट्यूब प्रारूप

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) सिंगल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और डीएनए कॉपी नंबर वेरिएंट की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यहां, हम मानव जीनोम में दुर्लभ वेरिएंट चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ डिजिटल पीसीआर का उपयोग मापने के लिए महत्वपूर्ण बातों का प्रदर्शन ।

Abstract

मानव आनुवंशिक भिंनता का मात्रात्मक विश्लेषण गंभीर चिकित्सा शर्तों, जैसे ट्यूमर के आणविक विशेषताओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । क्योंकि डिजिटल पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) डीएनए कॉपी संख्या वेरिएंट के सटीक ठहराव सक्षम, वे दुर्लभ आनुवंशिक रूपों का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन रहे हैं, ऐसे दवा प्रतिरोधी उत्परिवर्तनों के रूप में । यह उम्मीद है कि आणविक निदान डिजिटल पीसीआर (dPCR) का उपयोग निकट भविष्य में नैदानिक अभ्यास में उपलब्ध हो जाएगा; इस प्रकार, कैसे कुशलतापूर्वक मानव आनुवंशिक सामग्री के साथ dPCR आचरण के लिए एक गर्म विषय है । यहां, हम एक विधि परिचय एडिनोमेटस पोलीपोसिस कोलाई (APC) दैहिक मोज़ेक चिप के साथ dPCR का उपयोग कर का पता लगाने में एक ट्यूब प्रारूप है, जो आठ dPCR प्रतिक्रियाओं को एक साथ आयोजित होने की अनुमति देता है । देखभाल जब भरने और चिप्स पर प्रतिक्रिया मिश्रण सील लिया जाना चाहिए । यह आलेख प्रदर्शित करता है कि कैसे से बचने के लिए और अधिक सकारात्मक विभाजन के अनुमान । इसके अलावा, हम चिप्स, जो तब विशिष्ट प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर विभाजन से dPCR उत्पाद इकट्ठा करने के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हमें उंमीद है कि इस तरीकों की रिपोर्ट में मदद मिलेगी चिप के साथ dPCR को बढ़ावा देने में एक आनुवंशिक अनुसंधान में ट्यूब विधि ।

Introduction

मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) अक्सर एक न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (SNVs) और डीएनए की नकल संख्या रूपांतरों (CNVs) सहित मानव आनुवंशिक भिन्नता, यों तो इस्तेमाल किया जाता है. qPCR में, एक पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया पारंपरिक अंत बिंदु पीसीआर में उसी तरह के रूप में एक ट्यूब में किया जाता है, और एक प्रवर्धन संकेत हर थर्मल चक्र के बाद ट्यूब से हासिल की है । इसके विपरीत, dPCR में, अर्थ अंत बिंदु dPCR इस रिपोर्ट में, पीसीआर मिश्रण कई सूक्ष्म कक्षों में भरी हुई है, कार्यकाल विभाजन, जहां डीएनए टेम्पलेट्स मौजूद हैं या एक सीमित कमजोर पड़ने पर अनुपस्थित, और हर विभाजन पीसीआर मिश्रण युक्त के रूप में मूल्यांकन किया गया है पूरी पीसीआर के बाद निगेटिव या पॉजिटिव । हालांकि यह अनुमान लगाना आसान है कि नकारात्मक विभाजन में कोई डीएनए टेम्पलेट्स नहीं हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि डीएनए टेम्पलेट्स की कितनी प्रतियां सकारात्मक विभाजन में मौजूद हैं. इसलिए, सकारात्मक विभाजन में डीएनए टेम्पलेट्स की संख्या Poisson वितरण के आधार पर अनुमानित है, जो ऋणात्मक विभाजन1से गणना का उपयोग कर रहा है. dPCR अधिक महंगा है और qPCR की तुलना में एक छोटे गतिशील रेंज है, लेकिन इस विधि एक निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है और एक उच्च संवेदनशीलता और अधिक से अधिक सटीक2प्रदान करता है ।

dPCR के मुख्य अनुप्रयोगों में से एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) द्वारा की पहचान की वेरिएंट के सत्यापन है । विशेष रूप से दुर्लभ वेरिएंट के मामले में, कम भिन्नता भिन्न अर्थ, सत्यापन NGS3में हो सकता है कि sequencing त्रुटियों के कारण महत्वपूर्ण है. जबकि सैंज अनुक्रमण और qPCR SNVs और CNVs के सत्यापन के लिए उपयोगी उपकरण हैं, उनकी संवेदनशीलता dPCR की तुलना में कम है । इसलिए, dPCR प्रौद्योगिकी आनुवंशिक अध्ययन के लिए दुर्लभ वेरिएंट से निपटने की मांग में है । हाल ही में, इस तरह के दवा प्रतिरोध के रूप में कैंसर विशेषताओं से संबंधित दुर्लभ वेरिएंट के तरल बायोप्सी द्वारा पता लगाने, आणविक निदान और4चिकित्सा में एक गर्म विषय बन गया है । dPCR प्रौद्योगिकी तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रतीत होता है और निकट भविष्य में महत्वपूर्ण नैदानिक अनुप्रयोगों की उंमीद है, हालांकि गतिशील रेंज और लागत से संबंधित सुधार अभी भी लागू किया जाना चाहिए ।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dPCR प्रौद्योगिकी मोटे तौर पर छोटी बूंद-आधारित और चिप आधारित प्लेटफार्मों में वर्गीकृत किया जा सकता है; अंतर यह है कि कैसे डीएनए टेम्पलेट्स5,6,7विभाजित कर रहे हैं. चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR में, पीसीआर मिश्रण एक चिप पर विभाजन में केशिका कार्रवाई के द्वारा वितरित किया जाता है । चिप्स आठ में निर्मित कर रहे है ट्यूब स्ट्रिप्स, जो कई लैब स्टाफ के साथ पहले से ही परिचित हो जाएगा, और, इस प्रकार, आठ नमूने एक समय8में इलाज किया जा सकता है । पठन चरण में, चिप की पूरी छवि का पता लगाने और प्रत्येक पार्टीशन नहीं होने से ९६ नमूनों का उपचार करने के लिए < 1 h लगता है । चिप के साथ dPCR के बाद से एक ट्यूब प्रारूप में एक उच्च प्रवाह है अंय dPCR प्रणालियों, प्रयोज्य और उत्पादकता के साथ तुलना में अपने उपयोगकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण लाभ हैं ।

इस रिपोर्ट में, एक रोगी में छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस के साथ APC जीन की दैहिक मोज़ेक एक प्रतिनिधि मामले के रूप में प्रयोग किया जाता है और dPCR और NGS के परिणाम की तुलना कर रहे हैं । इस रिपोर्ट का मुख्य उद्देश्य स्पष्ट रूप से एक एकल न्यूक्लियोटाइड चिप के साथ dPCR का उपयोग कर संस्करण मात्रा में एक ट्यूब प्रारूप है । हमें उम्मीद है कि यह रिपोर्ट अपने काम के लिए dPCR प्लेटफॉर्म अपनाने में दिलचस्पी रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए मददगार है ।

Protocol

अध्ययन डिजाइन हमामात्सू विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन (जी-260-4) के संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया था । लिखित सूचित सहमति रोगी और उसके माता-पिता से प्राप्त की गई थी ।

1. जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: जीनोमिक डीएनए (gDNA) की अच्छी तरह से स्थापित सिलिका झिल्ली आधारित डीएनए शुद्धिकरण विधि का उपयोग कर परिधीय रक्त से निकाला गया था । नीचे प्रक्रियाओं के अग्रिम में, gDNA की एकाग्रता एक spectrophotometer का उपयोग कर निर्धारित किया गया था ।

  1. 10 की एकाग्रता पर gDNA नमूना तैयार-100 एनजी/µ एल
  2. एक 8-ट्यूब पट्टी करने के लिए डीएनए नमूना बफर के 10 µ एल जोड़ें ।
  3. डीएनए सीढ़ी के 1 µ एल जोड़ें या ट्यूबों के लिए gDNA । भंवर microplate लगाव का उपयोग कर 1 मिनट के लिए मिश्रण ।
  4. ट्रो साधन (सामग्री की मेज) में ट्यूब, जेल डिवाइस और पिपेट सुझावों लोड और 'प्रारंभ' बटन दबाकर चलाने शुरू करते हैं ।
    नोट: ट्रो प्रणाली स्वचालित रूप से शुरू बटन पर एक क्लिक के साथ काम करेंगे ।
  5. पुष्टि करें कि निचले मार्कर में डीएनए नमूना बफ़र electropherograms पर सही तरीके से असाइन किया गया है । इसे गलत तरीके से असाइन किया गया है, तो मैन्युअल रूप से सॉफ़्टवेयर के 'Electroherogram मोड' में मार्कर असाइन करें ।
    नोट: डीएनए अखंडता संख्या (दीन) स्वचालित रूप से परिकलित किया जाएगा । दीन मान डीएनए अखंडता से आता है । उच्च और कम दीन मूल्यों अत्यधिक बरकरार है और दृढ़ता से नीचा gDNA, क्रमशः संकेत मिलता है ।
  6. स्वचालित रूप से gDNA की एकाग्रता की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर के 'क्षेत्र मोड' में gDNA (> २०० बीपी) के आकार क्षेत्र निर्दिष्ट करें (> २०० बीपी) ।

2. प्राइमर और जांच डिजाइन

  1. पिघलने तापमान की गणना (टीएम) निम्नलिखित स्थितियों के तहत किसी भी खुले पहुँच उपकरण का उपयोग कर मूल्यों: 10 – 25 कुर्सियां, ५० मिमी Na+/K+, ०.८० mm dNTPs, और 3 मिमी मिलीग्राम2 + (सामग्री की तालिका). आगे और रिवर्स प्राइमरों को डिजाइन ६० डिग्री सेल्सियस के आसपास टीएम मूल्य और 100-300 बीपी पर amplicon लंबाई के साथ लक्ष्य alleles युक्त जीनोमिक क्षेत्र बढ़ाना ।
    नोट: oligonucleotides की एकाग्रता के लिए तालिका 1 देखें ।
  2. निंनलिखित शर्तों के आधार पर संदर्भ और संस्करण alleles के लिए लॉक न्यूक्लिक एसिड (LNA) जांच डिजाइन: (i) 1 – 6 LNAs प्रत्येक जांच में मौजूद हैं; (ii) एक फ्लोरोसेंट डाई और एक शमन 5 '-और 3 ' में मौजूद हैं-प्रत्येक जांच की-टर्मिनस, क्रमशः; (iii) मिलान और बेमेल जांच के Tm मानों के बीच का अंतर है > 10 ° c; (iv) टीएम मिलान और बेमेल जांच के मूल्यों उच्च और प्राइमरों की तुलना में कम कर रहे हैं, क्रमशः [उदाहरणके लिए, आगे प्राइमर: ६०.८ ° c, रिवर्स प्राइमर: ५९.८ डिग्री सेल्सियस, संदर्भ एलील जांच (मिलान/बेमेल): 62.6/45.3 ° c, संस्करण एलील जांच (मिलान/बेमेल): 61.7/50.5 डिग्री सेल्सियस] । Tm मान भी चरण २.१ के लिए उपयोग किया गया खुला पहुँच उपकरण का उपयोग करते हुए परिकलित किए गए थे ।
  3. सुनिश्चित करें कि डिजाइन प्राइमरों और जांच के एक आवृत्ति के साथ एक न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं शामिल नहीं > ०.१% के रूप में डेटाबेस से निर्धारित [उदा, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता डाटाबेस (dbSNP)] ।

3. डिजिटल पीसीआर

  1. एक ते बफर के साथ 1 तालिका में वर्णित सांद्रता में प्राइमरों, जांच, और gDNA स्टॉक समाधान तैयार करने और उन्हें-20-4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. 1 तालिका में वर्णित के रूप में एक अंतिम एकाग्रता के लिए 15 µ एल की कुल मात्रा में कमरे के तापमान पर रिएजेंटों मिश्रण ।
    1. एक no-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) में gDNA के बजाय आसुत जल के 3 µ l जोड़ें ।
    2. तपसिल में pipetting त्रुटि के लिए खाते के लिए 3.5 x पीसीआर मिश्रण की मात्रा तैयार करें ।
  3. यह मिश्रण करने के लिए पीसीआर मिश्रण ऊपर और नीचे पिपेट ।
  4. 8-ट्यूब स्ट्रिप में निर्मित चिप्स पर लोडिंग प्लेटफार्म सेट करें और उन्हें अपलोडर पर सेट करें । सुनिश्चित करें कि वहां चिप और लोडिंग मंच के बीच एक संपर्क है ।
  5. प्लेटफार्म पर एक लोडिंग स्लाइडर फिट और लोडर के डाट बंद के साथ स्लाइडर पकड़ ।
  6. पिपेट स्लाइडर की नोक के पास प्लेटफार्म पर पीसीआर मिक्सचर के 15 µ एल (चित्रा 1) ।
  7. लोडर का बटन दबाकर लोडर चलाएं (लगभग 1 मिनट के लिए) ।
    नोट: यह कोई समस्या नहीं है अगर पीसीआर मिश्रण की एक छोटी राशि के मंच पर रहता है । यह क्रमिक रूप से लोडर फिर से चलाएँ करने के लिए संभव है ।
  8. सीलिंग बढ़ाने के साइड स्लॉट में पीसीआर मिक्सचर से भरी चिप-इन-ए-ट्यूब को सेट करें । स्लाइड ढक्कन पुश और शीर्ष ढक्कन के किनारे चिप को तोड़ने के लिए नहीं (चित्रा 1बी).
  9. चलाने के सीलिंग बढ़ाने (लगभग 2 मिनट) । क्रमिक रूप से 1 मिनट के लिए सील बढ़ाने फिर से चलाएं यदि तरल का एक पोखर अभी भी दिखाई दे रहा है क्योंकि एक अपूर्ण सीलिंग सकारात्मक संकेतों के पार संदूषण का कारण बनता है (आंकड़े 1C और 1 d) ।
  10. सील द्रव, एक तेल आधारित एजेंट के २३० µ एल जोड़ें, ट्यूबों के लिए ।
    नोट: चिप्स को अब तरल पदार्थ में डुबोकर रखना चाहिए ।
  11. थर्मल साइकिल चालक में ट्यूबों सेट । (लगभग 2 घंटे के लिए) तालिका 2 में वर्णित के रूप में थर्मल साइकिल चालक भागो । तापमान या पीसीआर की अवधि ट्यून अगर वहां सकारात्मक विभाजन (चित्रा 1) का एक असमान वितरण है ।
    नोट: यह लगभग 1 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप दर सेट करने के लिए सिफारिश की है/
  12. न्यूनतम 15 मिनट के लिए आधारभूत शोर को कम करने के लिए थर्मल साइकिल चालक में ट्यूबों छोड़ दें ।
    नोट: ट्यूबों के रूप में अच्छी तरह से रातोंरात छोड़ दिया जा सकता है । अगले दिन भी प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया गया ।
  13. जांच जिग पर ट्यूबों सेट और जिग में आसुत जल के 6 मिलीलीटर डालना । यदि हवा के बुलबुले के अंदर और बाहर ट्यूबों दिखाई दे रहे हैं, उंहें स्पष्ट (आंकड़े 1F और 1G) ।
  14. डिटेक्टर में जिग लोड और Fluorescene, प्रयोग और नमूना/एनटीसी टैब्स (सामग्री की तालिका) के चयन के बाद सॉफ्टवेयर के 'भागो' बटन पर एक क्लिक के साथ इसे चलाने के ।
    नोट: एक डिफ़ॉल्ट तीव्रता के साथ आठ नमूनों की दोहरी रंग का पता लगाने लगभग 4-5 मिनट लगते हैं ।
  15. स्थिति भूखंड, हिस्टोग्राम और 2d तितर बितर भूखंड की पुष्टि करें ।
    नोट: iIf नकारात्मक विभाजन के प्रतिदीप्ति तीव्रता उच्च है, सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स बटन पर एक क्लिक के साथ तीव्रता समायोजित इतना है कि यह 30 की सीमा के भीतर गिर जाता है-70 ।
  16. निम्न सूत्र का उपयोग करते हुए भिन्न एलील भिन्न (VAF) परिकलित करें:
    Equation 1
    यहां, Cv और सीआर संस्करण और संदर्भ एलील, क्रमशः की प्रतिलिपि संख्या रहे हैं ।
    नोट: वे स्वचालित रूप से Poisson आंकड़ों पर आधारित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में गणना कर रहे हैं ।

4. पीसीआर प्रोडक्ट का कलेक्शन

  1. ट्यूब से सील द्रव निकालें ।
  2. ते ट्यूबने बफर के १०० µ l जोडे । भंवर सख्ती के लिए 30 एस और संक्षेप में ट्यूब केंद्रापसारक ।
  3. एक और ट्यूब के लिए ते समाधान स्थानांतरण और इथेनॉल के 3 एम सोडियम एसीटेट और २०० µ एल के 30 µ एल जोड़ें ।
  4. -20 डिग्री सेल्सियस रात भर में समाधान ठंडा ।
  5. १६,००० x जी पर 30 मिनट के लिए समाधान केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  6. ट्यूब और भंवर को ८०% इथेनॉल के ३०० µ एल जोड़ें ।
  7. १६,००० x जी पर 15 मिनट के लिए समाधान केंद्रापसारक और supernatant हटा दें । 5 मिनट के लिए हवा-शुष्क करने के लिए हाला की अनुमति दें ।
  8. 1 में हाला को भंग-5 µ l ते बफर हवा के बाद सुखाने ।
  9. यदि आवश्यक हो, तो चरण 1 के संदर्भ के साथ एक ट्रो उपकरण का उपयोग कर उत्पाद आकार का आकलन करें । एक उच्च संवेदनशीलता (सामग्री की तालिका) के लिए जेल डिवाइस के समाधान के 1 µ l लोड.

Representative Results

हम छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस के साथ एक रोगी में APC जीन के दैहिक मोज़ेक ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार की समीक्षा की । एक पिछले अध्ययन में, APC c. 834 + 2T > सी उत्परिवर्तन रोगी में पाया गया था, लेकिन उनके माता पिता में नहीं, सैंज अनुक्रमण और NGS9का उपयोग कर । के प्रतिनिधि परिणामों में प्रयुक्त प्राइमरों और जांच के डिजाइन तालिका 3में दिखाया गया है । जीनोमिक डीएनए बैंड, माता पिता, और छह स्वस्थ दाताओं के खून से निकाला गया था । नौ gDNA नमूनों की दीन मूल्यों को लेकर 6.7-7.9 (चित्रा 2 और तालिका 4) । FAM और हेक्स क्रमशः सी और टी alleles के लिए प्रतिदीप्ति रंजक के रूप में इस्तेमाल किया गया था । स्थिति भूखंडों पर हरे और पीले धब्बे FAM-सकारात्मक और हेक्स-सकारात्मक विभाजन, क्रमशः (चित्रा 3) प्रतिनिधित्व करते हैं । नीले धब्बे दोनों FAM और हेक्स के लिए नकारात्मक विभाजन का प्रतिनिधित्व करते हैं । काली पृष्ठभूमि विभाजन से मेल खाती है जहां प्रतिक्रिया मिश्रण नहीं जोड़ा गया था । सी और टी alleles के कई सकारात्मक विभाजन के बैंड में पता लगाया गया है, जबकि सी एलील के कुछ सकारात्मक विभाजन है बैंड के पिता या एनटीसी में पता चला और, उत्तरार्द्ध में, टी एलील के सकारात्मक विभाजन का पता नहीं किया गया । सी और टी alleles के बीच संकेत जुदाई दो आयामी (2-डी) scatterplot पर स्पष्ट था, और हेक्स और FAM का सबसे सकारात्मक संकेत एक दूसरे के अनंय थे (3 चित्राबी) । बैंड के VAF १३.२% है, जो कि NGS का उपयोग निर्धारित करने के लिए समान है (१२.७%) (तालिका 4) । VAFs के माता-पिता और स्वस्थ दाताओं का < ०.१% था । का पता लगाने की सीमा APC c. 834 + 2T > सी उत्परिवर्तन के लिए ०.३% के साथ दोहराया माप के लिए 3x मानक विचलन का उपयोग करने का अनुमान था 10-11 कुल gDNA10के एनजी ।

APC c. 834 + 2T > सी के लिए dPCR परख में amplicon आकार १२३ बीपी होने की भविष्यवाणी की थी । dPCR उत्पाद एक एकल बैंड के रूप में परिलक्षित किया गया था कि पुष्टि करने के लिए, dPCR उत्पाद परख चिप से एकत्र किया गया था । ट्रो का उपयोग करना, एक एकल बैंड स्पष्ट रूप से पता चला था, और उत्पाद का आकार भविष्यवाणी (4 चित्रा) के अनुरूप था ।

Figure 1
चित्रा 1 : चिप के साथ dPCR परख के लिए नोट करने के लिए अंक में एक ट्यूब प्रारूप । () इस पैनल से पता चलता है कि कैसे 8-ट्यूब पट्टी को अपलोडर में स्थापित करने के लिए । () इस पैनल टूट चिप्स दिखाता है । () इस पैनल से पता चलता है कि चिप बस के बाद (i) लोड हो रहा है और (ii) सीलिंग सतहों । (iii) एक पोखर की अपूर्ण सीलिंग के मामले में तरल पदार्थ दिखाई देता है । () इस पैनल को क्रॉस-प्रदूषित होने की स्थिति में पोजीशन प्लाट दिखाता है. () यह पैनल किसी असमान वितरण के मामले में स्थिति भूखंड दिखाता है. () इस पैनल से पता चलता है कि कैसे पानी में डूबे ट्यूब की सतह पर हवा के बुलबुले । () इस पैनल ट्यूब के अंदर हवा के बुलबुले से पता चलता है । पूरे आंकड़ा के दौरान, काले और सफेद ऐरोहेड टूट चिप टुकड़े और हवा के बुलबुले, क्रमशः संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : रक्त gDNA के प्रतिनिधि electropherograms. ६.७ और ७.९ के दीन मूल्यों के साथ रक्त gDNA के Electropherograms क्रमशः ऊपरी और निचले फलक में दिखाए जाते हैं । तारांकन चिह्न कम मार्कर इंगित करता है । दीन: डीएनए अखंडता संख्या । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक-ट्यूब प्रारूप में चिप के साथ dPCR का उपयोग कर APC दैहिक मोज़ेक के प्रतिनिधि परिणाम. () स्थान भूखंडों और () scatterplots नियंत्रण (एनटीसी), बैंड, और पिता के यहां दिखाया जाता है । हेक्स और FAM संदर्भ और संस्करण alleles, क्रमशः के अनुरूप हैं । अनुलंब और क्षैतिज रेखाएं क्रमश: हेक्स और FAM तीव्रता की सीमाएं बताती हैं । यह आंकड़ा Kahyo एट अल से संशोधित किया गया है । 10. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : परख चिप से dPCR उत्पादों का संग्रह । एकत्र और केंद्रित dPCR उत्पादों ट्रो के अधीन थे । अनुमानित लक्ष्य आकार १२३ बीपी था । यह आंकड़ा Kahyo एट अल से संशोधित किया गया है । 10. एनटीसी: नहीं, टेंपलेट नियंत्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक एकाग्रता
स्टॉक समाधान के
मात्रा (μL) अंतिम एकाग्रता अनुशंसित
अंतिम एकाग्रता
DNase/RNase-नि: शुल्क आसुत जल - १.७५ - -
2x पीसीआर मास्टर मिक्स - ७.५ - -
प्रमुख एलील के लिए LNA जांच 2 माइक्रोन ०.५ ६६.७ एनएम 3.33 – 100 एनएम
नाबालिग एलील के लिए LNA जांच 2 माइक्रोन ०.५ ६६.७ एनएम 3.33 – 100 एनएम
फॉरवर्ड प्राइमर 1 माइक्रोन ०.५ ३३.३ एनएम 3.33 – 50.0 एनएम
रिवर्स प्राइमर 1 माइक्रोन ०.५ ३३.३ एनएम 3.33 – 50.0 एनएम
20x dPCR समाधान - ०.७५ - -
gDNA ३.३३ एनजी/μL 3 ६६६ स्नातकोत्तर μL/ 20 pg/μL-2000 pg/μL1

तालिका 1: dPCR परख के लिए इस्तेमाल किया एजेंट । 1 उंमीद की सटीक और संवेदनशीलता पर निर्भर करता है ।

चरण तापमान समय चक्र
प्रारंभिक स्वभाव ९५ ° c 5 मीटर 1
स्वभाव
एनीलिंग और विस्तार
९५ ° c
५८ ° c
५० s
९० s
४२
अंतिम विस्तार ७० ° c 5 मीटर 1

तालिका 2: थर्मल साइकिल चालक की स्थिति ।

नाम अनुक्रम1 टीएम मान2
फॉरवर्ड प्राइमर 5 '-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ′ ६०.८ ° c
रिवर्स प्राइमर 5 '-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ′ ५९.८ ° c
टी एलील के लिए LNA जांच 5 '-हेक्स-ATTT [अ] CCTGACCA-IBFQ-3 ' मिलान: ६२.६ ° c
बेमेल: ४५.३ ° c
C एलील के लिए LNA जांच 5 '-FAM-TTT [छ] CCTGACC-IBFQ-3 ' मिलान: ६१.७ ° c
बेमेल: ५०.५ ° c

तालिका 3: प्राइमरों और जांच के डिजाइन । 1 रेखांकित और कोष्ठक पत्र क्रमशः LNA और लक्षित संस्करण हैं । 2 प्रोटोकॉल के चरण 2 के अनुसार परिकलित की जाती है ।

NGS dPCR4
नमुना ऊतक इनपुट डीएनए (एनजी) दीन2 VAF (%) वैरिएंट (प्रतियां) संदर्भ (प्रतियां) VAF (%)
मतलब Rsd
एनटीसी - - - - १.२३ 0 N/A N/A
बैंड रक्त ११.३ ७.६ १२.७ ३७९ २.४८ एक्स 103 १३.२ ०.०३५३
पिता रक्त १०.३ ७.७ ०.०१६७ १.०८ ३.४२ एक्स 103 ०.०३४१ ०.४३९
माँ रक्त १०.८ ७.६ ०.०१३६ ०.९५६ ३.०४ एक्स 103 ०.०३१३ ०.६३७
दातार-1 रक्त ११.७ ७.३ - १.६४ 3.01 x 103 ०.०५४३ ०.४१४
दातार-२ रक्त १०.५ ७.६ - १.०६ २.९० एक्स 103 ०.०४०६ ०.५३९
दातार-३ रक्त १७.६ ७.९ - ४.२४ ५.६५ एक्स 103 ०.०७१३ ०.७८३
दातार-4 रक्त १२.३ ७.६ - २.३८ ४.१६ एक्स 103 ०.०६६६ ०.५५७
दातार-५ रक्त १९.२ 7 - १.४८ ६.७९ एक्स 103 ०.०२१३ ०.५७१
दातार-६ रक्त १४.४ ६.७ - ३.४४ ४.६७ एक्स 103 ०.०७२८ ०.७२९

तालिका 4: के लिए dPCR परख के परिणाम APC दैहिक मोज़ेक । 1 एनटीसी: नहीं-टेम्पलेट नियंत्रण; दाता: स्वस्थ दाता । 2 दीन: डीएनए अखंडता संख्या । 3 Iwaizumi एट अल. 9, हम जीनोम Var. २ १५०५७ (२०१५) । 4 प्रयोगों तपसिल और स्वतंत्र रूप से दोहराया 3x में चला रहे थे; डेटा मतलब मूल्य के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; RSD: सापेक्ष मानक विचलन; N/A: लागू नहीं है । तालिका Kahyo एट अल से संशोधित किया गया है । 10.

Discussion

दीन मूल्य अक्सर ठहराव या अनुक्रमण से पहले क्षतिग्रस्त डीएनए (जैसे, formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड ऊतक से gDNA) का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि gDNA के एक उंनत गिरावट कम गुणवत्ता वाले डेटा में परिणाम कर सकते हैं । दीन आकलन है, इस प्रकार, मानव gDNA11की गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण कदम बनता जा रहा है । के बाद से प्रतिनिधि प्रयोग में इस्तेमाल किया gDNA 4 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था-11 साल के रक्त से इसकी निकासी के बाद, अपने दीन मूल्यों dPCR परख से पहले एक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए निर्धारित किया गया । यह कदम विशेष रूप से यदि सामग्री क्षतिग्रस्त होना संदिग्ध है की सिफारिश की है । gDNA की एकाग्रता भी ट्रो द्वारा निर्धारित की गई थी. क्योंकि dPCR के गतिशील रेंज के रूप में विभाजन की सीमाओं के कारण qPCR के लिए के रूप में व्यापक नहीं है, gDNA एकाग्रता का एक माप एक सफल dPCR परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में इनपुट डीएनए की राशि dPCR परख में संस्करण और संदर्भ alleles की कुल प्रति संख्या के साथ संबंधित था (आर चुकता = ०.९३५; तालिका 4), ट्रो dPCR परख से पहले gDNA एकाग्रता को मापने के लिए उपयोगी है ।

लोडिंग और सीलिंग प्रक्रियाएं सफल परिणामों के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं । यह मंच पर पीसीआर मिश्रण के उपयुक्त बढ़ते की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है और चिप और मंच के बीच संपर्क सुनिश्चित (चित्रा 1A) । स्लाइडर से पीसीआर मिक्सचर की दखलंदाजी चिप पर अवैध डिस्ट्रीब्यूशन का कारण बन सकती है एक स्थिति भूखंड पर सकारात्मक और नकारात्मक विभाजन के वितरण की पुष्टि भी एक सटीक विश्लेषण के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह Poisson आंकड़ों में माना जाता है कि डीएनए टेंपलेट्स बेतरतीब ढंग से1मंडलों में विभाजित हैं । प्रतिनिधि परिणामों में, सकारात्मक विभाजन चिप भर में वितरित किए गए थे (चित्रा 3). यह परिणाम Poisson आँकड़ों के लिए आवश्यकता को पूरा करता है और यह दर्शाता है कि लोडिंग और सीलिंग प्रक्रियाएँ प्रभावी थीं. जब सीलिंग बढ़ाने में ट्यूबों की स्थापना, चिप्स टूट सकता है अगर ऊपर ढक्कन के मध्य भाग भी जोरदार धक्का दिया है (चित्रा 1) । इस से बचने के लिए, धीरे ऊपर ढक्कन के किनारे धक्का । यदि सकारात्मक विभाजन (चित्रा 1D) की एक कृत्रिम क्लस्टर है, विभाजन के बीच एक पार संदूषण के कारण कॉपी संख्या आंका जा सकता है । सील प्रक्रिया में सुधार किया जाना चाहिए अगर तरल की एक पोखर सतह पर दिखाई दे रहा है (चित्रा 1सी) (उदाहरणके लिए, क्रमिक रूप से 1 मिनट के लिए सीलिंग बढ़ाने के द्वारा) । यदि सकारात्मक विभाजन (चित्रा 1) का असमान वितरण है, प्रतिलिपि संख्या अपर्याप्त प्रवर्धन या सील द्रव और पानी के संदूषण के कारण आंका जा सकता है । पीसीआर शर्तों इस मामले में समायोजित किया जाना चाहिए [उदाहरणके लिए, तापमान या पीसीआर की अवधि ट्यूनिंग द्वारा (प्रोटोकॉल के चरण ३.११), या सुनिश्चित करना है कि सील द्रव और जिग में डाला पानी साफ कर रहे हैं] । आसुत जल में डूबे 8-ट्यूब स्ट्रिप से प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया जाता है । यदि हवा के बुलबुले ट्यूब की सतह का पालन करें, वहां संभावना है कि वे संकेत का पता लगाने (चित्रा 1F) के साथ हस्तक्षेप कर सकते है । इसलिए, बुलबुले एक उपकरण, जैसे कि एक ठीक पिपेट टिप का उपयोग कर साफ़ किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले ट्यूबों के अंदर फार्म कर सकते है जब वे जिग (चित्रा 1जी) में स्थापित कर रहे हैं । अगर ट्यूबों के अंदर बुलबुले काफी बड़े है चिप को कवर करने के लिए, वे भी साफ किया जाना चाहिए । बुलबुले स्पष्ट हो सकता है अगर वे कमरे के तापमान पर कई मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है ।

कुछ सकारात्मक विभाजन एनटीसी में पता लगाया जा सकता है । डीएनए टेम्पलेट्स के एक संदूषण से बचने के लिए, बेंच साफ रखने के लिए और, यदि संभव हो, एक प्रशंसक फिल्टर इकाई के साथ एक साफ जगह बनाते हैं । यदि डीएनए टेम्पलेट्स के एक संदूषण संदिग्ध है, अच्छी तरह से अंतरिक्ष को साफ और/या इस्तेमाल किया एजेंट को छोड़ दें । इसके विपरीत, यदि संदर्भ एलील के सकारात्मक विभाजन gDNA की उपस्थिति में पता नहीं कर रहे हैं, gDNA, प्राइमरों की सांद्रता की पुष्टि, और जांच । विशेष रूप से, प्राइमरों प्रतिनिधि प्रयोग में कम एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया, पारंपरिक पीसीआर की तुलना में (1 टेबल)12। यह भी रैंप दर है, जो शायद ही कभी पारंपरिक पीसीआर में बदल जाता है की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

क्या चिप के साथ dPCR बनाता है में एक ट्यूब प्रारूप अद्वितीय सार्वभौमिक 8 के अंदर पीसीआर मिश्रण के विभाजन है ट्यूब8,13पट्टी । एक पीसीआर ट्यूब में विभाजन कक्षों का स्थानांतरण इस प्रणाली में की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार संदूषण जोखिम को कम करने । चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR प्रणाली में एक फायदा यह भी है; यह उस dPCR प्रणाली में ९६ परख खत्म करने के लिए < 4 h लेता है, जबकि छोटी बूंद में परख के एक ही नंबर को समाप्त करने के लिए कम से 5 h-आधारित dPCR14लेता है । इसके अलावा, यूनिवर्सल 8 ट्यूब पट्टी एक पारंपरिक थर्मल साइकिल चालक के उपयोग में सक्षम बनाता है, एक और चिप के विपरीत15dPCR आधारित है, जो एक फ्लैट ब्लॉक के साथ एक थर्मल साइकिल चालक की आवश्यकता है । इसके अलावा पारंपरिक पीसीआर के लिए संचित ज्ञान और रिएजेंट dPCR सिस्टम को लागू किया जा सकता है । यह dPCR के आवेदनों के विस्तार के लिए मददगार होगा ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि dPCR कई सीमाएं हैं । चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR में, चिप के विभाजन की संख्या अन्य dPCR प्लेटफार्मों में उन लोगों के साथ तुलना में अपेक्षाकृत कम है. इसके अलावा चिप डिवाइस के लिए सुधार गतिशील रेंज है, जो विभाजन की संख्या पर निर्भर करता है को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा । क्योंकि यूनिवर्सल ट्यूब के आंतरिक अंतरिक्ष सीमित है, चिप डिवाइस के लिए एक सफलता डिजाइन विभाजन की संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है । भविष्य में पूरे dPCR प्रक्रिया के स्वचालन बहुत मानव त्रुटि को कम करेगा, और भी अधिक विश्वसनीय परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप । अपने उच्च प्रवाह और उच्च संवेदनशीलता प्रकृति के कारण, चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR तरल बायोप्सी और पर्यावरण डीएनए के लिए नमूनों की एक संख्या का इलाज करने के लिए लागू होने की उम्मीद है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ग) जापान सोसायटी से विज्ञान के संवर्धन के लिए (JSPS) (सं. 15K08397) Tomoaki Kahyo के लिए, और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से अनुदान द्वारा (एमएड) (no. ९२७९६०७१९), खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता (सं. 16K15256), प्रबंधन व्यय अनुदान में एक राष्ट्रीय विश्वविद्यालय सुधार के संवर्धन के लिए एक प्रोत्साहन विशेष बजट की संबद्ध परियोजनाओं के लिए व्यय (no. १०१९२५३), और धूंरपान अनुसंधान फाउंडेशन को Haruhiko Sugimura. लेखक डॉ Iwaizumi और डॉ Kurachi उनके नैदानिक सहायता के लिए धंयवाद । इस पांडुलिपि को तैयार करने में फंड वालों की कोई भूमिका नहीं थी । चित्रा 3, चित्रा 4, और तालिका 4 अनुकूलित कर रहे हैं और Kahyo एट अल द्वारा एक लेख से पुनर्मुद्रित. 10, Elsevier से अनुमति के साथ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

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References

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डिजिटल पोलीमरेज़ एक छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस रोगी में आनुवंशिक भिंनता के लिए श्रृंखला प्रतिक्रिया परख चिप का उपयोग कर-a-ट्यूब प्रारूप
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Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

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