無血清条件下でウシ顆粒膜細胞の長期培養モデルを説明します。このモデルにより、エストロゲン産生特性の異なるめっき密度として多様な因子と条件の効果を研究に研究をウシ顆粒膜細胞。
卵巣顆粒膜細胞 (GC) は、エストラジ オールの合成の主要なソースです。排卵黄体形成ホルモン (LH) のサージによって誘導される細胞、莢の特に、顆粒膜細胞層の深く、形態学的、生理学的、および分子の特性を変更し、プロゲステロン生産コーパスを形成黄体は妊娠を維持するために責任があります。細胞モデルは、濾胞黄体の変換に関与する基になる機構を研究する重要なツールです。提案するプロトコルは中規模包 (< 6 mm) から牛の GC の凍結と分離のプロシージャに焦点を当てください。この手法では、GC のほぼ純粋な人口を取得できます。凍結保存プロシージャ大幅に細胞培養の管理は直接プライマリ組織 (卵巣) 供給の独立して動作時間を容易します。このプロトコルでは、ウシの GC のエストラジ オール アクティブ状態を模した無血清細胞培養モデルについて説明します。成功したステロイド アクティブ培養に欠かせない重要な条件は、プロトコルを通して説明します。変更された遺伝子の発現プロファイルとホルモン生産によって示されているように、セルのメッキ密度の増加に特定の応答を誘導することを示した。さらに、このモデルは、GC の分化に関するさらなる研究のための基礎および他のアプリケーションに提供します。
成功した排卵と黄体は、細かく調整・うまく仕組まれた分子変異が別体濾胞細胞の種類によって異なります。これらの発達のプロセスの詳細はまだ完全に理解されない、さらに明確化が必要です。生体内でのアプローチは手の込んだ、高価な、特に、アドレス特定の分子機構卵胞発育中に発生する失敗します。したがって、ベイストの in vitroモデルはさらに、細胞と分子の詳細洞察力を提供するために必要です。さまざまな研究では、体外受精技術1,2,3のコンテキスト内の全体の卵胞の文化について説明します。研究者は分化のメカニズムに興味があるので、多くの研究卵胞 GC に焦点を当てます。卵子に直接関連付けられているこれらの細胞はエストロゲン産生の主要な源であるし、したがって、卵胞発育と黄体化4全体で重要な役割を果たします。
GC の行は、異なる種から開発されている細胞を不死化。しかし、それらのほとんどは十分なステロイド ホルモン生産5を表示されません。これまでのところ、GC がされているウシの 1 つだけセルライン確立6が、この行はいくつかの通路7後ステロイド産生活性を失った。したがって、以来ステロイド生合成機能や、特定のエストラジ オール産生が GC 機能の基本的な特徴、一次電池文化モデルのこれらの面を研究することをお勧めします。以前の研究でかなりのエストラジ オール産生できますのみ無血清培養条件8,9の下で観察されることを示した。さらに、エストラジ オールの合成の前駆体の補充は、別の前提条件 GC 失敗アンドロステンジオン10にプロゲステロンを変換することができます必要な酵素を表現します。また、FSH と IGF-1 補充の in vitroの相乗効果は、エストラジ オール合成11の鍵酵素アロマターゼの最適化活動を明らかにしました。この議定書で GC 文化モデルの相当な影響がある他の重要な要因についても述べる。特に、密度をめっきセルには、実験12の結果に途方もない効果があります。さらに、文化の GC の生理学と大幅に干渉しない牛の GC の凍結保存技術が確立でした。細胞文化仕事の組織を改善するために、最寄りのメッキ密度を最適化するために、このテクニックが役立ちます。
提示された細胞培養モデルは、顆粒膜細胞分化体外を分析するためのツールを提供します。いくつかの研究は、無血清培養ある培養ウシ GC または他種8,9GC でステロイドの活動を維持するための前提条件であることを示した。さらに、細胞外基質 (例えばコラーゲン R)13のコンポーネントと培養皿をコーティング、細胞の付着が大幅に改善。もう一つの重要な特徴は、長期培養期間です。最近では、長期培養は充分なステロイド ホルモン産生活性と顆粒膜細胞アイデンティティ マーカー17のバランス式を取得する必要があるれています。それは GC が分離のプロシージャの間に物理的なストレスから回復する時間を必要と表示されます。
FSH、IGF-1、アンドロステンジオンはアロマターゼ活性を誘導するために知られているメディアのサプリメントは、GC を培養しました。特に、アンドロステンジオンと補給が絶対に必要、GC として必要があります前駆体エストラジ オール合成。これはずっと以前11,18を公開し、したがって、さらに検討されなかった本研究中。ただし、FSH、IGF-1、アンドロステンジオン濃度の適応その他の実験のセットアップの必要があります。
ここで説明した凍結技術は複数の卵巣が付いているさまざまな供給から独立したことで組織培養実験の組織を改善するために助けることができます。以前テストによると凍結は GC 表現型またはステロイド生産文化を影響しません。また、培養細胞のマーカーの転写物の豊かさは、以前凍結16を受けると新鮮単離細胞から調製したサンプルを比較差を明らかにしなかった。
現在の GC 文化モデルの重要なパラメーターは、密度をめっきセルです。代表結果で示すように、生理学的・分子的特性の顕著な変化を誘発メッキ密度を増加させます。いくつかの遺伝子は、4,19 vivo にLH の刺激によって誘導される変化と類似した特定の方法で調整されます。セル密度の上昇が培養ウシ GC で差別化のようなプロセスを運転できるという事実は複製間の矛盾した結果を避けるために細心の注意この GCの in vitroモデルで考慮します。したがって、他の研究と矛盾する結果は異なるセル密度に起因するかもしれないより綿密に検証する必要があります。
文化モデル記述されているここで LH に対応することを明らかにした受容体LHCGRの成績としては検出限界の近くにあります。したがって、同様の LH サージのシミュレーション体内状況は13分化を誘導するために失敗しました。それにもかかわらず、このモデルは、初代培養におけるエストラジ オール アクティブ GC の研究に有用なツールを提供します、特にとして機能的なウシ GC ラインが現時点では存在します。
ステロイド生産または GC の分化の調節機構を解明するのに役立ちます現在の GC 文化モデルでは、異なる治療プロトコルをテストできます。発達過程に関与しているさらに、単一の要因は個別に分析できます。したがって、この文化モデルは、多くの異なるアプリケーションのための基礎を提供します。
The authors have nothing to disclose.
ベロニカの Schreiter は、彼女の優秀なテクニカル サポートと確立された凍結保存技術と細胞培養モデルの有用な変更を感謝いたします。さらに、我々 はその後の分析で、優れたテクニカル サポート マレン アンダースと Swanhild よればを感謝したいと思います。
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |