En tandem RNA isolering (resa) för återvinning av endogent bildade mRNA-proteinkomplex beskrivs. Specifikt, RNA-proteinkomplex är tvärbundna i vivo, polyadenylated RNAs isoleras från extrakt med oligo(dT) pärlor och särskilt mRNA fångas med modifierade RNA antisense oligonukleotider. Proteiner som bunden till mRNA upptäcks av immunoblot analys.
RNA-bindande proteiner (RBPs) spelar viktiga roller för post-transcriptional kontroll av genuttryck. Biokemisk karakterisering av mRNA-proteinkomplex är därför nödvändig för att förstå mRNA förordning slutsatsen av samverkande proteiner eller icke-kodande RNAs. Häri, beskriver vi ett tandem RNA isolering förfarande (resa) som möjliggör rening av endogent bildade mRNA-proteinkomplex från cellulära extrakt. Två-stegs protokollet innebär isolering av polyadenylated mRNA med antisense oligo(dT) pärlor och efterföljande fånga en mRNA av intresse med 3′-biotinylerade 2′-O-metylerat antisense-RNA oligonukleotider, som sedan kan isoleras med streptividin pärlor. RESAN var används för att återställa i vivo tvärbundna mRNA-ribonukleoprotein (mRNP) komplex från jäst, nematoder och mänskliga celler för ytterligare RNA och protein analys. Således, resa är en mångsidig strategi som kan anpassas till alla typer av polyadenylated RNAs över organismer att studera dynamiska omflyttningen av mRNPs som införts av intracellulära eller miljömässiga Biljardköer.
Post-transcriptional genreglering drivs genom samspelet mellan RNA-bindande proteiner (RBPs), icke-kodande RNAs (ncRNAs) och mRNA, som direkt bearbetning, lokalisering, översättning och förfalla av varje avskrift inom celler1 , 2. identifiering av RBPs och ncRNA interagerar med viss mRNA, fastställa vad som kallas ribonukleoprotein komplex och partiklar (RNPs), är därför nyckeln till att förstå ödet av mRNA och gen uttryck kontroll. Kompletterande strategier genomförs för biokemisk karakterisering av RNP komplex3,4: medan den ”protein-centrerad” tillvägagångssättet bygger på rening av specifika RBPs, metoden ”RNA-centrerad” innebär den isolering av subpopulationer eller enskilda RNAs och efterföljande analys av samverkande proteiner eller RNAs. Nyligen, en RNA-centric metod för identifiering av RBP repertoaren interagerar med polyadenylated (poly(A)) RNAs5 har blivit allt populärare genom att införliva ett ultraviolett (UV) ljus crosslinking steg för att stabilisera protein-RNA interaktioner före isolering av mRNA, som dramatiskt utökade katalogen av RBPs mänskliga celler6,7,8,9,10,11, Caenorhabditis elegans 12, saccharomyces cerevisiae12,13,14och andra organismer15,16,17,18, 19,20. Kartläggning av proteiner eller ncRNAs monterade på viss avskrifter är dock fortfarande en stor utmaning. För detta ändamål används för närvarande två huvudsakliga metoder: dels, RNA aptamer taggar är smält till RNA av intresse att möjliggöra affinitet rening. Därmed, binder de RNA aptamers med hög affinitet aminoglykosidantibiotika inklusive tobramycin och streptomycin21,22,23,24eller proteiner, såsom proteinet coat från den R17/MS2 bacteriophage eller bakteriell streptividin S125,26,27,28,29. Även om denna strategi visade sig vara relativt robust och mångsidig, det kräver kloning att designa RNA under utredning, och således inte kan användas för att fånga naturliga mRNA. Däremot, antisense oligonukleotider (ASOs) användes tidigt för återhämtning och karakterisering av starkt uttryckt infödda RNPs30,31 och viral RNAs32. Mer nyligen, ASOs tillämpades för att fånga länge icke kodande RNAs33,34,35 och in vitro- bildade mRNPs36. En stor begränsande faktor med alla RNA centrerad tillvägagångssätt är kopia antalet RNA av intresse, att göra återhämtningen av låg-uttryckta mRNA mer problematiska. Denna begränsning kan övervinnas genom uppskalning biverkningen. emellertid, detta kan potentiellt leda till ökande bakgrunden.
Häri, beskriver vi vår nyutvecklade ASO-baserade tandem RNA isolering förfarande (resa) att isolera infödda mRNA-proteinkomplex med hög selektivitet37 (figur 1),. Protokollet innebär två sekventiella ASO-baserade reningssteg, nämligen isoleringen av poly(A) mRNA med kommersiellt tillgängliga oligo(dT) tillsammans pärlor följt av upptagning av specifika mRNA använder specifikt designade kort biotinylerade 2′-metoxi RNA ASOs. Detta tvåstegsförfarande hjälper till att eliminera kontaminerande proteiner och ger möjligheter för justering och optimering. I detta fall resa tillämpades på valda mRNA från jäst, nematoder, och mänskliga celler att bekräfta i vivo bildade mRNA-proteinkomplex.
RESA tillåter analys av proteiner bunden till specifika mRNA i vivo med biokemiska metoder. Medan vi har använt metoden för att validera särskilt RBPs interaktion med mRNA mål från olika organismer/celler, kan resa också vara tillämplig att studera andra typer av poly(A) RNAs, såsom cytoplasmiska lång ncRNAs. Systematisk analys av bundna proteiner eller RNAs med MS eller RNA-sekvensering kan dessutom uppnås en upp-skalning av förfarandet. I detta avseende indikerar våra preliminära data att 1 L av jäst kulturer och minst 100 miljoner av mänskliga HEK293 celler skulle kunna ge tillräcklig utgångsmaterial för att erhålla tillförlitliga MS data för väl uttryckta mRNA (opublicerade resultat).
Protokollet beskrivs resa inkluderar bestrålning av celler med UV-ljus vid 254 nm till crosslink RNA-protein interaktioner. Detta möjliggör genomförandet av stränga tvätta villkor under reningen. Även inte uttryckligen testas, vill vi dock notera att crosslinking är valfritt och aktiva RNPs kan också återvinnas med fysiologiska buffertar. Dock i detta fall bör potentiella omflyttningen av proteiner och eller RNAs på målet RNA i lysates beaktas. Omvänt, om UV eller andra crosslinking förfaranden tillämpas (t.ex., formaldehyd), integriteten hos RNA bör utvärderas som RNA nedbrytning kan leda till minskade mRNPs. Dessutom UV-crosslinking är ganska ineffektiva (~ 5%) och ännu mindre för proteiner interagerar med dubbelsträngat RNA, som kunde införa bias för detektion av vissa klasser av RBPs12. Slutligen, UV-bestrålning kan också inducera protein-protein och protein-DNA antipyridinantikropp som bör övervägas för data tolkning45,46. Därför kan alternativa crosslinking förfaranden, till exempel med formaldehyd, också vara av särskilt intresse att fånga större protein aggregat på mRNA.
En viktig del av resan är den två-stegs ASO-baserade rening förfarande att återvinna särskilt RNAs, därigenom öka selektiviteten och minskar sannolikheten för samtidig renande föroreningar. Exempelvis avser ett bekymmer att lägga biotinylerade ASOs direkt till cell extrakt, vilket kan leda till samtidig rening av biotin-bindande proteiner. Detta är kringgås i resa genom att genomföra en första omgång av rening av poly(A) RNAs använder kovalent kopplat oligo-(dT)25 magnetiska pärlor, vilket möjliggör stränga rening villkor som gjort för RNA-protein interactome fånga. Dessutom poly(A) RNA urval tar bort mycket rikliga ncRNAs, såsom ribosomalt RNA och tRNAs, och därför minskar komplexiteten i provet och potentiella källor för cross-hybridisering och kontaminering. I det andra steget, särskilt mRNA återvinns med biotinylerade och modifierade ASOs som glödga med regioner på mRNA mål. Alternativt, modifierade ASOs kunde också direkt kovalent bifogas magnetiska pärlor via en amine-linker, minska benägenheten att fånga biotin bindande proteiner. Men vår erfarenhet inkubering av poly(A) RNA andelen med ASOs före tillsats av streptividin pärlor återhämtade sig mRNPs mer effektivt än direkta tillsats av ASO-kopplade pärlor. Möjligen, gratis oligos kinetiskt gynnas bättre tillgång till sekvenser i strukturerade RNA jämfört med immobiliserade oligos. Därför kovalent kopplingen av ASOs till pärlor innan inkubering med provet kan vara skadliga för återvinning av RNA målet och har testas empiriskt.
En nackdel med ASO baserade metoder är ineffektiv uppbörd av vissa mål mRNA. Vi rekommenderar därför utvärdering av flera ASOs som glödga till olika regioner i avskriften. Specifikt, föreslår vi att utformningen av 2-3 ASOs som glödga med sekvenser i den 3′-UTR eller CDS av mRNA av intresse. Varje ASO kan uppvisa en annan effektivitet för återvinning av respektive mRNA målet och bör vara empiriskt testade (figur 2A, B, data som inte visas). I slutet hittade vi att ASOs glödgning till de 3′ utr presterade bättre jämfört med de glödgning till CD-skivor. Detta kan bero på ökad tillgänglighet av bindande platser i utr på grund av avsaknad av översätta ribosomer, medan ribosomer kan hindra effektiv hybridisering inom CD-skivor. Vi upplevde också att kombinationen av flera ASOs kan leda till ökad förorening från rikliga målarter mRNA och minskad nedrullningsbara effektivitet. I alla fall den valda oligos selektivitet kan styras av konkurrensen experiment (t.ex., tillägg av konkurrerande oligos).
Ytterligare bekymmer gäller potentiella cross-hybridisering med orelaterade RNAs, som vi har påpekat att även partiell hybridisering med andra mRNA kan leda till återkrav av det mRNA (figur 2 c). För att bedöma lämpligheten hos de designade ASOs, därför rekommenderar vi utför inledande in vitro- tester med totala RNAs att optimera salt koncentrationerna och tvättemperatur buffertar. I våra händer, tvättning av streptividin-kopplade magnetiska pärlor i buffertar som innehåller 150 mM NaCl vid 55 ° C presterade bäst, men vi rekommenderar oberoende tester av villkoren för varje utformad ASO. Anmärkningsvärd, Vi hittade att alla ASOs valt från in vitro försök (figur 2D) var lämpliga för att fånga respektive mRNA målet från tvärbundna cell extrakt (figur 3), ytterligare styrker giltigheten av i vitro testning. Förutom att utforma lämpliga ASOs för mRNA capture, skulle kunna ytterligare faktorer inverka på selektivitet. Omfattande blockerande förfaranden med BSA och/eller tRNA enligt bead typ specifikationerna kan därför förhindra ospecifik bindning till pärlor. För att ytterligare minska ospecifika upptaget av proteiner, rekommenderar vi också användningen av Lo-bind rör, speciellt när man arbetar med låga mängder prover.
Allmänt, resa kan komplettera tidigare etablerade metoder för att fånga RNAs med ASOs. Till exempel, var den icke-kodande RNA Xist isolerade med bundna proteiner från kärntekniska extrakt härrör från 200-800 miljoner UV tvärbundna celler med hjälp av en matris med lång (90-mer) biotinylerade DNA oligonukleotider som täckte hela avskriften 34,35. Men metoden valt kakel kan bli problematiskt mot bakgrund av den stora potentialen för cross-hybridisering med orelaterade RNAs, och det kan inte användas för att markera specifika avskrift, t.ex., alternativt skarvas former. Nyligen, utformade särskilt låst nukleinsyra (LNA) eller DNA ASO mixmers fästes kovalent till en magnetisk harts återställa in vitro- avskrift eller starkt uttryckt ribosomalt RNA från cellfria extrakt; Det testades dock inte för återhämtning i vivo bildade mRNA-protein komplex36. Mot bakgrund av ökad erkännande av post-transcriptional gen kontroll av RBPs och ncRNA anser vi att resa är en användbar metod att undersöka sammansättning och dynamiken i RNP komplex inom celler vid intracellulära och miljömässiga cues och dess inverkan vid hälsa och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma att Dr Jonathan Hall och Mauro Zimmermann (ETH Zurich) för syntesen av PFK2 och cep-1 ASOs, Dr Maikel Wouters för utformningen av M27/CDKN1B ASOs och Dr Rafal Ciosk (Friedrich Miescher Institutet för biomedicinsk forskning, Basel) för anti-GLD-1 antikroppar. Detta arbete stöddes av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BB/K009303/1) och en Royal Society Wolfson forskning Merit Award (WM170036) till A.P.G.
MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker | Thermo Fisher Scientific | SHKE5000-8CE | Floor shaker to grow yeast cells |
BBD 6220 | Thermo Fisher Scientific | CO2 incubator to grow human cells | |
Sonicator Soniprep150 | MSE | MSS150.CX4.5 | Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates |
Stratalinker 1800 | Stratagene | Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm | |
Tissue Lyser | Qiagen | RETSCH MM200 | Device to mechanically disrupt yeast cells |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge to spin down cells, lysates |
Shaking incubator, Thriller | Peqlab | Thermoshaker for 1.5 mL tubes | |
Glass beads 0.5mm | Stratech Scientific Limited | 11079105 | Lysis of yeast cells |
Nylon Filter, 0.41 μm | Millipore | NY4104700 | Collection of yeast cells |
Millex-HA Filter, 0.45 µm | EMD Millipore | SLHA02510 | Filter to clear nematode lysate |
Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22431081 | Minimise protein loss |
2 mL microfuge tube | Ambion | AM12425 | Yeast extract preparation and other applications |
5 mL tube | Thermo Fisher Scientific | 129A | Collection of HEK293 cell lysate |
15 mL tube | Sarstedt | 62.547.254 | Collection C. elegans |
50 mL plastic tube | Sarstedt | 62.554.502 | Collection yeast cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966 | Media for culturing HEK293 cells |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | Used to supplement cell culture media |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | DNAse I to degrade DNA from cell lysate |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | RNase inhibitor to avoid RNA degradation |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation |
Dynabeads Oligo (dT)25 | Thermo Fisher Scientific | 61011 | Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | 10109550001 | transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions |
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 5000205 | To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100G | Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination |
mouse anti-Act1 | MP Biomedicals | 869100 | Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500) |
mouse anti-Act1 | Sigma | A1978 | Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000) |
mouse anti-HuR | Santa Cruz | sc-5261 | Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500) |
mouse anti–CYC-1 | Invitrogen | 456100 | Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000) |
peroxidase anti-peroxidase soluble complex | Sigma | P1291 | Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000) |
HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG | Amersham | NXA931 | HRP-coupled secondary antibody |