En tandem RNA isolasjon prosedyre (tur) for utvinning av endogenously dannet mRNA protein komplekser er beskrevet. Spesielt RNA-protein komplekser er krysskoblet i vivo, polyadenylated RNAs er isolert fra ekstrakter med oligo(dT) perler og bestemte mRNAs er tatt med endrede RNA antisense oligonucleotides. Proteiner bundet til mRNAs gjenkjennes av immunoblot analyse.
RNA-bindende proteiner (RBPs) spiller nøkkelroller i kontrollen post-transcriptional av genuttrykk. Derfor er biokjemiske karakteristikk av mRNA protein komplekser nødvendig for å forstå mRNA regulering utledes ved samspill proteiner eller ikke-koding RNAs. Her beskriver vi en tandem RNA isolasjon prosedyre (tur) som gjør rensing av endogenously dannet mRNA protein komplekser fra mobilnettet ekstrakter. I two-step protokollen omfatter isolering av polyadenylated mRNAs med antisense oligo(dT) perler og påfølgende erobringen av en mRNA rundt med 3-biotinylated 2-O-denaturert antisense RNA oligonucleotides, som deretter kan være isolert med streptavidin perler. TUREN ble brukt til å gjenopprette i vivo krysskoblet mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) komplekser fra gjær og nematoder menneskelige celler for videre RNA og protein analyse. Dermed er tur en allsidig tilnærming som kan tilpasses til alle typer polyadenylated RNAs over organismer å studere dynamisk nytt arrangement av mRNPs pålagt av intracellulær eller miljømessige signaler.
Post-transcriptional gene regulering drives gjennom samspillet mellom RNA-bindende proteiner (RBPs) ikke-RNAs (ncRNAs) og mRNAs, som direkte behandling, lokalisering, oversettelse og forfallet av hver utskrift i celler1 , 2. identifikasjon av RBPs og ncRNA samspill med bestemte mRNAs, etablere det som kalles ribonucleoprotein komplekser/partikler (RNPs), er derfor nøkkelen til å forstå skjebnen til mRNAs og gene expression kontroll. Supplerende tiltak er gjennomført for biokjemiske karakterisering av RNP komplekser3,4: mens “protein-sentrisk” tilnærmingen er basert på rensing av spesifikke RBPs, “RNA-sentrisk” tilnærmingen innebærer den isolering av subpopulasjoner eller personlige RNAs og påfølgende analyse av samspill proteiner eller RNAs. Nylig en RNA-tilnærming til å identifisere RBP repertoaret samspill med polyadenylated (poly(A)) RNAs5 har blitt stadig mer populært ved å innlemme en ultrafiolett (UV) lys crosslinking skritt for å stabilisere protein-RNA interaksjoner før isolering av mRNAs, som dramatisk utvidet katalogen RBPs i menneskeceller6,7,8,9,10,11, Caenorhabditis elegans 12og saccharomyces cerevisiae12,13,14andre organismer15,16,17,18, 19,20. Tilordningen av proteiner og/eller ncRNAs montert på bestemt transkripsjoner er imidlertid fortsatt en stor utfordring. Dette brukes for tiden to hovedfremgangsmåter: på den ene siden, RNA aptamer koder er smeltet til RNA rundt aktivere affinitet rensing. Dermed binde RNA aptamers med høy affinitet aminoglycoside antibiotika inkludert tobramycin og streptomycin21,22,23,24eller for pels protein fra den R17/MS2 bacteriophage eller bakteriell streptavidin S1,25,,26,,27,,28,,29. Selv om denne tilnærmingen viste seg å være relativt robust og allsidig, det krever kloning design av RNA under etterforskning, og dermed kan ikke brukes til å fange naturlig mRNAs. På den annen side, antisense oligonucleotides (ASOs) ble brukt tidlig for gjenvinning og karakterisering av svært uttrykt innfødt RNPs30,31 og viral RNAs32. Flere nylig, ASOs ble brukt til å fange lang ikke koding RNAs33,34,35 og i vitro dannet mRNPs36. En større begrensende faktor med alle RNA sentriske tilnærminger er kopien antall RNA av interesse, noe som gjør utvinning av lav-uttrykt mRNAs mer problematisk. Denne begrensningen kan overvinnes ved oppskalering reaksjonen; Dette kan imidlertid føre til øke bakgrunnen.
Her beskriver vi vår nylig utviklede ASO-baserte tandem RNA isolasjon prosedyre (tur) for å isolere innfødt mRNA protein komplekser med høy selektivitet37 (figur 1). Protokollen inneholder to sammenhengende ASO-baserte rensing trinn, nemlig isolering av poly(A) mRNAs med kommersielt tilgjengelig oligo(dT) kombinert perler etterfulgt av fangst av bestemte mRNAs bruker spesielt utformet kort biotinylated 2-methoxy RNA ASOs. Denne to-trinns fremgangsmåten hjelper eliminere skadelige proteiner og gir muligheter for tilpasning og optimalisering. I dette tilfellet tur ble installert på valgte mRNAs gjær, nematoder, og menneskelige celler å bekrefte i vivo dannet mRNA protein komplekser.
TUR tillater analyse av proteiner bundet til bestemte mRNAs i vivo med biokjemiske betyr. Mens vi har brukt metoden for å validere samspillet av bestemt RBPs med mRNA mål fra andre organismer/celler, kan turen også være aktuelt å studere andre typer poly(A) RNAs, som cytoplasmatiske lang ncRNAs. Videre oppnås systematisk analyse av bundet proteiner og/eller RNAs med MS eller RNA sekvensering ved en opp-skalering av prosedyren. I denne forbindelse indikerer våre foreløpige data at 1 L gjær kulturer og minst 100 millioner av HEK293 menneskeceller kunne gi tilstrekkelig starter materiale for å få pålitelige MS data for godt uttrykt mRNAs (upublisert resultater).
Beskrevet tur protokollen inneholder bestråling av celler med UV-lys på 254 nm til krysskobling RNA-protein interaksjoner. Dette gjør gjennomføringen av strenge vask under renselsen. Likevel, selv om ikke eksplisitt testet, ønsker vi å crosslinking er valgfritt og aktive RNPs kan også gjenopprettes med fysiologiske buffere. Men i dette tilfellet bør potensielle nytt arrangement av proteiner og eller RNAs på målet RNA i lysates tas i betraktning. Omvendt, hvis UV eller andre crosslinking prosedyrer er anvendt (f.eksformaldehyd), integriteten av det bør vurderes som RNA fornedrelse kan føre til redusert utvinning av mRNPs. Dessuten UV-crosslinking er ganske ineffektivt (~ 5%) og enda mindre for proteiner samarbeidsstil double-strandet RNA, som kunne introdusere bias for påvisning av visse klasser av RBPs12. Til slutt, UV bestråling kan også indusere protein-protein og protein-DNA krysskoblinger som bør vurderes for data tolkning45,46. Derfor kan alternativ crosslinking prosedyrer, for eksempel med formaldehyd, også være av spesiell interesse å fange større protein samlinger på mRNAs.
En viktig funksjon av turen er i two-step ASO-baserte rensing prosedyren for å gjenopprette bestemt RNAs, og dermed øke selektivitet og redusere sannsynligheten for rensing co forurensninger. For eksempel, gjelder en bekymring legge biotinylated ASOs direkte til cellen ekstrakter, som kan føre til co rensing av biotin bindende proteiner. Dette er circumvented i tur ved å implementere en første runde med rensing av poly(A) RNAs med covalently kombinert oligo-(dT)25 magnetiske perler, hvilke innrømmer for strenge rensing forhold som RNA-protein interactome fange. Videre poly(A) RNA utvalg fjerner svært rike ncRNAs, for eksempel ribosomal RNAs og tRNAs, og dermed reduserer kompleksiteten i eksempelet og potensielle kilder for kryss-hybridisering og forurensning. I det andre trinnet, bestemt mRNAs gjenopprettes med biotinylated og endret ASOs som anneal med områder på mRNA målene. Eventuelt kan endrede ASOs også være direkte covalently knyttet til magnetiske perler via et Amin-linker, redusere tilbøyelighet til å fange biotin bindende proteiner. Men i vår erfaring gjenopprettet inkubasjonstiden for poly(A) RNA brøken med ASOs før tilsetning av streptavidin perler mRNPs mer effektivt enn direkte tillegg av ASO-kombinert perler. Gratis oligos er muligens kinetically favoriserte bedre tilgang til sekvenser i strukturerte RNA i forhold til immobilisert oligos. Derfor kovalente koblingen av ASOs til perler før inkubering med prøven kan være skadelig for utvinning av RNA målet og må testes empirisk.
En ulempe med ASO basert metoder er ineffektiv utvinning av noen målet mRNAs. Vi anbefaler derfor evalueringen av flere ASOs som anneal til forskjellige regioner i transkripsjon. Spesielt foreslår vi utformingen av 2-3 ASOs som anneal med sekvenser i 3-UTR eller CDS av mRNA rundt. Hver ASO kan ha en annen effektivitet for gjenvinning av respektive mRNA målet og bør være empirisk testet (figur 2A, B, data ikke vist). På slutten fant vi at ASOs annealing til 3 UTRs utføres bedre sammenlignet med de annealing til CDer. Dette kan skyldes økt tilgjengelighet av bindende områder i UTRs på grunn av fravær av oversette ribosomer, mens ribosomer kan hindre effektiv hybridisering i CDer. Vi har også opplevd at kombinasjonen av flere ASOs kan føre til økt forurensning fra rikelig ikke mål mRNAs og redusert rullegardin effektivitet. I alle fall selektivitet av den valgte oligos styres av konkurransen eksperimenter (f.eks., tillegg av konkurrerende oligos).
Ytterligere bekymring er knyttet til potensielle kryss-hybridisering med urelaterte RNAs, som observerte vi at selv delvis hybridisering med andre mRNAs kan føre til utvinning av at mRNA (figur 2C). For å vurdere hensiktsmessigheten av de designet ASOs, anbefaler vi derfor utføre innledende i vitro testing med totalt RNAs å optimalisere saltkonsentrasjoner og vask temperatur av buffere. Vask av streptavidin-kombinert magnetiske perler i buffere som inneholder 150 mM NaCl ved 55 ° C gir best i våre hender, men vi anbefaler uavhengige tester av vilkårene for hver designet ASO. Merke, fant vi at alle ASOs valgt i vitro eksperimenter (figur 2D) var riktig for å fange den respektive mRNA mål krysskoblet celle ekstrakter (Figur 3), videre substantiating gyldigheten av på vitro testing. Foruten utformer egnet ASOs mRNA fangst, kan flere faktorer påvirke selektivitet. Derfor kan omfattende blokkerer prosedyrer med BSA og/eller tRNA i henhold til perle type spesifikasjonene hindre uspesifikke binding til perler. For ytterligere å redusere uspesifikke opptaket av proteiner, anbefaler vi også bruk av Lo-binde rør, spesielt når du arbeider med lave mengder prøver.
Vanligvis kan turen utfyller tidligere etablert tilnærminger til å fange RNAs med ASOs. For eksempel, ble ikke-koding RNA Xist isolert med bundet proteiner fra kjernefysiske ekstrakter avledet fra 200-800 millioner UV krysskoblet celler ved hjelp av en rekke lenge (90-mer) biotinylated DNA oligonucleotides som dekket hele utskrift 34,35. Imidlertid valgt fliser tilnærming kan bli problematisk i lys av det store potensialet for kryss-hybridisering med urelaterte RNAs, og den kan ikke brukes til å velge bestemte transkripsjon, f.eks., alternativt skjøtes skjemaer. Nylig utviklet låst nukleinsyre (LNA) eller DNA ASO mixmers ble covalently knyttet til en magnetisk harpiks gjenopprette i vitro transkripsjon eller svært uttrykt ribosomal RNAs fra celle-fri ekstrakter; men ble det ikke testet for gjenvinning av i vivo dannet mRNA protein komplekser36. I lys av økt anerkjennelse av post-transcriptional genet kontroll av RBPs og ncRNA tror vi at turen er en nyttig metode for å undersøke komposisjon og dynamikken i RNP komplekser i celler på intracellulær og miljømessige signaler og dens innvirkning i helse og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Dr. Jonathan Hall og Mauro Zimmermann (ETH Zürich) for syntese av PFK2 og cep-1 ASOs, Dr. Maikel Wouters for design av p27/CDKN1B ASOs og Dr. Rafal Ciosk (Friedrich Miescher Institute for biomedisinsk forskning, Basel) for anti-GLD-1 antistoffer. Dette arbeidet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BB/K009303/1) og en Royal Society Wolfson forskning Merit Award (WM170036) til A.P.G.
MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker | Thermo Fisher Scientific | SHKE5000-8CE | Floor shaker to grow yeast cells |
BBD 6220 | Thermo Fisher Scientific | CO2 incubator to grow human cells | |
Sonicator Soniprep150 | MSE | MSS150.CX4.5 | Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates |
Stratalinker 1800 | Stratagene | Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm | |
Tissue Lyser | Qiagen | RETSCH MM200 | Device to mechanically disrupt yeast cells |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge to spin down cells, lysates |
Shaking incubator, Thriller | Peqlab | Thermoshaker for 1.5 mL tubes | |
Glass beads 0.5mm | Stratech Scientific Limited | 11079105 | Lysis of yeast cells |
Nylon Filter, 0.41 μm | Millipore | NY4104700 | Collection of yeast cells |
Millex-HA Filter, 0.45 µm | EMD Millipore | SLHA02510 | Filter to clear nematode lysate |
Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22431081 | Minimise protein loss |
2 mL microfuge tube | Ambion | AM12425 | Yeast extract preparation and other applications |
5 mL tube | Thermo Fisher Scientific | 129A | Collection of HEK293 cell lysate |
15 mL tube | Sarstedt | 62.547.254 | Collection C. elegans |
50 mL plastic tube | Sarstedt | 62.554.502 | Collection yeast cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966 | Media for culturing HEK293 cells |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | Used to supplement cell culture media |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | DNAse I to degrade DNA from cell lysate |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | RNase inhibitor to avoid RNA degradation |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation |
Dynabeads Oligo (dT)25 | Thermo Fisher Scientific | 61011 | Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | 10109550001 | transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions |
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 5000205 | To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100G | Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination |
mouse anti-Act1 | MP Biomedicals | 869100 | Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500) |
mouse anti-Act1 | Sigma | A1978 | Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000) |
mouse anti-HuR | Santa Cruz | sc-5261 | Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500) |
mouse anti–CYC-1 | Invitrogen | 456100 | Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000) |
peroxidase anti-peroxidase soluble complex | Sigma | P1291 | Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000) |
HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG | Amersham | NXA931 | HRP-coupled secondary antibody |