यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि बाध्यकारी समानताएं और लेबल मुक्त फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी प्रोटीन की बातचीत के मोड को एक साथ एक साथ मापने के द्वारा मैटीरियल ठोस समर्थित bilayers (SLB) के साथ निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है मौजूद बड़े पैमाने पर और प्रोटीन के viscoelastic गुण A2 annexin ।
अपव्ययी क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance तकनीक एक सरल और लेबल मुक्त दृष्टिकोण को एक साथ मापने के लिए बड़े पैमाने पर और अवशोषित/सेंसर सतहों पर मैटीरियल द्रव्यमान का viscoelastic गुण, बातचीत की माप की अनुमति ठोस समर्थित सतहों के साथ प्रोटीन की, ऐसे लिपिड bilayers के रूप में, वास्तविक समय में और एक उच्च संवेदनशीलता के साथ. Annexins फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी प्रोटीन है कि reversibly कैल्शियम आयनों के समंवय के माध्यम से नकारात्मक आरोप लगाया headgroups के साथ बातचीत के एक अत्यधिक संरक्षित समूह हैं । यहाँ, हम एक क्वार्ट्ज सेंसर की सतह पर तैयार planar लिपिड bilayers के लिए annexin A2 (AnxA2) की बाइंडिंग को मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया था एक प्रोटोकॉल का वर्णन करें । इस प्रोटोकॉल को सुदृढ़ और reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाता है और इसमें विस्तृत चरण-दर-चरण वर्णन शामिल होता है. विधि अंय झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन और bilayer रचनाओं के लिए लागू किया जा सकता है ।
सेलुलर झिल्ली अत्यधिक गतिशील और जटिल संरचनाओं हैं । झिल्ली लिपिड के यौगिक मिश्रण, साथ में बाह्य और/या अभिन्न रूप से जुड़े झिल्ली प्रोटीन, फार्म microdomains के लिए इकट्ठा । इन झिल्ली microdomains के समंवित गति-स्थानिक संगठन कुंजी शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल है1। झिल्ली microdomain गतिशीलता झिल्ली लिपिड के परस्पर क्रिया द्वारा संचालित कर रहे हैं, साथ ही परिधीय झिल्ली प्रोटीन की क्षमता को पहचानने और लिपिड microdomains में समृद्ध के साथ बातचीत करने के लिए । विशिष्ट लिपिड के लिए प्रोटीन की भर्ती अक्सर लिपिड मान्यता मॉड्यूल के माध्यम से प्राप्त होता है, जैसे pleckstrin समरूपता (पीएच) या C2 डोमेन2,3. मॉडल झिल्ली का उपयोग कर भौतिक विश्लेषणात्मक तरीकों बुनियादी आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित सिद्धांतों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
Annexins, एक बड़े multigene-परिवार, अपने को नकारात्मक चार्ज झिल्ली लिपिड, मुख्य रूप से phosphatidylserine (पी एस), एक Ca2 +-नियंत्रित तरीके से बाइंड करने की क्षमता के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है2। annexin परिवार की दूसरी पहचान एक संरक्षित संरचनात्मक खंड की उपस्थिति है, annexin दोहराने, कि चार या आठ बार मौजूद है और सीए2 बंदरगाह +-और फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी साइटों4। ca2 +-निर्भर लिपिड बातचीत भावना के लिए एक सही स्थिति में annexins स्थानों और 2 सीए दे+-मध्यस्थता लक्ष्य झिल्ली को संकेतन. लगातार, annexins कोलेस्ट्रॉल में समृद्ध microdomains के गठन के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं, phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4, 5) पी2), और पी एस, दोनों में सेलुलर और/या कृत्रिम झिल्ली सिस्टम5. इस प्रोटोकॉल annexin-झिल्ली एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance अपव्यय का उपयोग कर बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन (QCM-D)6,7,8.
इस microbalance में मूल घटक एक दोलन क्रिस्टल है कि सेंसर सतह के रूप में कार्य करता है । सोखना और/या सेंसर सतह के लिए अणुओं की बाध्यकारी अनुनाद आवृत्ति कम हो जाती है (f) द्रव्यमान में वृद्धि करने के लिए आनुपातिक. यदि सतह समान रूप से एक फिल्म के साथ लेपित है, अतिरिक्त पदार्थों के बंधन इस परत के संरचनात्मक अखंडता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और viscoelasticity में इस तरह के परिवर्तन (ऊर्जा अपव्यय कारक डी) इसके अतिरिक्त पर नजर रखी जा सकता है । यह एक व्यापक तकनीक लिपिड bilayers के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए है । इस दृष्टिकोण में, लिपिड बुलबुले उचित लेपित संवेदक सतह पर अवशोषित कर रहे हैं । लिपिड bilayer गठन के अनुकूल है सिलिका पर आधारित सामग्री9,10, के रूप में बुलबुले अक्सर अन्य हाइड्रोफिलिक सतहों पर टूटना नहीं है, इस तरह के रूप में सोने11 यूवी के बाद ऑक्सीकरण-ओजोन एक्सपोजर, TiO212, या अल २हे३१३. coalescing बुलबुले का टूटना जलीय चरण विज्ञप्ति, बड़े पैमाने पर और अपव्यय में विशेषता परिवर्तन के लिए अग्रणी । पुटिका फ्यूजन द्वारा ठोस समर्थित bilayers (SLB) की पीढ़ी सरल और मजबूत है और सेलुलर झिल्ली की नकल है कि जटिल मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अपव्यय क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance एक लेबल मुक्त और संवेदनशील तकनीक है । एक प्रमुख लाभ की संभावना को कोट किसी भी सामग्री है कि सतह पर एक पर्याप्त पतली फिल्म उत्पंन करता है, इस प्रकार विविध अनुसंधान क्षेत्रों में आवेदनों की एक व्यापक रेंज प्रदान कर रहा है । प्रोटीन-झिल्ली बातचीत वास्तविक समय में मनाया जाता है, और परिणाम सीधे विश्लेषण किया जा सकता है । एक ही सेंसर सतह अनुवर्ती माप में इस्तेमाल किया जा सकता है (इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ंयूनतम सफाई प्रदर्शन के बाद), इस प्रकार सटीक आंतरिक नियंत्रण और analytes के बीच एक तुलना के लिए अनुमति देता है ।
दोनों एक मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके से सेलुलर झिल्ली की संरचना-समारोह संबंध के विषय में सवालों के जवाब देने के लिए, सेल जीव विज्ञान लाभ बेहद अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक के आधार पर जैव भौतिक दृष्टिकोण के उपयोग से , जिसमें परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM), भूतल plasmon अनुनाद (SPR), और यहां कार्यरत QCM-डी तकनीक शामिल हैं । हम पिछले अध्ययनों में पता चला है कि annexin प्रोटीन एक Ca2 +-निर्भर तरीके से उच्च अपनत्व के साथ स्थिर झिल्ली में बांध । यह पता लगाने संवेदनशीलता और दोलन स्थिरता का सबसे अच्छा समझौता का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि हम 7 (Δf7) की आवृत्ति और अपव्यय पारियों का उपयोग करें ।
इस तकनीक भी झिल्ली प्रोटीन संपर्क का एक मात्रात्मक विवरण परमिट । AnxA2 झिल्ली के लिए बाध्यकारी सकारात्मक cooperativity है कि संरक्षित annexin कोर डोमेन द्वारा मध्यस्थता है और कोलेस्ट्रॉल की उपस्थिति पर निर्भर करता है की विशेषता है । AnxA2 और AnxA8 के लिए प्राप्त मात्रात्मक आंकड़ों में6,8कहीं विस्तार से बताया गया है ।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । तुरंत liposomes का उपयोग करें; अंयथा, छोटे बुलबुले कम सतह तनाव के साथ बड़ा बुलबुले में फ्यूज, लिपिड bilayer गठन के निषेध के लिए अग्रणी हो सकता है । माप के दौरान एक निरंतर तापमान बनाए रखें । एक नहीं नगण्य आवृत्ति और अपव्यय बदलाव में तापमान परिणामों में प्रत्येक छोटे विचलन । हवा के बुलबुले से बचें; अंयथा, सिस्टम अस्थिर है और एक आधार रेखा स्थापित नहीं करेगा ।
Sauerbrey समीकरण बड़े पैमाने पर परिवर्तन में मनाया आवृत्ति परिवर्तन के प्रत्यक्ष रूपांतरण की अनुमति देता है और इसलिए, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया । हालांकि, अनुनाद आवृत्ति में परिवर्तन और जोड़ा द्रव्यमान के बीच एक रैखिक सहसंबंध की धारणा केवल सेंसर सतह पर एक कठोर और समान फिल्म बनाने घटकों के लिए सच रखती है । Sauerbrey समीकरण पानी से भरपूर प्रोटीन फिल्मों, शामिल पानी के साथ लिपिड परतों, या यहां तक कि adsorbed कोशिकाओं के रूप में viscoelastic अधिशोषक के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । यहां, अधिक जटिल गणितीय मॉडल की आवश्यकता है । इसलिए, यह एक साथ आवृत्ति और अपव्यय में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. माप के दौरान संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, ΔD बनाम Δf अनुपात की साजिश रची जा सकती है, जिसमें कोई भी संपरिवर्तन नहीं होने का संकेत देने वाली सीधी रेखा होती है ।
इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ के लिए सब्सट्रेट के रूप में सामग्री की एक बहुत व्यापक रेंज का उपयोग करने की संभावना है । इसके अलावा, यह एक विश्वसनीय और प्रत्यक्ष विधि macromolecular बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए है, के रूप में सतह कोटिंग फिल्मों के समुचित गठन (जैसे SLB), साथ ही साथ आगे प्रोटीन-लिपिड बातचीत, ऑनलाइन निगरानी की जा सकती है ।
इस प्रोटोकॉल अंय झिल्ली-बातचीत प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बार डोमेन प्रोटीन19, एर्म (ezrin, radixin, और moesin) प्रोटीन परिवार है कि झिल्ली में एक महत्वपूर्ण भूमिका है-cytoskeleton लिंकेज20,21 ,22, या c2 या PH डोमेन युक्त प्रोटीन. इसके अलावा, जैविक सामग्री का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला सफलतापूर्वक प्रकाशित किया गया है, इस प्रकार अधिक जटिल macromolecular सभाओं या यहां तक की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल प्रयोगात्मक मंच के रूप में QCM की स्थापना कोशिकाओं23,24.
The authors have nothing to disclose.
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था के तहत अनुदान SFB B04, EXC १००३, SFB 1348/A04, और SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |