Her presenterer vi en eksperimentell protokoll som kan brukes til å bestemme bindende slektskap og modus for samhandling etikett-fri phospholipid-binding protein annexin A2 med immobilisert solid-støttet bilayers (SLB) ved samtidig måling av masse opptak og egenskapene viskoelastiske protein annexin A2.
Dissipative kvartskrystall microbalance teknikken er en enkel og etikett-fri tilnærming til mål samtidig masse opptak og viskoelastiske egenskapene til absorbert/immobilisert massen på sensoren overflater, slik at målinger av samspillet proteiner med solid-støttet overflater, for eksempel lipid bilayers, i sanntid og med en høy følsomhet. Annexins er en høyt konservert gruppe av phospholipid-binding proteiner som samhandler reversibel med den negativt ladde headgroups via samordning av kalsiumioner. Her beskriver vi en protokoll som var ansatt kvantitativt analysere binding av annexin A2 (AnxA2) til planar lipid bilayers forberedt på overflaten av en kvarts sensor. Denne protokollen er optimalisert for å skaffe robust og reproduserbar og inkluderer en detaljert detaljert beskrivelse. Metoden kan brukes til andre membran-bindende proteiner og bilayer komposisjoner.
Mobilnettet membraner er svært dynamisk og komplekse strukturer. Sammensatt blanding av membran lipider, sammen med perifert og/eller integrally knyttet membran proteiner, samle til skjemaet microdomains. Koordinert tempo-romlige organiseringen av disse membran microdomains er involvert i viktige fysiologiske prosesser1. Membran microdomain dynamics drevet samspillet mellom membran lipider og evne til perifere membran proteiner å gjenkjenne og samhandle med lipider anriket på microdomains. Rekruttering av proteiner til de bestemte lipider er ofte oppnås via lipid-anerkjennelse moduler, som pleckstrin homologi (PH) eller C2 domener2,3. Biofysiske analytiske metoder med modell membraner er nøkkelen til å forstå de grunnleggende prinsippene som styrer disse prosesser på molekylært nivå.
Annexins, en stor multigene-familie, er godt kjent for sin evne til å binde til negativt ladde membran lipider, hovedsakelig fosfatidylserin (PS), i en Ca2 +-kontrollert måte2. Andre kjennetegner annexin familien er tilstedeværelsen av en bevart strukturelle segment, den annexin gjentar, det finnes fire eller åtte ganger og havner den Ca2 +– og phospholipid-bindende områder4. Ca2 +-avhengige lipid samhandling plasserer annexins i perfekt posisjon til å kjenne og formidle Ca2 +-mediert signalisering til målet membraner. Konsekvent kan annexins indusere dannelsen av microdomains beriket i kolesterol, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P2) og PS, både i mobilnettet og/eller kunstig membran systemer5. Denne protokollen beskriver en tilnærming for å analysere annexin-membran samhandling ved hjelp av Quartz Crystal Microbalance spredning (QCM-D)6,7,8.
Den grunnleggende komponenten i denne microbalance er en oscillerende krystall som fungerer som sensoren. Adsorpsjon og/eller binding av molekyler til sensoren overflaten reduserer resonans frekvensen (f) proporsjonal til økningen i massen. Hvis overflaten er jevnt belagt med en film, binding av andre stoffer kan forstyrre den strukturelle integriteten for dette laget, og slike endringer i viscoelasticity (energi ødsling faktoren D) kan overvåkes i tillegg. Dette er en utbredt teknikk å studere samspillet av proteiner med lipid bilayers. I denne tilnærmingen opp lipid blemmer på riktig belagt sensor overflaten. Lipid bilayer formasjon er gunstig på silisium-baserte materialer9,10, som blemmer ofte ikke brudd på andre hydrofile overflater, som gull11 oksidert etter eksponering for UV-ozon, TiO212eller Al 2O313. Brudd på koaleserende blemmer utgivelser den vandige fasen, fører til karakteristiske endringer i masse og spredning. Solid-støttet bilayers (SLB) av vesicle fusion er enkel og robust og kan brukes til å generere komplekse modeller som etterligner mobilnettet membraner.
Dissipative kvartskrystall microbalance er en etikett-fri og følsom teknikk. En stor fordel er muligheten til pels materiale som genererer en tilstrekkelig tynn film på overflaten, gir et bredt spekter av programmer i ulike forskningsområder. Protein-membran samspillet er observert i sanntid, og resultatene kan analyseres direkte. Samme sensor overflaten kan brukes i påfølgende mål (når du har utført en minimal rengjøring som beskrevet i denne protokollen), dermed muliggjør nøyaktig internkontroll og en sammenlignbarheten mellom analytter.
For å besvare spørsmål om struktur-funksjon forholdet mellom mobilnettet membraner både kvantitative og kvalitative måte, cellen biologi fortjeneste utrolig nytte av Biofysiske tilnærminger basert på veletablerte og brukte teknikker , inkludert atomic force mikroskopi (AFM), overflate plasmon resonans (SPR), og QCM-D teknikken ansatt her. Vi viste i tidligere studier som annexin proteiner bind i en Ca2 +-avhengige måte immobilisert membranen med høy affinitet. Vi bruker frekvens og spre Skift av de 7 overtone (Δf7) fordi dette er det beste kompromisset oppdagelsen følsomhet og svinging stabilitet.
Denne teknikken tillater også en kvantitativ beskrivelse av membran-protein samhandlingen. AnxA2 binding til membranen er preget av positiv cooperativity som er formidlet av bevarte annexin kjernen domenet og avhenger tilstedeværelsen av kolesterol. Kvantitative data innhentet for AnxA2 og AnxA8 rapporteres i detalj andre steder6,8.
Det er mange avgjørende skritt i denne protokollen. Bruk liposomer umiddelbart. ellers kan små blemmer sikring i større blemmer med mindre overflatespenning, fører til hemming av lipid bilayer dannelsen. Opprettholde en konstant temperatur under målinger. Hver liten avvik i temperatur gir en ikke ubetydelig frekvens og spre SKIFT. Unngå luftbobler; ellers systemet er ustabilt og vil ikke opprette en opprinnelig plan.
Sauerbrey ligningen gjør direkte konvertering av observerte frekvensen endres til endringer i massen og er derfor mye brukt. Men gjelder forutsetningen om en lineær sammenheng mellom endringen i resonansfrekvens og lagt til massen bare for komponenter danne en stiv og ensartet film på sensoren overflaten. Sauerbrey ligningen kan ikke brukes for viskoelastiske adsorbents som vann-rik protein filmer, lipid lag med innarbeidet vann, eller selv adsorbert celler. Her kreves mer komplekse matematiske modeller. Derfor er det svært viktig å samtidig overvåke endringer i frekvens og spredning. For å oppdage strukturelle endringer under målingen, kan ΔD versus Δf forhold tegnes, med en rett linje som angir ingen conformational endringer.
En stor fordel med denne teknikken er muligheten til å bruke et meget bredt spekter av materialer som underlag. Dessuten, det er en pålitelig og direkte metode for å studere en rekke macromolecular vekselsvirkningene, som skikkelig dannelsen av overflatebelegg filmer (for eksempel SLB), samt ytterligere protein-lipid interaksjoner, kan overvåkes online.
Denne protokollen kan brukes på andre membran-samspill proteiner, for eksempel BAR domene proteiner19, ERM (ezrin, radixin og moesin) protein familien som har en viktig rolle i membran-cytoskjelett sammenhengen20,21 ,22eller proteiner som inneholder C2 eller PH-domener. Dessuten publisert en rekke anvendelser av denne teknikken å studere biologiske materialer ble, dermed etablere QCM som velegnet eksperimentelle plattform å studere samspillet av mer komplekse macromolecular samlinger eller selv cellene23,24.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft under tilskudd SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 og SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |