En langsigtet kultur model af kvæg granulosa-celler serumfrit betingelser er beskrevet. Denne model gør det muligt for forskere at studere virkningerne af forskellige faktorer og betingelser som forskellige plating tætheder på karakteristika ved produktion af østrogen bovin granulosa-celler.
Æggestokkene granulosa celler (GC) er den største kilde til estradiol syntese. Induceret af preovulatory luteiniserende hormon (LH) bølge, celler i theca og navnlig granulosa cellelag dybt ændre deres morfologiske, fysiologiske og molekylære karakteristika og danner progesteron-producerende corpus luteum, der er ansvarlig for at opretholde graviditeten. Celle kultur modeller er væsentlige værktøjer til at studere de underliggende lovgivningsmæssige mekanismer involveret i de folliculo-luteal transformation. Præsenteres protokollen fokuserer på isolation procedure og kryopræservering af kvæg GC fra små til mellemstore follikler (< 6 mm). Med denne teknik, kan en næsten ren population af GC opnås. Kryopræservering procedure i høj grad letter tid forvaltning af cellekultur arbejde uafhængigt af en direkte primære væv (æggestokke) levering. Denne protokol beskriver et serumfrit celle kultur model, der efterligner østradiol-aktiv status for kvæg GC. Vigtige betingelser, der er væsentlige for en vellykket steroid-aktive cellekultur er diskuteret i hele protokollen. Det er påvist, at øge plating tæthed af celler inducerer et specifikt svar som angivet af en ændret gen expression profil og hormon produktion. Endvidere, denne model giver et grundlag for yderligere undersøgelser af GC differentiering og andre programmer.
Vellykket ægløsning og luteinization afhænger af fint tunet og veltilrettelagt molekylære ændringer i forskellige somatiske follikulært celletyper. Da oplysninger om disse udviklingsmæssige processer ikke er endnu fuldt forstået, yderligere er afklaring påkrævet. In vivo tilgange er omfattende og kostbare og navnlig undlader at adresse specifikke molekylære mekanismer, der opstår under folliculogenesis. Derfor for reductionistic in vitro- modeller derudover at give indsigt i cellulære og molekylære detaljer. Forskellige undersøgelser beskrive kulturen i hele follikler i forbindelse med in vitro- befrugtning teknikker1,2,3. Fordi forskere er interesseret i mekanismer af differentiering, fokuserer mange undersøgelser på follikulært GC. Disse celler, direkte tilknyttet oocyt, er de vigtigste kilder til østrogen produktion og således spille en vigtig rolle i hele folliculogenesis og luteinization4.
Udødeliggjort celle linjer af GC er blevet udviklet fra forskellige arter. De fleste af dem, viser imidlertid ikke en tilstrækkelig steroid hormon produktion5. Hidtil har kun én cellelinje af kvæg GC har været etableret6, men denne linje mistede sin steroidogene aktivitet efter flere passager7. Derfor, siden steroidogenesis og især estradiol produktion er et væsentligt træk ved GC funktionalitet, er det tilrådeligt at studere disse aspekter i primære celle kultur modeller. I tidligere undersøgelser, blev det påvist, at en betydelig estradiol produktion kun kan overholdes under serumfrit kultur betingelser8,9. Videre er på, tilskud af en forløber for estradiol syntese en anden betingelse, som GC undlader at give udtryk for det nødvendige enzym, der kan konvertere progesteron til androstenedion10. Derudover afslørede de synergiske virkninger af FSH og IGF-1 tilskud i vitro en optimeret aktivitet af aromatase, det vigtigste enzym af estradiol syntese11. I denne protokol, er andre vigtige faktorer, der har en væsentlig indvirkning på GC kultur model også beskrevet. Navnlig har cellen plating tæthed kolossal indvirkning på resultatet af eksperimentet12. Derudover kunne en kryopræservering teknik af kvæg GC, der ikke griber væsentligt med GC fysiologi i kultur oprettes. Denne teknik hjælper med at forbedre tilrettelæggelsen af celle kultur arbejdet og til at optimere den foretrukne plating tæthed.
Præsenteres celle kultur model giver et værktøj til at analysere granulosa celle differentiering in vitro. Flere undersøgelser viste, at et serumfrit dyrkning er en forudsætning for at opretholde steroid aktivitet i kulturperler bovin GC eller GC af andre arter8,9. Derudover forbedret belægning kultur fadet med komponenter i den ekstracellulære matrix (fx, kollagen R)13, udlæg i cellerne betydeligt. Et andet vigtigt element er perioden forlænget kultur. For nylig er blevet påvist, at en langsigtet kultur er nødvendig for at opnå tilstrækkelig steroidogene aktivitet og en afbalanceret udtryk for granulosa celle identitet markører17. Det vises, at GC kræver tid til at inddrive fra den fysiske stress under proceduren isolation.
Medier kosttilskud FSH, IGF-1 og androstenedion er kendt for at inducere aromatase aktivitet i kulturperler GC. Især, tilskud af androstenedion er absolut nødvendige, som GC har brug for en forløber for estradiol syntese. Dette har været offentliggjort tidligere11,18 , og derfor var ikke yderligere undersøgt under den foreliggende undersøgelse. En tilpasning af FSH, IGF-1 og androstenedion koncentrationer kan dog være nødvendigt for andre eksperimentelle set-ups.
Kryopræservering teknik beskrevet her kan bidrage til at forbedre tilrettelæggelsen af vævskultur eksperimenter ved at gøre dem mere uafhængige af varierende levering med æggestokke. Ifølge tidligere test, påvirker kryopræservering ikke GC fænotype eller steroid produktion i kultur. Også, overfloden af markør udskrifter i kulturperler celler afslørede ikke betydelige forskelle sammenligne prøver fremstillet af frisk isolerede celler med dem tidligere udsat for kryopræservering16.
En afgørende parameter for den nuværende GC kultur model er den celle plating tæthed. Som det fremgår af Repræsentative resultater, induceret øge plating tæthed bemærkelsesværdige ændringer af fysiologiske og molekylære karakteristika. Flere gener er reguleret på en bestemt måde, der ligner de ændringer, der er fremkaldt af LH stimulation i vivo4,19. Den omstændighed, at en stigende celle tæthed kan drive differentiering-lignende processer i kulturperler bovin GC har overvejes grundigt i denne GC i vitro model at undgå modstridende resultater mellem replikater. Derfor, modstridende resultater med andre undersøgelser kan tilskrives forskellige celle tætheder og bør undersøges nærmere.
Kultur model beskrevet her viste sig for at være ikke-lydhøre over for LH, som udskrifter af receptor LHCGR er tæt på detektionsgrænsen. Derfor, en simulering af LH surge både i vivo situation mislykkedes at inducere differentiering13. Ikke desto mindre, denne model giver et nyttigt værktøj for at studere østradiol-aktive GC i primære kultur, især som ikke funktionelle bovin GC linjer findes på nuværende tidspunkt.
Forskellige behandling protokoller kan afprøves i den nuværende GC kultur model, der medvirker til at optrævle reguleringsmekanismer steroid produktion eller GC differentiering. Yderligere, fælles faktorer, der er involveret i udviklingsprocesser kan analyseres særskilt. Derfor, denne kultur model giver grundlag for mange forskellige applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Veronica Schreiter for hendes fremragende teknisk bistand og nyttige ændringer af de etablerede kryopræservering teknik og celle kultur model. Derudover vil vi gerne takke Maren Anders og Swanhild Rodewald for deres fremragende teknisk bistand i den efterfølgende analyse.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |