Her præsenterer vi en forsøgsplan, der kan anvendes til at fastlægge bindende tilhørsforhold og tilstand af samspillet mellem etiket-fri phospholipid-bindende protein annexin A2 med immobiliserede fast-understøttet dobbeltlag (SLB) ved samtidig måling af massiv udbredelse og viskoelastiske egenskaber af protein annexin A2.
Antistatiske kvarts krystal microbalance teknik er en enkel og etiket-fri tilgang til måle samtidig de masse udbredelse og viskoelastiske egenskaber masse absorberes/immobiliseret på sensor overflader, så målingerne af samspillet af proteiner med fast-understøttet overflader, såsom lipid dobbeltlag, i realtid og med en høj følsomhed. Annexins er en stærkt bevarede gruppe af fosfolipid-bindende proteiner, der interagerer kan dekrypteres med den negativt ladede headgroups via samordning af calciumioner. Her, vi beskriver en protokol, der blev anvendt til kvantitativt analysere bindingen af annexin A2 (AnxA2) til planar lipid dobbeltlag forberedt på overfladen af et quartz sensor. Denne protokol er optimeret for at opnå robuste og reproducerbare data og indeholder en detaljeret trin for trin beskrivelse. Metoden kan anvendes til andre membran-bindende proteiner og tolagede kompositioner.
Cellemembraner er stærkt dynamiske og komplekse strukturer. Den sammensatte blanding af membran lipider, sammen med perifert og/eller gennemfoert fuldt forbundet Membranproteiner, samle til form microdomains. Den koordinerede tempo-rumlige organisering af disse membran microdomains er involveret i vigtige fysiologiske processer1. Membran microdomain dynamics er drevet af samspillet mellem membran lipider og perifere Membranproteiner til at genkende og interagere med lipider beriget i microdomains evne. Ansættelse af proteiner til de specifikke lipider er ofte opnået via lipid-anerkendelse moduler, såsom pleckstrin Homologi (PH) eller C2 domæner2,3. Biofysiske analytiske metoder ved hjælp af model membraner er nøglen til at forstå de grundlæggende principper for disse processer på det molekylære niveau.
Annexins, en stor multigene-familie, er kendt for deres evne til at binde til negativt ladede membran lipider, overvejende Phosphatidylserin (PS), i en Ca2 +-kontrolleret måde2. Den anden hallmark af annexin familien er tilstedeværelsen af en bevaret strukturelle segment, den annexin gentage, og det nuværende fire eller otte gange og havne Ca2 +– og phospholipid-bindende websteder4. Ca2 +-afhængige lipid interaktion placerer annexins i en perfekt position til at sanse og formidle Ca2 +-medieret signalerer til target membraner. Konsekvent, er annexins i stand til at inducere dannelse af microdomains beriget med kolesterol, phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) og PS, både i cellulære og/eller kunstig membran systemer5. Denne protokol beskriver en metode til at analysere annexin membran interaktion ved hjælp af en kvartskrystal Microbalance spredning (QCM-D)6,7,8.
Den grundlæggende komponent i denne microbalance er en oscillerende krystal, der fungerer som sensoren overfladen. Adsorption og/eller binding af molekyler til sensoren overfladen falder resonansfrekvens (f) proportional med stigningen i massen. Hvis overfladen er jævnt overtrukket med en film, bindingen af yderligere stoffer kan forstyrre dette lag strukturelle integritet, og sådanne ændringer i viscoelasticity (energi varmeafledning faktoren D) Desuden kan overvåges. Dette er en udbredt teknik til at studere samspillet mellem proteiner og lipid dobbeltlag. I denne tilgang absorberes lipid vesikler passende belagt sensoren overfladen. Lipid tolagede dannelse er gunstig på silica-baserede materialer9,10, som blærer ofte ikke brud på andre hydrofile overflader, såsom guld11 oxideret efter UV-ozon eksponering, TiO212eller Al 2O313. Brud på de samler vesikler frigiver den vandige fase, medfører karakteristiske ændringer i massen og varmeafledning. Generation af solid-støttede dobbeltlag (SLB) af vesikel fusion er enkel og robust og kan bruges til at oprette komplekse modeller, der efterligner cellemembraner.
Antistatiske kvarts krystal microbalance er en etiket-fri og følsom teknik. En stor fordel er muligheden for at pels materiale, der genererer en tilstrækkelig tynd film på overfladen, hvilket giver en bred vifte af applikationer i forskellige forskningsområder. Protein-membran interaktion er observeret i realtid, og resultaterne kan analyseres direkte. Den samme sensor overflade kan bruges i de efterfølgende målinger (efter udførelse af en minimal rengøring som beskrevet i denne protokol), hvilket giver mulighed for præcis intern kontrol og en sammenlignelighed mellem analysander.
For at besvare spørgsmål vedrørende struktur-funktion relationer af cellulære membraner både i en kvantitativ og kvalitativ måde, celle biologi overskud umådeligt fra brugen af biofysiske metoder baseret på veletablerede og udbredte teknikker , herunder atomic force mikroskopi (AFM), overflade plasmon resonans (SPR), og QCM-D teknik ansat her. Vi viste i tidligere undersøgelser, der annexin proteiner binder i en Ca2 +-afhængige måde til det immobiliserede membran med høj affinitet. Vi bruger frekvens og varmeafledning forskydninger af 7th overtone (Δf7), fordi det repræsenterer det bedste kompromis af påvisning følsomhed og oscillation stabiliteten.
Denne teknik også tillader en kvantitativ beskrivelse af membran-protein interaktion. AnxA2 binding til membranen er kendetegnet ved positive cooperativity, som er formidlet af det bevarede annexin core domæne og afhænger af tilstedeværelsen af kolesterol. De kvantitative data indhentet for AnxA2 og AnxA8 er rapporteret i detaljer andetsteds6,8.
Der er mange kritiske trin i denne protokol. Brug af Liposomer straks; ellers kan små blærer smelte ind i større vesikler med mindre overfladespænding, fører til hæmning af lipid tolagede dannelse. Opretholde en konstant temperatur under målingerne. Hver lille afvigelse i temperatur resulterer i en ikke ubetydelig frekvens og varmeafledning Skift. Undgå luftbobler; ellers systemet er ustabilt og vil ikke oprette en oprindelig plan.
Sauerbrey ligningen tillader den direkte omdannelse af den observerede frekvens ændres til ændringer i massen og er derfor meget udbredt. Men en antagelse om en lineær korrelation mellem ændringen i resonansfrekvens og tilføjede massen kun gælder for komponenter, der udgør en stiv og ensartet film på sensoren overfladen. Sauerbrey ligning kan ikke bruges til viskoelastiske adsorbenter såsom vand-rige protein film, lipid lag med indbygget vand, eller endda adsorberet celler. Her, er mere komplekse matematiske modeller påkrævet. Det er derfor yderst vigtigt at samtidig overvåge ændringer i hyppighed og varmeafledning. For at registrere strukturelle ændringer under målingen, kan ΔD versus Δf nøgletal afbildes, med en lige linje, der angiver ingen konformationelle ændringer.
En stor fordel ved denne teknik er muligheden for at bruge en meget bred vifte af materialer som substrater. Derudover er det en pålidelig og direkte metode til at studere en bred vifte af Makromolekylære interaktioner, som ordentlig dannelsen af overflade-belægning film (som SLB), samt yderligere protein-lipid interaktioner, kan overvåges online.
Denne protokol kan blive anvendt på andre membran-interagere proteiner, for eksempel, BAR domæne proteiner19, den ERM (ezrin, radixin og moesin) protein familie, der har en vigtig rolle i membran-cytoskeleton kobling20,21 ,22, eller proteiner der indeholder C2 eller PH domæner. Desuden har en bred vifte af anvendelser af denne teknik til at studere biologiske materialer været publiceret, dermed skabe QCM som en velegnet eksperimentelle platform til at studere samspillet af mere komplekse makromolekylære forsamlinger eller endda celler23,24.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft under grants SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 og SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |