Summary
אנו מציגים את השימוש פוטון 2 מיקרוסקופ כדי למקם את micropipette במרחב השתן של באומן בעכברים, שילוב טכניקות היסוד 2 של פיזיולוגיה של הכליה. השימוש מיקרוסקופ פוטון 2 גוברת על מגבלות קריטי של מיקרוסקופ רגיל ללימודי micropuncture פיזיולוגיה של הכליה.
Abstract
Micropuncture כליות והדמיה פוטון 2 כליות הם טכניקות הזרע פיזיולוגיה של הכליה. עם זאת, micropuncture הוא מוגבל על ידי התלות מיקרוסקופ רגיל תכונות פני השטח נפרון, פוטון 2 מחקרים מוגבלים כי התערבויות רק יכול להיות מוערך על האיבר, יותר מאשר רמת נפרון. בפרט, micropuncture מחקרים של glomeruli של עכברים לאיוב במחסור של פני השטח glomeruli בעכברים. כדי לטפל מגבלה זו לצורך לימודי של וביופסיה מהחלל של באומן במודלים הפיזיולוגיות של העכבר, פיתחנו micropuncture glomerular 2-פוטון. אנו מציגים הכנה כירורגית חדשנית המאפשרת גישה לרוחב הכליה תוך שמירה על העמודה נדרש הדמיה אנכי עבור 2-פוטון מיקרוסקופ. ניהול של משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי משמש לעיבוד להערכת הכליות ולכן glomeruli גלויים עבור הדמיה 2-פוטון. פיפטה מצופים נקודה קוונטית ואז הוא הציג תחת הדרכה סטיאוטטי פקעית שנבחר מתוך כמה רבים אשר עשויים ניתן לאבחן בתוך חלון הדמיה. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים פרטים של הכנה, חומרים, שיטות הדרושים לבצע את ההליך. טכניקה זו מקלה על המחקר הפיזיולוגיות-בלתי אפשרי בעבר הכליה, כולל שחזור של פילטרט של החלל של באומן, כל חלקי נפרון בתוך מגבלת עומק הדמיה, כ-100 מיקרומטר מתחת הקפסולה כליות. לחץ, תשלום וזרימה עשוי כל ניתן למדוד באמצעות פיפטה הציג. כאן, אנו מספקים נתונים מייצגים כרומטוגרפיה נוזלית/מסה ספקטרומטר מתבצע על וביופסיה מהחלל של באומן. אנו מצפים טכניקה זו יש הישימות רחב בחקירת הפיזיולוגיות כליות.
Introduction
מטרת נוהל זה נועד לספק גישה שגרתי micropuncture שטח של באומן ומבנים אחרים glomerular בעכברים. Micropuncture לימודי פיזיולוגיה של הכליה היה מוגבל ל- 1-פוטון מיקרוסקופ, אשר יכול רק תמונה בתוך מיקרונים אחדים של המשטח כליות, אשר מציע דיוק מוגבל ב z-המימד. כי עכברים יש כמה glomeruli פני השטח, זה לא תמיד ניתן למצוא של פקעית פני השטח על ידי מיקרוסקופ פוטון 1, ולכן רוב המחקרים micropuncture בוצעו בחולדות מינכן-Wistar, אשר יש glomeruli משטח רבים יותר. לכן, הייתה מוגבלת את היתרונות של עבודה במודלים של העכבר micropuncture מחקרים1,2,3. התפתחויות אחרונות הדמיה טכנולוגיות, כולל מיקרו-CT4,5, ננו-חלקיק הדמיה6, והדמיה ספקטרומטר מסה7 יש שיפור משמעותי את מגוון שיטות החלים glomerular פיזיולוגיה, אבל נותר אין תחליף ייחודי מספק יכולת להתערב, לטעום את micropuncture. לכן הרחבת השימוש micropuncture תוך שימוש בטכניקות המובאת כאן צפוי להקל על מחקרים חדשניים פיזיולוגיה של הכליה, בפרט, הערכה של התוכן של פילטרט של הכליה (קרי, גליקומיקס) ופיזיולוגיה הבסיסיים של העכברים הטרנסגניים, כגון מדידות של פילטרט של הלחץ, תשלום, ביצע בעבר רק אצל חולדות.
בטכניקה זו, השימוש מיקרוסקופ פוטון 2 מאפשר הדמיה וגישה micropipette למבנים כליות עד כ-100 מיקרומטר מתחת הקפסולה כליות. מרובים glomeruli (5 – 10) נגישים ולכן כדי micropuncture כל כליה העכבר עד כה עם תמונה. למרות טכניקה זו חולק תכונות מסוימות עם micropuncture כליות קונבנציונאלי, זה היה מעוצב דה נובו , נדרשים שינויים נרחבים של הטכניקה המקובלת. פרוטוקול זה אנחנו מדגימים את השאיפה של נוזל מהחלל של באומן, להראות דוגמה תוצאות של ניתוח מאוחר יותר עם ספקטרומטר מסה (nanoproteomics)8,9,10,11. שימוש במורד הזרם ספקטרומטר מסה מחייב מדגם מיוחדים הכנה זרימת עבודה, אשר גם הדגימו כאן.
Protocol
כל ההליכים המתוארים במסמך זה אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של אורגון לבריאות & ומדע באוניברסיטת.
1. הגדרת משמש להדגמה
- השתמש במיקרוסקופ פוטון 2 זקוף, של שלב 3-ציר בקר, בעל headstage/פיפטה ו 3-ציר בקר על בעל headstage/פיפטה; כל ארבעת פריטים אלה נדרשים.
הערה: כיוונונים דומים רבים זמינים, יספיק כל עוד שליטה עצמאית 3-ציר כמותית של השלב פיפטה ו במיקרוסקופ הינם זמינים, המיקרוסקופ מוגדר עבור ויוו הדמיה זקוף.
2. חומרים הדרושים לפני הפעלת פרוטוקולים ניסיוני
- השתמש FITC-לתוספי, דא 2,000,000, 5% פתרון תמיסת מלח או באגירה פוספט תמיסת מלח להזרקה retroorbital לסמן את להערכת כליות. זה משקל מולקולרי (MW) נבחרה משום שהוא נשאר להערכת אינו מסנן.
- משך-מכונת זכוכית בורוסיליקט micropipettes: למשוך micropipettes 6-10 מיקרומטר קצה באמצעות ההגדרות לונג-טפר, סגור עצה (למשל, חום = 610, מהירות = 150, זמן = ms 250, כרך) על פולר micropipette. מסגרת משופעת כדי 45°, להבה-פולין בקלילות.
- נקודה קוונטית ציפוי של micropipettes: מעיל micropipette טיפים עם נקודות קוונטיות לפי הפרוטוקול שאליהם יש הפניה. 12
- מרווח/תמיכה בכליות ששינינו. השתמש ששינינו פוטי לעצב מרווח/תמיכה של הכליה. אופנה ס"מ 1 x 12 על ידי 5 מ מ עבה ישרי-זווית הצלעות (קרי, קובייה קטומה) מ ששינינו פוטי. הסר את האמצעי 70% ששינינו את מקצה אחד של מעגל הכוללת כ- 70% של מרכז הצלעות. לאפשר את ששינינו להתייבש במשך 24 שעות ביממה. ראה איור 1.
- Microinjector הכנה: Prefill באורך של פוליאתילן (PE)-50 אבובים, בעל טעינה micropipette micropipette עם שמן. אם ספקטרומטר מסה מתוכנן, perfluorodecalin נדרש, אחרת ניתן להשתמש שמן מינרלי. להגדיר את microinjector עם המילטון-סוג מזרק גז חזק ואת מילוי עם perfluorodecalin. זה יחובר לצנרת PE-50 ומחזיק פיפטה.
- למקם את פיפטה המחזיק פיפטה ו קדימה תמלא את צינורות PE-50 פיפטה ולאחר מכן הצמד בסוף הפרוקסימלית PE-50 אבובים על המזרק המילטון מלא שמן, יצירת מערכת הידראולית של פיפטה להזריק.
3. פיפטה לרוחב גישה אל הכליה מתחת נוזל הדמיה עמודה באמצעות הליך כירורגי הרומן
הערה: מכלול של מערכת תמיכה הדמיה, הכנה כירורגי מוצג באיור1. ההליך המתואר מתבצע על עכברים C57BL/6 במשקל של 20 – 25 גר'.
- שוקלים את העכבר.
- לגרום הרדמה באמצעות 4% איזופלוריין ולתחזק עם 1.5-2.5% איזופלוריין בתערובת אוויר/חמצן. לאשר כי העכבר הוא ומורדמת באמצעות היעדר בתגובה לגירוי מכאיב וקצב נשימה מופחתת.
- לשמן את העיניים ולמיקומו לרוחב בעלי חיים על baseplate. לשתק את 4 הגפיים באמצעות הקלטת.
- להזריק תמיסת מלח, 200 µL, subcutaneously, במקום בדיקה טמפרטורה רקטלית. בקרת טמפרטורה בעזרת מנורת חימום במהלך הניתוח, כרית החימום במהלך דימות.
- להסיר את כל השיער על הצד השמאלי של העכבר באמצעות קרם depilatory.
- לאתר הטחול, הגלויה לעין מתחת לעור, ואתר את הכליות בצד הגבי ו סימטרית של הטחול.
- להפוך את חתך 0.5 ס מ על העור החתך קטנים יותר הצפק, מספיק רק בשביל הכליה להעביר בקלות.
- הבלטת הכליה עם לחץ עדין. מקם טופס מייצב כליות עם ששינינו סביב הכליה תיקון עם דבק מגע, דבק. בשורה הכליה עם מרווח כך השטח צדדי ביותר של הכליה חורג המיצב על ידי כ- 1 מ מ.
- אכין צלחת ראש אל הטופס מייצב עם דבק והר בלוח הראשי הרכבה ברים על הבסיס.
- למלא את הבאר בתומך ששינינו המקיפים את הכליה עם 1% פתרון agarose, למקם את coverslip 10 מ מ על גבי ממושכת עד agarose הוא המשרד. חותם coverslip לצלחת ראש עם דבק וליצור טבעת מסביב coverslip עם מלט שיניים.
- מזריקים FITC-לתוספי (2,000,000 Da, 5% פתרון, µL 100 – 150) רטרו-orbitally ולהעביר את הצלחת קיבוע של עכבר לבמה מיקרוסקופים פוטונים 2 במהירות, שמירה על הרדמה ולהבטיח נאותה לבזבז דלק ניקוי על הבמה מיקרוסקופ.
4. הבחירה של פקעית מתאימים או פיפטה גישה למרחב של באומן
-
הגדרות:
- הגדרת X וגם משמאל לימין על המסך מול המיקרוסקופ משמאל לימין
- לקרוא SX (שלב X) מן הבקר הבמה
- מגדירים PX פיפטה X, על פיפטה חיוג בקר
- מגדירים Y מעלה-מטה על המסך, קדימה כלפי המיקרוסקופ וכלפי בחזרה את הכיוונון פוטון 2
- להגדיר Z כמו למעלה לכיוון התקרה, למטה לכיוון הרצפה, ונמדד על הבמה עם העמדה המטרה Z.
- להגדיר S (O) Z כמו גובה הבמה (באמת המטרה).
-
למצוא את פני השטח של הכליה, לזיהוי באמצעות הגדרות המסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) העינים. עקב ההזרקה של FITC-לתוספי, להערכת יהיה ירוק בהיר.
- זיהוי של פקעית מתאימים. לאחר שזיהו את פני השטח של הכליה באמצעות את העינים, לעבור 2-פוטון (מצב שאינו לסריקת) ולחקור את החלון הדמיה. תכונות חיוביות של micropuncture הן הבאות: המרחק האנכי מתחת coverslip > 30 מיקרומטר (כדי למנוע התנגשות בין פיפטה coverslip במהלך גישה), לרוחב שהמרחק הקפסולה כליות לרוחב פקעית < 400 מיקרומטר (מעבר במרחק הזה סטיית פיפטה עשוי להגדיל את הסבירות של פספוס).
- לרוחב הרשומה והמרחק האנכי כדי לנקב הצבע, נקודת על הקפסולה כליות ישירות לצד פיפטה פקעית.
- להעלות מוקד אובייקטיבית לתוך עמודת המים, שמירה על ה-x ואת y הבמה קואורדינטות ללא שינוי, מרחק של בערך סנטימטר.
- כונן את הטיפ פיפטה לתוך עמודת המים והפעל 4', עירור (דאפי) 6-diamidino-2-phenylindol. הזז פיפטה ב- x ו- y מידות עד לנקודה של זריחה מקסימלי של הקצה, זה יהיה מרכז המטרה. למצוא את פיפטה העינים קשה ללא prepositioning הזה מדויק. כי נקודות קוונטיות לזרוח על הגל אותו (במקרה זה, אדום) ללא קשר עירור הגל, עירור דאפי מייצרת פלואורסצנטי אדום אשר מתמקדת בחוזקה הטיפ, מאויר באיור2.
- שנה את הגדרת עירור חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), להמחיש את פיפטה ב העינים, לאחר מכן בדיוק מרכז זה בתצוגה עינית.
- לעבור ל 2-פוטון ולמצוא את פיפטה תחת 2-פוטון, הצבתו בדיוק במרכז התמונה. זהו המיקום רישום.
- לשמור תמונה של פיפטה.
- לרשום את הבמה ואת הקואורדינטות בקר micropipette.
הערה: השתמש את קובץ html משלימות, אשר יבצע חישובים באמצעות קוד JavaScript, (יתרון במערכות שאין המותקן בתכנת) או גיליון אלקטרוני לחישוב ההיסט בין קואורדינטות הבמה ו פיפטה וכדי חישוב הציון של המטרה עבור בקר ה-פיפטה. - הסר את פיפטה עמודת המים בציר x, שמירה z ו- y זהה.
- לעבור על פיפטה Z פקעית היעד Z (קרי, להעביר פיפטה למטה בכיוון Z מתחת coverslip)
- להעביר את פיפטה Y הקואורדינטה פקעית Y היעד.
- להזיז את התצוגה בשידור חי 2-פוטון של פקעית היעד Z ולאחר מכן על הקצה של הכליה ורשום את SX.
- לחשב את הקצה כליות PX באמצעות ההיסט של הרישום SX.
- להעביר את הבמה לכיוון פיפטה (עלייה SX) כך הקצה של הכליה היא הרחק בצד שמאל של המסך, אבל עדיין נראה לעין.
- לקדם את פיפטה במהירות כ-100 מיקרומטר פחות הקצה כליות PX החישוב לעיל.
- אתר הטיפ פיפטה, לקדם את פיפטה לאט. להגדיל את הרווח אדום ולצפות ההיסטוגרמה פיקסל אדום (הפיקסל הפצה משמרות לפני פיפטה זה עם תמונה בחלון, עקב הבהירות קיצוני של נקודות קוונטיות, זריחה את המטרה).
- מראש לקצה כליות תחת הדמיה פוטון 2 בשידור חי.
הערה: לפני הכניסה הקפסולה כליות, אפשרי לנתב מחדש את פיפטה בממדים Y ו- Z. עם זאת, זה עלול להתנתק הטיפ פיפטה. מדד יותר שמרני, אם פיפטה היעד, הוא לסגת בממד X עד 2 ס מ ניתוב מחדש, ואז שובו בממד X לקצה כליות. ברגע פיפטה בתוך הרקמה, תנועה בציר כל פרט X מוביל כיפוף פיפטה הדורש ניסיון רב כדי להפוך את השימוש, ולעיתים קרובות מוביל שבירה. - נסיעה פיפטה על ציר ה X לאט אל המטרה להידבק PX, עין SX. (זה עוזר לחזור מדי פעם פקעית כדי לראות אם זה השתנה בכלל על החדרת micropipette).
- כשאתה במיקום הנכון, מסמך עמדה עם z-מחסנית.
הערה: עם micropipette במקום, תרופות, חלבונים, או פלורסנט המשדרים עשוי להיות מוזרק, נוזל עלול להיות aspirated לניתוח בשלב מאוחר יותר או אולי ניתן למדוד לחץ או תשלום יחסית אלקטרודה נוספת.
5. השאיפה של נוזל מהחלל של באומן
- להגדיר את micropump כדי להזריק 100 nL של perfluorodecalin יותר מ 2 דקות כדי להבטיח patency של פיפטה לצמצם בלבול של פיפטה חיבור במהלך הזנת. Reimage כדי להבטיח מיקום פיפטה.
- לחכות 4-6 דקות עבור סינון.
- להגדיר את micropump מחוק לגמרי עד 300 nL בשיעור של עד 50 nL/min.
הערה: השינויים מורפולוגיה glomerular שאינם קיימים בקצב הזה, מציע שזה אינו משנה את קצב משלוח של נוזל למרחב בזמן השאיפה. מאחר אין גוש שמן כמו micropuncture המקובלת, שחזור של אמצעי אחסון זה, הכרחי עבור ספקטרומטר מסה, עשוי לכלול חלק perflourodecalin מוזרק נוזל ואולי צינורי. עבור מבחני כגון אלקטרודות יון רגיש מדידות קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה, תגובת שרשרת פולימראזית נקודות הקצה רגיש האחרות, כרכים התחתון עשוי לשמש. אם ספקטרומטר מסה אינה נקודת הקצה, שמן מינרלי וטכניקות micropuncture רגיל יכול לשמש כדי למדוד את עוצמת הקול aspirated לפני האחסון. - תמונת פעם נוספת.
- למשוך את פיפטה ולשמר את הדגימה, הוספת טריס מאגר ואחסון ב-80 מעלות לפני ניתוח.
- המתת חסד העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין או שיטה אחרת שאושרו.
הערה: פילטרט של מזין את החלל על ידי סינון מן הנימים glomerular. קצב הסינון glomerular יחיד-נפרון (SNGFR) בעכברים הוא דיווח בין 8 – 14 nL לדקה3 כוחות סטרלינג למשול SNGFR, עם זאת, לחץ הידרוסטטי שלילי בחלל של באומן ולכן עשוי להגביר SNGFR. שיטות micropuncture רגיל להשתמש המצור צינורי עם שמן ולחץ נייטרלי לדיגום נוזלים צינורי, אולם תרכובות אלו להפריע ספקטרומטר מסה (ראו להלן); לכן, בטכניקה זו המקורבת המוקדמות נשאר פטנט. יתר על כן, בזמנו של שאיפה, השטח של באומן מכיל לא ידוע, אבל נפח חיובי של פילטרט. לכן, השאיפה נוזלים קצב עשוי לעלות SNGFR.
הערה: בניסויים המתוארים כאן, המטרה הייתה להשיג גדול יותר מאשר מדגם הרגיל של פילטרט של glomerular לניתוח ספקטרומטר מסה בטכניקות nanoproteomic. מאז השימוש ספקטרומטר מסה מונע שימוש של שמן בלוקים עם שמן מינרלי או שעווה (תערובות מורכבים של מולקולות אורגניות המקטינים האות: רעש ספקטרומטר מסה) perfluorodecalin משמש כדי למלא את micropipette ואת המזרק. Perflourodecalin לא ידוע לחסום את זרימת צינורי, אבל לא פעיל מבחינה ביולוגית, לא מפריע ספקטרומטר מסה.
Representative Results
הליך זה דורש הכנה כירורגי ייחודי של הכליה עבור 2-פוטון הדמיה ו- access, אשר מודגם באיור1. הכנת המוצגת כאן מאפשר הדמיה עמודה אנכית עם המטרה מעל הכליה עם שינויים ספורים בלבד צפיפות עבור אופטיקה אפשרי הטוב ביותר עבור 2-פוטון מיקרוסקופ בו זמנית עם גישה לרוחב הפיפטה מונע באופן בלעדי הציר האופקי (x ) ממד. ההבלטה חלקית של הכליה מונעת מתח עודף על pedicle הכליות ושומר את זרימת הדם ומאפשר בנייה של תמיכה בכליות מותאם אישית את שתי מטרות של הדמיה וגישה. האתגר השני בהליך זה הוא מיקום מדויק פיפטה בתוך הכליה 3 ממדים, אשר דורש רישום של מערכות קואורדינטות פיפטה והבמה. השלב הקריטי עבור תהליך זה מודגם באיור 2, אשר מציג את פיפטה שיבחינו בעמודת המים של המיקרוסקופ פוטון 2 תחת דאפי-עירור. הזנת עמודת המים ורישום את הקואורדינטות של פיפטה לאלה של השלב מיציאתם הכליה חיוני כדי לאפשר מיקום סטיאוטטי מדויק פיפטה במרחב של באומן היעד. פיפטה נכנס עמודת המים הדמיה מצד הימין. עם דאפי עירור מופעל, פיפטה מצופים נקודה קוונטית אדום שזוהר במאור פנים עם הכתום-האדום, זה יכול להיות ממוקם בקפידה תחת אמצע המטרה. קרן עירור עובר דרך מרכז המטרה פיפטה בחופשיות מועברות עד לנקודה של קרינה פלואורסצנטית המרבי, להבטיח שזה יהיה גלוי העינית.
משיכת פיפטה נאות ובחירת פקעית הם קריטיים להצלחה של פרוטוקול זה, כמודגם באיור 4, איור 3, איור 5. ב- איור 3A, ניתן לראות micropipette זכוכית מצופים נקודה קוונטית הוציא כראוי, אדום-פלורסנט עם תמונה בעמודה נוזלים במהלך החלק רישום פיפטה של ההליך. הטיפ הוא 6 מיקרון ברוחב. ב- 3B איור, מוצג על פיפטה גרוע שלף עם 12 מיקרומטר טיפ. פיפטה הזה לא מצליח לחדור את הקפסולה כליות ללא גרימת טראומה כלי הדם עקב 12 מיקרומטר קוטר משטח עצה לא סדיר (שים לב א. ר בחלק העליון של המסגרת המשופעת). ב איור 3C ו- 3D, החשיבות של האופטימלית מיצוב יותר מאשר הדמיה של פקעית היעד מוצג. פקעית יפה, ליד-פני מאויר באיורים איור 3C מדגים הדמיה חיובית (עקב מיקומו משטח ב 20 מיקרומטר מתחת הקפסולה כליות) אבל לא יהיה מתאים לגישה באמצעות הליך זה כי זה קרוב מדי אל פני השטח, ו פיפטה שדדת את coverslip. דמות תלת-ממד, מוצגים glomeruli במיקום אופטימלי. הערה בסולם שונות נעשה שימוש כדי להדגים שני glomeruli (סולם ברים הם כל 50 מיקרומטר). Glomeruli אלה מופיעים חדה פחות בגלל השתברות הנגרמת על ידי עומק; תמונה זו צולמה ב 70 מיקרומטר מתחת הקפסולה כליות. קצה לרוחב כליה הוא 250 מיקרומטר מימין, שניהם glomeruli אלה לנגישים. במהלך שגרת גישה, הדמיה מתמקדת בחוזקה פקעית היעד כמו באיור 4, ומשמש ייבוא תמונות כל שניה, ומאפשר החוקר להתבונן דווקא מיקום פיפטה בחלל של באומן.
איור 4 מדגים ערך כליות טיפוסי וכתוצאה מכך, טיפ פיפטה במרחב של באומן. ב- איור 4A, הקרנה בעוצמה אומר מאוסף-z עם נוף אורתוגונלית מדגים את הטיפ פיפטה בחלל של באומן. שימו לב כי אין פיפטה אדום עצה ספקטרלי החפץ (כדור עגול של קרינה פלואורסצנטית) עקב קרינה פלואורסצנטית בהיר מאוד של הנקודות קוונטית המסודרים על המקטע חרוט של הקצה. ב- איור 4B, תחזית האחסון של נתונים z-מחסנית מדגים פיפטה אחר במרחב של באומן. שימו לב כי פיפטה גרר בכיוון הנסיעה כמוסה של באומן על ערך, יצירת לכאורה להקים אוהל מאחורי המידע כמפורט בפרוטוקול.
איור 5, תוצאות הליך שנכשלו מוצגים בו פיפטה עם חור גדול מדי שבר-הקפסולה כליות, גרימת דימום. פיפטה היה בוטה מדי; על ניסיון להעביר את הקפסולה כליות, הקפסולה נדחף לפני הטיפ פיפטה עד שבירה אירעה. בתמונה זו, הקפסולה כליות הוא גלוי, משופרת על ידי דימום subcaspular, FITC-פלורסנט גרין. FITC אות הוא גלוי בתוך פיפטה עצמו, המציין כי דם בלחץ נכנסו לומן פיפטה. החץ מצביע על תאי דם אדומים רבים גלוי בתוך לומן פיפטה בתור מילוי פגמים FITC-לתוספי.
איור 6 מתאר קשת המוני נציג המתקבל וביופסיה שטח של באומן, החלבון בשתן העכבר 17 (MUP17). לבסוף, טבלה 1 מדגים דוגמה תוצאות מההליכים השאיפה מוצלחת, רישום חלבונים מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה ננו על וביופסיה שנאסף מעל 6 דקות מכל 3 עכברים. בכל מקרה, פיפטה צולמה כפי שזה היה מסוגר מהחלל של באומן, זריחה FITC לא נצפתה בתוך החלל של באומן או פיפטה לומן, המציין היעדר זיהום וביופסיה עם פלזמה. 17 חלבונים, בעיקר של משקל מולקולרי נמוך, אותרו לפחות 2 פפטידים ייחודי לכל חלבון. ספירות ספקטרלי, עקבי עם הערכות מוקדמת של חלבון פילטרט של glomerular נמוך, ידוע מסוננים חלבונים, כגון ויטמין D מחייב חלבון (VTDB), אלבומין (אלבו), ו החלבון בשתן העיקריים 17 (MUP17) נוכחים.
איור 1: הבלטה חלקית של הכליה עם תמיכה מותאמת אישית הנייח לגישה לרוחב. בצד השמאל, החלקים של התמיכה עמודה וכליות ההדמיה מוצגים, עם מכלול שלם במרכז. בצד הימין, הכנת כליות מוצג לפני (למעלה) ואחרי (למטה) יישום של התמיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הושלמה הכנה כליות בשלב ההרשמה פיפטה של פרוטוקול. . דאפי עירור משמש כדי למקם את micropipette בתוך עמודת המים של המיקרוסקופ פוטון 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הדמיה של מדי סוכר, הכליות לאחר הזרקה של FITC-לתוספי, הוכחת glomeruli מתאימים ולא מתאימה עבור micropuncture. א פיפטה משך היטב עם 6 טיפ מיקרומטר. B. טיפ עם קצוות גס, בוטה. ג פקעית הזה מוגדר היטב, אך גם לסגור coverslip עבור micropuncture. ד ממוקם כראוי glomeruli. גודל ברים הם כל 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: פיפטה מוצלח מעבר שמוביל השמתם השטח נוף של באומן מ 2 ניתוחים שונים. א Z-מחסנית עם תחזיות orthogonal מדגים פיפטה עצה בחלל של באומן סמוכים אניץ glomerular. סולם בר הוא 50 מיקרומטר. B. אמצעי עיבוד מערימת-z מדגים באופן דומה על פיפטה בחלל של באומן סמוכים אניץ glomerular. סולם בר הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שגרת שנכשל בשל פיפטה בוטה, קורע את הקפסולה כליות ולהוביל אל מדמם לתוך לומן פיפטה. קרינה פלואורסצנטית FITC פלזמה extravasated, ואת תאי דם אדומים (חץ) גלויים בתוך פיפטה. החץ מצביע על תאי דם אדומים גלוי בתוך לומן פיפטה. סולם בר הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: הספקטרום המוני עבור החלבון בשתן העיקריים 17 (MUP17), המתקבל הננומטרי כרומטוגרפיה נוזלית/מסה ספקטרומטר ניתוח שטח וביופסיה של באומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| חלבון | MW (kD) | מתכוון לספור ספקטרלי |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
טבלה 1: רשימת חלבונים שזוהתה וביופסיה של באומן שטח של 3 עכברים.
משלימה Video 1: עיבוד כרך מאוסף z-רכשה לאחר מיצוב פיפטה בחלל של באומן מדגים את הטיפ פיפטה בתוך החלל, סמוכים על נימי אניץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
אנו מציגים שיטה לגישה של באומן מרחב של הלא-פני glomeruli בעכברים, בהנחייתם של פוטון 2 מיקרוסקופ. פיתחנו בהליך זה כדי לטפל מגבלה מפתח של micropuncture glomerular, בנגישות של משטח glomeruli והאופקיים בהם יכול פוטון 1 מיקרוסקופיה בעכברים, על מנת להקל על מטרה ניסיוני, השאיפה של נוזל מתוך מקום של באומן לאחר מכן ניתוח. פיתוח ותרגול של טכניקה זו נשענת על שישה שלבים קריטיים. ראשית, הכנת ניתוחים חדשניים צריך בקפידה להתבצע כך עמודת המים הדמיה לא לברוח את coverslip ולא coverslip משתרע על פני השטח של הכליה אשר מהווה יעד פיפטה. שנית, פיפטה מזכוכית שימשו micropuncture חייב לבצע רינדור של פוטון 2 מיקרוסקופ, אשר מושגת באמצעות נקודות קוונטיות נראות לעין. שלישית, סטיאוטטי טכניקה נדרש כדי למקם בדיוק פיפטה בחלל של באומן בשלושה ממדים, עד 100 מיקרומטר מתחת לפני השטח כליות. לכן, רישום של מערכות קואורדינטות פיפטה על הבמה עם דיוק הם שלבים קריטיים. מבחר פקעית היעד הרביעי, זהירות הכרחי להבטיח שהוא נגיש פיפטה ללא impingement מאת המבנה של תמיכה בכליות והעמודה הדמיה. לבסוף, שיקול דעת זהיר חייב להינתן לשלבים אנליטית פעל בהתאם להליך הרכישה, נפח והתזמון של רכישת דגימות הנוזל חייב להיות מתאימים את הניתוח, פיזיולוגיה glomerular.
תיכננו הליך רכישת יורחב כדי ניתוחים רבים, כולל הקצה micropuncture מסורתיים, כגון photometry להבה, מדידות יון רגיש אלקטרודה או מדידות של לחץ, נפח או תשלום. בנוסף, אנו מאמינים שטכניקה זו תהיה נוטה? הרומן הקצה אנליטיים כולל תגובת שרשרת פולימראזית (אולי בעקבות שעתוק במהופך על miRNA), גליקומיקס במורד הזרם של ספקטרומטר מסה. השינויים מיוחד מועסק כדי להקל על ספקטרומטר מסה מגיע לדיון נוסף, הם להטיל עליהם מגבלות מסוימות. ראשית, למרות ספקטרומטר מסה היא רגישה מאוד, תכולת החלבון נמוכה ונפח micropuncture דוגמאות של מעבד ניתוח של חלבון מתחת הטווח הדינמי של חקר פרוטיאומיה מבנית קונבנציונאלי, ולכן היו nanoproteomics מפושטת הכרחי. 8 , 13 . שנית, כדי למטב את החלבון התשואה עבור מבחני מוקדם, קבענו כי 200-300 nL של וביופסיה היה הכרחי, אבל דה נובו פילטרט של רכישת אמצעי אחסון זה ידרוש אולי עוד 20 דקות של השאיפה אם העכבר GFR רק 8-14 nL /min3. כפי טוג'ו, Endou הדגימו כי השאיפה ממושכת משנה את תכולת אלבומין המקורבת מוקדמת נוזל14, ובחרנו מחוק לגמרי מעל 6 דקות; אולם כלומר כי קצב השאיפה שלנו חורגת פילטרט של קצב זרימה פנימה. משתמשים של הליך זה נקראים לשקול הפיזיולוגיה של סינון glomerular במערכת הניסוי שלהם לעצב את זרימת העבודה שלהם. ספקטרומטר מסה, טכניקה רגישה, מוצפת האיתות תזקיק נפט הציג כגון שמן מינרלי, אשר הוא נפוץ micropuncture מהווים מערכת הידראולית עבור השאיפה ולבודד חלקי נפרון. לכן, לא יזיק לנו שמן מינרלי למטרה זו, או השתמש משותף אחרים שלה, כימות עוצמת הקול של nanoliter מגוון דוגמאות. במקום זאת אנחנו למלא את המערכת perfluorodecalin שהוא אינרטי מבחינה ביולוגית, לא להפריע ספקטרומטר מסה, יש מאפיינים אופטיים חיובית. אנו מאמינים המגבלות שהוטלו על-ידי perfluorodecalin הם surmountable והם עובדים על חידושים טכניים נוספים אשר אנו מצפים יאפשרו מדידה של נפח דגימה ומצור מקטע צינורי.
רוב המחקרים micropuncture בוצעו בחולדות מינכן-Wistar, אשר מדגימים מספר רב יותר של פני השטח glomeruli, אבל המחקר הפיזיולוגיות מוגבלת מאוד תחבורה צינורי, פיזיולוגיה של הכליה אחרים בגלל אובדן הבסיסית כלי של הביולוגיה המולקולרית, העכברים הטרנסגניים2,3. כי הוא מקל micropipette גישה למרחב של באומן בעכברים, הטכניקה הרומן ולכן מפחית את הסיכון של מגבלות קריטיים אלה. אימצנו בטכניקה זו כדי לגשת פילטרט של הכליה ללימודי פרוטיאומיה מבנית באמצעות ספקטרומטר מסה רגישות גבוהה, המכונה nanoproteomics9. עם זאת, ישנם יישומים נוספים סביר. לדוגמה, כליות מחקר הפיזיולוגיות של חלבון מסוננים באופן משמעותי נעזר בגילויים השימוש המשדרים פלורסנט עם מיקרוסקופ פוטון 215,16,17. תוספת של micropuncture ל 2-פוטון מיקרוסקופ מציעה את האפשרות של ביצוע המחקר הפיזיולוגיות יחיד-נפרון עם מולקולות פלורסנט, ומאפשר nephrons שכנות, שאינם מזריקים גם לשמש כפקדי. יש לקוות כי הסבר זה ברור של הצעדים הנדרשים תאפשר אימוץ רחב במעבדות מצוידים כבר 2-פוטון מיקרוסקופ ו/או micropuncture. למרות מורכבות, יש עכשיו ביצענו הליך זה פעמים רבות ולייצג ליטושים שהוצגו במסמך זה פלטפורמה יציבה עבור גילוי הפיזיולוגיות.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 כדי NIGMS מז GM103493 P41 כדי RDS. חומר זה הוא התוצאה של עבודה (על-ידי קמ"ש), אשר נתמך עם משאבים, שימוש במתקני במרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים פורטלנד. התכנים אינם מייצגים את נופי המחלקה לענייני חיילים משוחררים ארה ב או ממשלת ארצות הברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
