Summary
Um modelo de cultura a longo prazo das células da granulosa bovinas sob condições isento de soro é descrito. Este modelo permite aos pesquisadores estudar os efeitos de diversos fatores e condições como o chapeamento de diferentes densidades, sobre as características dos produtores de estrogênio as células da granulosa bovinas.
Abstract
Células da granulosa ovariana (GC) são a principal fonte de síntese de estradiol. Induzida pelo aumento preovulatory hormônio luteinizante (LH), células da theca e, em particular, da camada de células da granulosa profundamente mudam suas características morfológicas, fisiológicas e moleculares e formam o corpus produtoras de progesterona lúteo que é responsável por manter a gravidez. Modelos de cultura de célula são ferramentas essenciais para estudar os mecanismos de regulação subjacentes envolvidos na transformação folliculo-lútea. O protocolo apresentado enfoca o processo de isolamento e criopreservação de bovino GC de folículos de pequeno a médio porte (< 6mm). Com esta técnica, pode ser obtida uma população quase pura de GC. O processo de criopreservação facilita muito o tempo de gerenciamento da cultura de pilha funcionar independente de um fornecimento de tecido (ovários) primária direta. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular isento de soro que imita o status de estradiol-ativo de GC bovina. Condições importantes que são essenciais para uma cultura de células de esteroide-ativo bem-sucedido são discutidas em todo o protocolo. Está demonstrado que o aumento da densidade de chapeamento das células induz uma resposta específica conforme indicado por uma produção de perfil e hormônio de expressão do gene alterado. Além disso, este modelo fornece uma base para estudos adicionais na diferenciação de GC e outras aplicações.
Introduction
Luteinization e ovulação bem sucedida dependem de alterações moleculares finamente sintonizadas e bem orquestradas em tipos de diferentes células foliculares somática. Desde que os detalhes destes processos do desenvolvimento ainda não são totalmente compreendidos, ainda mais esclarecimentos é necessário. Na vivo abordagens são elaborados e dispendiosos e, em particular, deixam de mecanismos moleculares específicos de endereço que ocorrem durante a Foliculogénese. Portanto, modelos reducionistas em vitro são necessários além disso, de fornecer informações sobre detalhes de celulares e moleculares. Vários estudos descrevem a cultura dos folículos inteiro no contexto na vitro fertilização técnicas1,2,.3. Porque os pesquisadores estão interessados nos mecanismos de diferenciação, muitos estudos enfocam GC folicular. Estas células, diretamente associadas com o oócito, são as principais fontes de produção de estrogênio e, assim, desempenham um papel essencial ao longo da Foliculogénese e luteinization4.
Imortalizado célula linhas de GC foram desenvolvidas de diferentes espécies. A maioria deles, no entanto, não mostram uma suficiente de produção de hormônio esteroide5. Até agora, apenas uma célula linha de bovinos que GC tem sido estabelecida6, mas esta linha perdeu sua atividade esteroidogênica após várias passagens7. Portanto, desde esteroidogênese e, em particular, a produção de estradiol é uma característica essencial da funcionalidade do GC, é aconselhável estudar estes aspectos em modelos de cultura celular primária. Em estudos anteriores, foi demonstrado que uma produção de estradiol consideráveis só pode ser observada sob condições de cultura livre de soro8,9. Ainda mais, a suplementação de um precursor da síntese de estradiol é outro pré-requisito, como GC deixar de expressar a enzima necessária que pode converter progesterona para androstenediona10. Além disso, o efeito sinérgico do FSH e IGF-1 suplementação em vitro revelou uma atividade otimizada de aromatase, a enzima chave da síntese de estradiol11. O presente protocolo, outros fatores importantes que têm um impacto substancial sobre o modelo de cultura de GC também são descritos. Em particular, a célula chapeamento densidade tem enormes efeitos sobre os resultados do experimento12. Além disso, uma técnica de criopreservação de GC bovina que não interfere significativamente com a fisiologia de GC na cultura pôde ser estabelecida. Esta técnica ajuda a melhorar a organização do trabalho de cultura celular e para otimizar a densidade de chapeamento preferencial.
Protocol
Nota: Ovários bovinos foram obtidos de um matadouro comercial. A coleção de subprodutos de matadouro não requer uma aprovação ética de acordo com a lei alemã.
1. condições de trabalho e preparações
- Para garantir a esterilidade, executar todas as mídias e preparação do tecido, bem como toda a cultura de trabalho em um laboratório de cultura de célula especializada usando um banco do fluxo laminar.
- Prepare 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS, pH 7,4) suplementada com 100 UI de penicilina, estreptomicina 0,1 mg/mL e 0,5 µ g / µ l anfotericina para o transporte dos ovários.
Nota: A duração máxima entre receber os ovários e isolando o GC é 2h neste set-up.
2. isolamento de células da Granulosa bovinas
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Lave os ovários várias vezes em PBS 1x (com 100 UI de penicilina e estreptomicina 0,1 mg/mL, 0,5 µ g / µ l anfotericina) para remover qualquer sangue da superfície antes de iniciar o procedimento de isolamento. Use um copo, coloque os ovários dentro, preenchê-lo com PBS 1x e descartar a PBS novamente.
- Repita essa etapa de lavagem 3 – 4 x, até que os ovários estão limpos de qualquer sangue restante.
- Limpe um ovário utilizando um laboratório embebido com álcool a 70%, para minimizar possíveis contaminações.
- Com uma seringa de 3 mL e uma agulha de 18 G, Aspire o GC por punção de folículos de pequeno a médio porte (< 6mm, medido com uma régua) e o fluido folicular em um tubo de centrífuga de 50 mL do pool.
Nota: Para umedecer a seringa, tome uma quantidade pequena de 1X PBS (com 100 UI penicilina, estreptomicina 0,1 mg/mL e 0,5 µ g / µ l anfotericina). Isto ajuda a coletar pequenas quantidades de fluido folicular e impede que as células da colagem dentro da seringa. - Após perfurar vários folículos, enxágue a seringa e agulha com 1X PBS para limpeza intermediária.
3. criopreservação de células
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Use a coloração azul trypan e contar as células sob um hemocytometer.
- Para contar o número de células viáveis, prepare um tubo com 1,5 µ l de uma solução de azul de trypan 0,25%.
Nota: As células vivas permanecerá inocente porque trypan azul só pode acessar a barreira celular de células mortas, que em seguida aparecem a azul. - Adicionar a solução de azul de trypan 15 µ l de suspensão de células da granulosa e misture-os delicadamente.
- Coloque a mistura em ambas as câmaras de um hemocytometer. Contar o número de visitas (por exemplo, inocente) de células em um quadrado grande por câmara.
Nota: Apesar de algumas células de sangue pode ser vistas, eles podem ser distinguidos pelo seu tamanho muito pequeno. - Calcular o número de células vivas com a média dos dois quadrados de câmara de acordo com as orientações gerais; a proporção de células vivas pode variar entre os ovários, mas deve exceder 60%13.
- Para contar o número de células viáveis, prepare um tubo com 1,5 µ l de uma solução de azul de trypan 0,25%.
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Tire uma amostra do pool de célula granulosa recém isoladas como uma referência para uma análise mais aprofundada.
- Dependendo da contagem de células do CG isolado, Reserve um número adequado de células como amostras de referência para a preparação de proteínas, DNA ou RNA.
Nota: Para isolamento de RNA e a subsequente avaliação de expressão do gene, 1 x 105 células são suficientes, enquanto outras análises subsequentes podem exigir números de telemóvel diferentes, geralmente maior. - Coloque uma ou várias alíquotas das células de referência em um tubo de fresco e -centrifugar por 1 min a temperatura e a velocidade máxima (12.000 x g) para obter um centrifugado. Desprezar o sobrenadante.
- Imediatamente choque-congelar as amostras em nitrogênio líquido. Armazenar a amostra a-80 ° C.
- Dependendo da contagem de células do CG isolado, Reserve um número adequado de células como amostras de referência para a preparação de proteínas, DNA ou RNA.
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Execute a criopreservação como segue.
- Prepare o meio de congelação utilizando 80% de soro de vitela fetal (FCS) e 20% dimetilsulfóxido (DMSO).
- Fim de pelota suavemente o GC, centrifugar o GC durante 3 min à temperatura ambiente e 500 x g.
- Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender delicadamente as células em FCS de 100% (por exemplo, 1 mL) até nenhuma célula mais aglomerados são visíveis.
- Adicionar 1 volume (por exemplo,1ml) do meio de congelamento preparado à suspensão de células e transfira a mistura para um frasco criogênico.
Nota: A concentração final de mídia cryo-protegendo será 90% FCS e 10% de DMSO. - Coloque o frasco criogênico em um contêiner de congelação (comercialmente disponível) especializado que evita a congelação rápida. A taxa de resfriamento das amostras não deve exceder-1 ° C/min. o congelamento recipiente de transferência em um freezer-80 ° C durante pelo menos 4 h.
- Para uma conservação mais longa, coloque os frascos criogênicos em recipientes de ultra baixa temperatura (por exemplo, recipientes de nitrogênio de fase líquida).
Nota: O protocolo pode ser parado aqui, como a criopreservação permite conservação mais longa.
4. preparação de mídia e placas de cultura para a cultura de células
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Revestimento de placas de cultura celular com colágeno 0.02% R.
Nota: Colágeno R é conhecido por ser essencial para um anexo melhorado de GC na cultura.- Prepare uma solução de R 0,02% colágeno com água purificada apropriada para cultura de células.
- Adicionar 150 µ l por alvéolo em uma placa de 24 (= 2cm2/bem) e certifique-se de que toda a superfície da cultura é bem coberta com a solução de colágeno R.
- Deixe a solução secar com a tampa aberta por algumas horas ou durante a noite do bairro de fluxo laminar.
- Quando as placas de cultura estão completamente secas, irradiá-los com a luz UV para 10-15 min minimizar a contaminação.
- Se necessário, armazene as placas a 4 ° C por até 2 meses.
- Prepare a mídia e suplementos para o trabalho de cultura sob uma capa de fluxo laminar. Para uma recuperação bem sucedida do CG, eles têm de ser processadas imediatamente após o descongelamento.
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Prepare os seguintes meios de comunicação.
- Suplemento meio α-mínimo essencial (α-MEM) com 2 mM L-glutamina, 0.084% de bicarbonato de sódio, 0,1% albumina de soro bovino (BSA), 20 mM HEPES, Selenito de sódio 4 ng/mL, 5 transferrina µ g/mL, 10 ng/mL insulina e 1 mM não aminoácidos essenciais.
- Além disso, adicione 100 UI de penicilina e 0,1 mg/mL Estreptomicina para a mídia.
Nota: Os antibióticos, uma vez aquecidos, são estáveis por aproximadamente 48 h. Portanto, alíquota a quantidade desejada de mídia para a configuração de cultura e mídia planejada trocar. Pré-aqueça apenas as alíquotas de mídia a 37 ° C em banho-maria. A mídia preparada pode ser armazenada a 4 ° C, para não mais que 3 meses. - Para induzir a atividade de esteroides em GC bovina cultivada, complementar o α-MEM adicionalmente com 20 ng/mL hormônio folículo - estimulante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 e 2 µM de androstenediona.
Nota: Sempre complementar esses componentes pouco antes do início de uma troca de cultura ou mídia. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento de soluções estoque FSH e IGF-1, pois isto pode comprometer a atividade de esteroides.
5. trabalho de cultura de células
- Descongelar as células rapidamente em banho-maria a 37 ° C por 3 – 4 min e transferir a suspensão de eritrócitos em 37 ° C pré-aquecido α-MEM (sem suplemento de hormônio). Por centrifugação, recomenda-se um volume final de 10 mL.
- Centrifugue o GC para 3 min à temperatura ambiente e a x 500 g. Desprezar o sobrenadante. Adicione o α-MEM pré-aquecido e completado e ressuspender as células com cuidado.
- Semente do GC em uma densidade de 1 x 105 ou 1 x 106 células por poço em um volume final de 500 µ l. incluem técnicas repetições pelo menos três poços de cultura por condição.
- Incube a cultura de células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 para 8D.
- Realize um intercâmbio de mídia todos os dias. Substitua somente dois terços da cultura mídia para reduzir o stress e para facilitar a adaptação das células para a nova mídia.
Nota: O GC formam um fenótipo típico de fibroblasto, como depois de alguns dias na cultura e tendem a aglomerar-se juntos. Na cultura de pilha alta-densidade, clusters maiores são encontradas mais frequentemente em comparação com a cultura de densidade normal GC (Figura 1, esquerda vs direita painel).
6. posterior análise das células da Granulosa cultivadas
- Para realizar a análise de hormônio esteroide, recolher os meios de comunicação e congelá-lo a-20 ° C. Use métodos adequados para analisar a concentração de estradiol e progesterona na mídia passou [por exemplo, radioimunoensaio (RIA)]14.
- Para posterior análise das moléculas-alvo diferentes (RNA, DNA, proteínas, etc.), lyse as pilhas diretamente no prato cultura com um agente lysing apropriado, como recomendado pelo fornecedor.
Nota: Para a maioria dos procedimentos de isolamento, é possível parar o protocolo aqui, como as células lisadas podem ser armazenadas a-20 ° C por até 1 semana. Para uma conservação mais longa, as células devem ser mantidas a-80 ° C. - Para determinar a abundância de transcrição, sintetizar o cDNA e medir específicos transcritos pela polimerase em tempo real quantitativa de técnicas de reação em cadeia (qPCR)15. Uma avaliação estatística deve incluir pelo menos três repetições de culturas de células diferentes, originadas-se preparações diferentes células (Replica biológica).
Representative Results
GC chapeado em 1 x 105 células/poço exibir uma aparência típica do fibroblasto como eles formam uma extensão de célula comparável aos fibroblastos e tendem a construir clusters (Figura 1a e 1C). Aumento da densidade de chapeamento de 10-fold a 1 x 106 células/poço não alterou a morfologia mas mais agrupamentos de células podem ser observados (Figura 1b e 1D, setas). Como já mostrado em uma publicação anterior, o revestimento de colágeno dos pratos cultura largamente melhorada a fixação das células13.
Criopreservação inicial não alterou consideravelmente as características fisiológicas das células em cultura em comparação com aqueles cultivados diretamente de amostras recém isoladas. Isso é mostrado na Figura 2 como a abundância de transcrição (medida por qPCR) do marcador de vários genes não diferiram quando comparar culturas de células derivadas de piscinas ou congeladas ou fresco isoladas.
A Figura 3 mostra resultados representativos da análise hormônio esteroide (medido pela RIA) em bovino GC cultivada em normal vs high-density. A concentração de estradiol é significativamente diminuída na cultura de alta densidade, em comparação com a cultura de densidade normal, Considerando que a produção de progesterona tendia a ser mais elevado.
Uma análise comparativa de vários genes (medido por qPCR) em alta - vs normal-densidade culturas revelou um efeito significativo (Figura 4). CYP19A1, a enzima chave da aromatase de biossíntese de estradiol, bem como o receptor de gonadotrofinas FSHR, de codificação foram significativamente para baixo-regulado. Em contraste, os genes RGS2 e VNN2 mostraram uma significativa regulação. Estes resultados sugerem claramente que processos específicos de diferenciação celular são induzidos, aumentando a célula chapeamento densidade.
Figura 1: culta células granulosa bovinas em normal (painéis à esquerda) e célula de alta densidade (painéis de certo). Células (a e c), cultivadas em uma densidade de 1 x 105 células/poço exibido um fenótipo típico de fibroblasto tipo. (b e d) GC, cultivada em uma chapeamento de alta densidade (1 x 106 células/poço) tendida a formar grupos de grandes células (setas) com mais frequência em comparação com células sob uma densidade normal (painel esquerdo). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: comparação das células cultivadas diretamente após isolamento e criopreservação. As células foram cultivadas em uma densidade de 1 x 105 células por poço. A expressão do gene de diversas transcrições do marcador foi avaliada e não revelou nenhuma diferença entre células cultivadas com ou sem uma criopreservação inicial. O boxplot mostra a mediana do n = 3. De Student bicaudal t-testar, o p-valores são incluídos. Esta figura é reproduzida de Baufeld e Vicente16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: concentração de hormônio esteroide nas células da granulosa cultivadas no chapeamento de diferentes densidades. A concentração de estradiol (E2) diminuiu significativamente quando o GC foram cultivadas em uma densidade de pilha alta, Considerando que a concentração de progesterona (P4) só tende a ser mais elevado. A concentração de hormônio foi corrigida para o conteúdo de DNA normalizar para números de telemóvel diferentes. A média e SEM de n = 3 são mostrados. p > 0,05, do Student bicaudal t-teste. Esta figura é reproduzida de Baufeld et al 15. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Abundância de transcrições chaves funcionais nas células da granulosa cultivadas em um normal vs uma chapeamento de alta densidade. GC bovina cultivada em condições de livre de soro para 8D revelou um regulamento específico de vários genes de marcador selecionado. O boxplot exibe a mediana do n = 3 repetições individuais. p < 0.05, do Student bicaudal t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O modelo de cultura celular apresentado fornece uma ferramenta para analisar granulosa de diferenciação de células in vitro. Vários estudos mostraram que um cultivo livre de soro é um pré-requisito para manter a actividade esteroide em GC bovina cultivada ou GC de outras espécies de8,9. Além disso, revestindo o prato de cultura com componentes da matriz extracelular (por exemplo, colágeno R)13, melhorou significativamente a fixação das células. Outra característica importante é o período da cultura prolongada. Recentemente, foi demonstrado que uma cultura de longo prazo é necessária para obter suficiente atividade esteroidogênica e uma expressão equilibrada de17marcadores identidade do célula da granulosa. Parece que o GC requer o tempo para se recuperar do stress físico durante o procedimento de isolamento.
Os suplementos de mídia FSH, IGF-1 e androstenediona são conhecidos por induzir a atividade de aromatase no culto GC. Especialmente, a suplementação com androstenediona é absolutamente necessária, como o GC de um precursor para a síntese de estradiol. Isto tem sido anteriormente publicado11,18 e, portanto, não foi ainda mais investigado durante o presente estudo. No entanto, uma adaptação do FSH, IGF-1 e concentrações de androstenediona pode ser necessária para outras instalações experimentais.
A técnica de criopreservação descrita aqui pode ajudar a melhorar a organização de experiências de cultura de tecidos, tornando-os mais independentes da fonte de variação com ovários. De acordo com o teste anterior, criopreservação não afecta o fenótipo de GC ou a produção de esteroides na cultura. Além disso, a abundância de transcrições de marcador em pilhas cultivadas não revelaram diferenças significativas comparando amostras preparadas a partir de células recém isoladas com aqueles anteriormente submetido a criopreservação16.
Um parâmetro fundamental para o presente modelo de cultura de GC é a célula do chapeamento densidade. Como indicado pelos Resultados do representante, aumentando a densidade de chapeamento induzido mudanças notáveis características fisiológicas e moleculares. Vários genes são regulados de maneira específica, assemelhando-se as alterações que são induzidas por estimulação de LH na vivo4,19. O fato de que uma densidade crescente de célula pode conduzir processos de diferenciação, como em GC bovina cultivada deve ser considerado meticulosamente neste modelo in vitro de GC para evitar resultados conflitantes entre repetições. Portanto, resultados contraditórios com outros estudos podem ser atribuídos a densidades de célula diferente e devem ser examinados mais de perto.
O modelo de cultura descrito aqui se revelou para ser não-responsivos ao LH, como as transcrições do receptor LHCGR aproximam-se o limite de detecção. Daí, uma simulação do aumento de LH igual a situação na vivo falhou induzir a diferenciação de13. No entanto, este modelo fornece uma ferramenta útil para estudar o GC de estradiol-ativo em cultura primária, actualmente existem linhas de GC bovina em particular como não funcionais.
Protocolos de tratamento diferentes podem ser testados no presente modelo de cultura GC que ajudam a desvendar os mecanismos reguladores da produção de esteroides ou diferenciação de GC. Além disso, a única de fatores que estão envolvidos em processos de desenvolvimento podem ser analisados separadamente. Portanto, este modelo de cultura fornece uma base para muitas aplicações diferentes.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Veronica Schreiter por sua assistência técnica excelente e útil modificações do modelo de cultura de técnica e célula de criopreservação estabelecida. Além disso, nós gostamos de Maren Anders e Swanhild Rodewald agradecer sua excelente assistência técnica na análise subsequente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| amphotericin (250 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| 3 mL syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
| 18 G needle | Roth | C724.1 | |
| fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| cryo-preservation vials (2 mL) | TPP Faust | TPP 89020 | |
| CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
| culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
| collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
| transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
| insulin (10 mg/mL) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA |
| androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |
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