En langsiktig kultur modell av bovin granulosa celler under serum-free forhold er beskrevet. Denne modellen tillater forskere til å studere virkningene av ulike faktorer som forskjellige plating tettheter på egenskapene til østrogen-produserende bovin granulosa celler.
Eggstokkreft granulosa celler (GC) er den viktigste kilden til østradiol syntese. Indusert av preovulatory luteiniserende hormon (LH) bølge, cellene i theca og spesielt av granulosa celle laget dypt endre karakteristikkene morfologiske, fysiologiske og molekylære og danne progesteron-produserende corpus luteum som er ansvarlig for graviditet. Celle kultur modeller er viktige verktøy å studere underliggende regulatoriske mekanismene som er involvert i folliculo-luteal transformasjonen. Presentert protokollen fokuserer på isolasjon prosedyre og kryonisk bevaring av bovin GC fra små – og mellomstore follikler (< 6 mm). Med denne teknikken, kan du få nesten ren innbyggere GC. Kryonisk bevaring prosedyren forenkler sterkt styring av cellekultur arbeide uavhengig av en direkte primære vev (eggstokkene) forsyning. Denne protokollen beskriver en serum-free celle kultur modell som etterligner østradiol-aktiv status for storfe GC. Viktige forhold som er avgjørende for en vellykket steroid-aktiv cellekultur omtales i protokollen. Det er vist at økende plating tettheten av cellene induserer en bestemt respons som angitt av en endret gene expression profil og hormon produksjon. Videre, denne modellen gir grunnlag for videre studier på GC differensiering og andre programmer.
Vellykket eggløsning og luteinization avhenger av fint innstilt og velorganisert molekylær endringer i forskjellige somatisk follikulær celletyper. Siden detaljer om disse utviklingsprosesser ikke er ennå fullt ut forstått, ytterligere er avklaring nødvendig. I vivo tilnærminger er omfattende og kostbare, og spesielt ikke adressen spesifikk molekylære mekanismer som oppstår under folliculogenesis. Derfor er reductionistic i vitro modeller nødvendig i tillegg til å gi innsikt i mobilnettet og molekylære detaljer. Forskjellige studier beskriver kultur hele follikler i sammenheng med i vitro fertilisering teknikker1,2,3. Fordi forskere er interessert i mekanismer av differensiering, fokuserer mange studier på follikulær GC. Disse cellene, direkte forbundet med oocyte, er de store kildene av østrogenproduksjonen og dermed spille en viktig rolle i folliculogenesis og luteinization4.
Udødeliggjort cellen linjer av GC er utviklet fra ulike arter. De fleste av dem, men viser ikke en tilstrekkelig steroid hormon produksjon5. Så langt bare én celle linje med storfe GC har vært etablert6, men denne linjen mistet sin steroidogenic aktivitet etter flere avsnitt7. Derfor, siden steroidogenesis og, spesielt, østradiol produksjon er en viktig funksjon i GC-funksjonalitet, er det tilrådelig å studere disse aspektene i primære celle kultur modeller. I tidligere studier ble det vist at en betydelig østradiol produksjon kan bare følges under serum-fri kultur forhold8,9. Videre er, kosttilskudd av en forløper til østradiol syntese en annen forutsetning som GC ikke klarer å uttrykke nødvendig enzymet som kan konvertere progesteron androstenedione10. I tillegg viste synergistisk effekten av FSH og IGF-1 tilskudd i vitro en optimalisert aktivitet av aromatase, viktige enzymet østradiol syntese11. I stede protokollen, er andre viktige faktorer som har en betydelig innvirkning på GC kultur modellen også beskrevet. Spesielt har cellen plating tetthet enorm effekter på resultatet av eksperimentet12. Videre kan kryonisk bevaring teknikk bovin GC som ikke betydelig forstyrrer GC fysiologi i kultur etableres. Denne teknikken hjelper å forbedre organiseringen av celle kultur arbeidet og optimalisere foretrukne plating tetthet.
Presentert celle kultur modellen har et verktøy for å analysere granulosa celle differensiering i vitro. Flere studier viste at en serum-free dyrking er en forutsetning for å opprettholde steroid aktivitet i kulturperler bovin GC eller GC av andre arter8,9. I tillegg forbedret belegg kultur parabol med deler av ekstracellulær matrix (f.eks, kollagen R)13, feste cellene betraktelig. En annen viktig funksjon er langvarig kultur perioden. Nylig har det vært vist at en langsiktig kultur er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig steroidogenic aktivitet og et balansert uttrykk granulosa celle identitet markører17. Det synes at GC krever tid å gjenopprette fra fysisk stresset under isolasjon prosedyren.
Media kosttilskudd FSH, IGF-1 og androstenedione er kjent å indusere aromatase aktivitet i kultivert GC. Spesielt, kosttilskudd med androstenedione er absolutt nødvendig, som GC trenger en forløper for østradiol syntese. Dette har vært publisert tidligere11,18 , og derfor ble ikke videre undersøkt i studien. Men kan en tilpasning av FSH, IGF-1 og androstenedione konsentrasjoner være nødvendig for andre eksperimentelle oppsetninger.
Kryonisk bevaring teknikken beskrevet her kan bidra til å forbedre organiseringen av vev kultur eksperimenter ved å gjøre dem mer uavhengig av varierende tilbudet med eggstokkene. Ifølge tidligere tester, påvirker ikke kryonisk bevaring GC fenotype eller steroid produksjon i kultur. Også avsløre overflod av markør utskrifter i kulturperler celler ikke betydelige forskjeller sammenligne prøver forberedt fra friske isolert celler med de tidligere utsatt til kryonisk bevaring16.
En viktig parameter for nåværende GC kultur modellen er cellen plating tetthet. Som vist ved Representant resultater, indusert øke plating tetthet bemerkelsesverdige endringer av fysiologiske og molekylære egenskaper. Flere gener er regulert på en bestemt måte, ligner endringene som er indusert av LH stimulering i vivo4,19. Det faktum at en økende celle tetthet kan kjøre differensiering-lignende prosesser i kulturperler bovin GC har vurderes omhyggelig i denne GC i vitro modellen å unngå motstridende resultater mellom gjentak. Derfor motstridende resultater med andre studier kan tilskrives forskjellige celle tettheter og bør undersøkes nærmere.
Kultur modellen beskrevet her avslørt for å være ikke-responsiv til LH, som utskrifter av reseptoren LHCGR er nær grensen på gjenkjenning. Derfor en simulering LH surge både i vivo situasjonen ikke å indusere differensiering13. Likevel, denne modellen gir et nyttig verktøy for å studere østradiol aktive GC i primære kultur, spesielt ikke funksjonelle bovin GC linjer finnes i dag.
Annen behandlingsprotokoller kan testes i stede GC kultur modellen som bidrar til å løse regulatoriske mekanismer steroid produksjons-eller GC differensiering. Videre, enkelt faktorer som er involvert i utviklingsprosesser kan analyseres separat. Derfor gir denne kultur modellen grunnlag for mange forskjellige programmer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Veronica Schreiter for hennes utmerket kundestøtte og nyttig modifikasjoner av etablerte kryonisk bevaring teknikk og celle kultur modellen. I tillegg gjerne vi takke Maren Anders og Swanhild Rodewald for deres utmerket kundestøtte i den påfølgende analysen.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |