여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.
되는 낭비 적인 크리스털 중량 기술은 간단 하 고 레이블 없는 접근 방식을 동시에 통풍 관 및 점 탄성 물성 상호 작용의 측정을 허용 하는 센서 표면에 흡수/움직일 질량의 측정 단백질 지질 bilayers, 실시간에서 같은 단단한 지원 표면, 그리고 높은 감도. Annexins는 칼슘 이온의 조화를 통해 부정 청구 headgroups와 역 상호 작용 하는 인지질-바인딩 단백질의 높은 보존된 그룹. 여기, 우리가 양적 annexin a 2의 바인딩 분석을 고용 했다 프로토콜 설명 (AnxA2) 평면 지질 bilayers 석 영 센서의 표면에 준비를. 이 프로토콜 강력 하 고 재현할 수 데이터를 최적화 하 고 자세한 단계별 설명을 포함. 메서드는 다른 막 바인딩 단백질과 bilayer 작곡에 적용할 수 있습니다.
세포 막에는 매우 역동적이 고 복잡 한 구조입니다. 막 지질, 함께 주변 및 integrally 관련된 막 단백질의 복합 혼합물 형태 microdomains를 조립 한다. 이러한 멤브레인 microdomains의 조정된 템포 공간 조직 주요 생리 적 프로세스1에 포함 된다. 막 microdomain 역학의 막 지질 작용 뿐만 아니라 인식 하 고 여기서는 microdomains에 농축 지질 주변 막 단백질의 능력에 의해 구동 됩니다. 특정 지질 단백질의 신규 모집은 종종 달성 을 통해 지질 인식 모듈, pleckstrin 상 동 (전화) 또는 C2 도메인2,3등. 생물 분석 방법 막 모델을 사용 하 여 분자 수준에서이 프로세스를 제어 하는 기본 원리를 이해 하는 열쇠는.
Annexins, 큰 multigene 가족, 캘리포니아2 +에서 부정 청구 막 지질, 주로 phosphatidylserine (PS), 바인딩할 그들의 능력에 대 한 잘 알려져 있습니다-제어 방식2. Annexin 가족의 두 번째 특징은 보존된 구조 세그먼트의 존재는 annexin 반복, 즉 현재 4 또는 8 시간 및 캘리포니아2 +-및 인지질 바인딩 사이트4항구. 캘리포니아2 +-종속 지질 상호 작용을 감지 하 고 전달 캘리포니아2 +완벽 한 위치에는 annexins를 배치-중재 대상 세포 막 신호. 일관 되 게, annexins microdomains 세포 및 인공 막 시스템5둘 다 콜레스테롤, phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PI (4, 5) P2), 및 PS, 농축의 형성을 유발 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 크리스털 중량 분산 (QCM-D)6,,78을 사용 하 여 annexin 막 상호 작용을 분석 하는 방법을 설명 합니다.
이 중량에 구성 하는 기본 요소는 진동 크리스탈 센서 표면 역할 이다. 흡착 및 바인딩 센서 표면에 분자의 질량에 있는 증가에 비례하여 공명 주파수 (f) 감소 합니다. 표면 균일 하 게 필름으로 코팅 되어, 추가 물질의 바인딩이이 계층의 구조적 무결성을 방해할 수 있습니다 그리고 점 탄성 (에너지 손실 계수 D)에서 이러한 변화는 또한 감시 될 수 있다. 이것은 지질 bilayers와 단백질의 상호 작용을 공부 하는 광범위 한 기술 이다. 이 방법에서는, 지질 소포는 적절 하 게 코팅된 센서 표면에 흡수 된다. 지질 bilayer 형성은 실리 카 기반 자료9,10, 유리한 소포 자주 하지 다른 친수성 표면에 파열 할 금11 UV 오존 노출, 티 오212또는 알 후 산화와 같은 2O313. 병합 vesicles의 파열 질량 및 분산 특성 변화를 선도 하는 수성 단계를 해제 합니다. 고체 지원 (SLB) bilayers 소포 융해에 의하여의 생성은 간단 하 고 강력한 고 모방 세포 막 복잡 한 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
되는 낭비 적인 크리스털 중량 레이블 및 중요 한 기술입니다. 주요 이점은 따라서 광범위 한 다양 한 연구 분야에 응용 프로그램을 제공 하는 표면에 충분히 박막을 생성 하는 어떤 물자 든 지 코트 가능성 이다. 단백질 막 상호 작용에서 관찰은 실시간, 그리고 결과 직접 분석할 수 있습니다. 동일한 센서 표면 (수행한 후 최소한의 청소이 프로토콜에서 설명), 후속 측정에 사용할 수 있습니다 따라서 정확한 내부 통제 및 analytes 사이 comparability에 대 한 허용.
양적 및 질적으로 모두 세포 막의 구조-기능 관계에 관한 질문에 대답, 세포 생물학 생물 접근의 사용에서 대단히 잘 설립에 따라 이익과 널리 이용 되는 기법 원자를 포함 하 여 현미경 검사 법 (AFM), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 고 QCM D 기술을 여기에 고용. 우리는 캘리포니아2 +에서 annexin 단백질 바인딩 이전 연구에서 보여주었다-높은 선호도와 고정된 막에 의존 방식으로. 우리가 사용 하는 주파수 및이 검출 감도 진동 안정성의 좋은 타협을 나타냅니다 때문에 소비 7 상 음 (Δf7)의 교대.
이 기술은 또한 막 단백질 상호 작용의 양적 설명을 허용합니다. 막에 AnxA2 바인딩 보존된 annexin 핵심 도메인에 의해 중재 되 고 콜레스테롤의 존재에 따라 긍정적인 cooperativity 특징 이다. AnxA2와 AnxA8에 보고 됩니다 위한 얻은 정량적 데이터 자세히 다른6,8.
이 프로토콜에는 많은 중요 한 단계가 있습니다. 에 리를 사용 하 여 즉시; 그렇지 않으면, 작은 소포 적은 표면 장력, 지질 bilayer 형성의 억제에 지도 함께 더 큰 소포에 융합 될 수 있습니다. 측정 하는 동안 일정 한 온도 유지 합니다. 온도 있는 작은 탈 각 하지 무시할 주파수와 소비 변화에 발생합니다. 공기 방울; 방지 그렇지 않으면, 시스템은 불안정 하 고 초기 계획을 설정 하지 않습니다.
Sauerbrey 방정식에는 관찰 된 주파수의 직접 변환 질량에서 변화에 변경 하 고, 따라서, 널리 사용 되는 수 있습니다. 그러나, 공 진 주파수에 변화 그리고 추가 질량 사이의 선형 상관 관계의 가정에만 센서 표면에 견고 하 고 균일 한 필름을 형성 하는 구성 요소에 대 한 진정한 보유. Sauerbrey 방정식 점 탄성 adsorbents 물 풍부한 단백질 영화, 통합 물, 지질 층 등에 사용할 수 없습니다 또는 심지어 세포를 흡착. 여기, 더 복잡 한 수학적 모델은 필요. 따라서, 동시에 주파수와 소비 변화를 모니터링 하는 매우 중요 하다. 측정 도중 구조적인 변화를 감지, δ 비율 대 ΔD 그릴 수 있습니다, 구조적 변경 나타내는 직선으로.
이 기술의 주요 장점은 기판으로 매우 광범위 한 재료를 사용 하는 가능성입니다. 또한, 그것은 안정적이 고 직접적인 방법은 더 단백질 지질 상호 작용 뿐만 아니라 표면 코팅 필름 (SLB), 등의 적절 한 형성으로 다양 한 고분자 상호 작용을 공부 하는 온라인으로 모니터링할 수 있습니다.
이 프로토콜 수에 적용 다른 상호 작용 하는 막 단백질, 예를 들어 도메인 단백질19, 바 막-골격 연계20,21에서에서 중요 한 역할은 ERM (ezrin, radixin, 및 moesin) 단백질 가족 ,22또는 C2 또는 PH 도메인을 포함 하는 단백질. 또한, 다양 한 생물 학적 자료를 공부이 기술의 응용 프로그램 성공적으로 게시 된, 따라서 QCM 더 복잡 한 고분자 어셈블리 또는 상호 작용을 공부 하기 적합된 실험 플랫폼으로 구축 23,24셀이 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 보조금 SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04, 및 SFB 1348/A11 도이치 가운데에 의해 지원 되었다.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |