Summary
P19小鼠胚胎癌细胞系(P19细胞系)与体内分析相比,广泛用于神经发生分子机制的研究,具有极大的简化性。在这里,我们提出了P19细胞系中视黄酸引起的神经发生方案。
Abstract
从小鼠胚胎衍生的畸虫瘤衍生的P19细胞系具有分化成三个生殖层的能力。在视黄酸(RA)的存在下,悬浮培养的P19细胞系被诱导分化成神经元。这种现象作为体外神经发生模型被广泛研究。因此,P19细胞系对于与神经发生相关的分子和细胞研究非常有用。然而,文献中描述的P19细胞系神经元分化方案非常复杂。本研究开发的方法简单,对阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制起到一定的作用。
Introduction
在胚胎发育过程中,单个细胞层被转化为三个独立的生殖层1,2,3。为了增加在体内发生的现象的研究可能性,已经开发出三维聚集物(胚胎体)作为一种方便的模型。以这种方式形成的细胞聚集体可以暴露在各种导致细胞分化的条件下,这反映了胚胎4、5的发育。P19鼠胚胎癌细胞系(P19细胞系)常用作体外神经发生研究的细胞模型6、7、8。P19细胞系具有典型的多能干细胞特征,在细胞聚集过程中,在视黄酸(RA)存在的情况下可以分化成神经元,随后在粘附条件下生长出神经质。此外,未分化的P19细胞系还能够在二甲基硫酸盐(DMSO)9、10、11、12的影响下形成肌肉和心肌细胞样细胞。
许多方法13,14,15,16已经报告神经元分化,但方法有时很复杂,不容易掌握,只有阅读描述。例如,协议有时需要结合Dulbeco的改性鹰介质(DMEM)介质,辅以小牛血清(CS)和胎儿牛血清(FBS)13的混合物。此外,用于神经元发育的介质通常由神经巴沙和B27补充剂13,14,15,16组成。因此,现有方法在准备时包含复杂性,我们在此的目标是简化协议。在这项研究中,我们证明了使用FBS的DMEM可用于维持P19细胞系(DMEM = 10%FBS)以及神经元发育(DMEM = 5%FBS + RA)。这种使用P19细胞系的神经发生简化方法使我们能够研究神经元如何发育的分子机制。此外,对神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病)的研究也使用P19细胞系17,18进行,我们相信,本研究中开发的方法将起到阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制。
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Protocol
1. 文化维护
- 培养维护介质中的P19细胞系(Dulbeco的改性Eagle培养基,含有4,500毫克/升葡萄糖,辅以10%FBS、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素)。在37°C和5%CO2下孵育。
2. 亚培养细胞
- 当细胞达到约80%汇合时,从细胞培养瓶中取出废培养基(表面积25cm2)。
- 用不含钙和镁的2 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。
- 在细胞单层上加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)。
- 将烧瓶放入CO2培养箱(37°C和5%CO2)2-3分钟。
- 评估与烧瓶表面的细胞附件。确保所有单元格都分离并浮动在介质中。
- 加入9 mL的维护介质,以阻止胰蛋白酶的酶活性。
- 在维护介质中重新挂起单元格。
- 将细胞转移到15 mL管和离心机5分钟,在200 x g和室温(RT)。
- 丢弃上清液,在 15 mL 管中加入 10 mL 的新鲜维护介质。
- 使用细胞悬架根据制造商的说明使用细胞计数器确定细胞编号。
- 种子细胞在2 x 104细胞/cm2在新的25厘米2烧瓶。
- 将维护介质添加到 10 mL。
- 将装有细胞的烧瓶放入CO2培养箱(37°C和5%CO2)2-3天。
3. 胰蛋白酶消化
- 从电池瓶中吸气维持介质。用2 mL的钙和无镁PBS清洗细胞一次。
- 添加 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
- 将装有细胞的烧瓶在37°C下放入CO2培养箱2-3分钟。
- 使用 1 mL 移液器通过移液细胞分离细胞 10 次。
- 通过在细胞中加入9 mL的分化介质(Dulbeco的改性Eagle的培养基,4500mg/L葡萄糖辅以5%FBS、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素)来中和胰蛋白酶,而不向细胞中添加RA。
- 将细胞转移到15 mL管和离心机5分钟,在200 x g和RT。
- 丢弃上清液,加入1 mL的分化介质,不含视黄酸(RA)。重新悬浮细胞颗粒。
- 使用细胞悬架根据制造商的说明使用细胞计数器确定细胞编号。
4. 聚合生成
- 将 5 μL RA(1 mM 库存溶解在 99.8% 乙醇中,储存在 -20°C) 添加到 10 mL 的分化介质中,并混合良好(最终浓度为 0.5 μM RA)。
注:RA 是光敏的。EtOH的低浓度不影响细胞分化19,20,21。 - 在 100 mm 未经处理的培养皿(专用于悬浮培养)中添加 10 mL 的分化介质(带 RA)。
- 在 100 mm 盘中播种 1 x 106细胞(碟面面积 56.5 厘米2)。
- 将装有细胞的烧瓶在37°C和5%CO2的培养箱中放置2天,以促进聚集的形成。
- 2天后,交换分化介质。使用 10 mL 移液器的包含集料的吸气介质,在 RT 处转移到 15 mL 管中。
- 允许聚合在 RT 下按重力沉降 1.5 分钟。
- 丢弃上清液。
- 使用 10 mL 血清移液器使用 0.5 μM RA 添加新的 10 mL 分化介质。
警告:请勿上下移液细胞聚集。 - 将料料播种到新的 100 mm 未经处理的培养盘中(专用于悬浮培养)。
- 将板放入培养箱(在37°C和5%CO2)中2天。
5. 聚合分离
- 使用 10 mL 移液器吸气细胞聚集体。
- 将骨料转移到 15 mL 管中。允许细胞聚合按重力沉降 1.5 分钟。
- 拆下上清液。
- 单独用DMEM清洗骨料(无血清和抗生素)。
- 在RT处,允许细胞聚集物通过重力沉降沉降1.5分钟沉降。
- 吸出上清液,加入2 mL的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)。
- 将细胞聚集体放入水浴(37°C)10分钟,用手敲击,每2分钟轻轻搅拌一次。
- 通过添加 4 mL 的维护介质,停止胰蛋白酶化过程。
- 移液器使用 1 mL 移液器向上和向下聚合 20 次。
- 离心细胞在200 x g和RT下5分钟。
- 取出上清液,在5 mL的维护介质中重新悬浮细胞颗粒。
- 使用单元格计数器确定单元格编号。
6. 电镀电池
- 将维护介质每孔 3 mL 添加到 6 孔板中。
- 6 孔培养板中的种子细胞密度为 0.5 x 106/孔。
- 在37°C孵育,CO2浓度为5%。
- 将细胞播种在6孔培养板上的盖玻璃上,用抗MAP2抗体(20%汇合)进行免疫染色。使用6孔板分离RNA,并对Map2、NeuN、Oct4、Nanog和Gapdh(20%汇合)执行RT-PCR。
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Representative Results
图1给出了P19细胞系神经发生诱导方案的简化方案。为了在未分化状态和神经发生期间定义P19细胞系的特征,采用了RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)方法。未分化的P19细胞系表示多能基因,如有机阳离子/肉碱转运体4(Oct4)和Nanog主源盒(Nanog)。在RA存在的情况下,悬浮培养细胞聚集引起的神经发生导致Oct4和Nanog表达的迅速减少。相反,神经元标记物的表达:微管相关蛋白2(Map2),NeuN(也称为RNA结合蛋白,狐狸-1同源3(Rbfox3))在触发神经发生后增加(图2)6 ,14,15,22.表1中用的每个基因的引源与核苷酸序列和产品大小一起指示。未分化的P19细胞系的微观图像呈现了圆形形态(图3A)。神经发生诱导后,细胞的神经元结构在电镀后4天清晰可见(图3B)。此外,图4表示在分化的P19细胞系(电镀细胞后4天)中MAP2表达的荧光图像14。
图 1:P19胚胎癌细胞神经发生诱导的议定书示意图。神经发生通过在 100 mm 未经处理的培养盘中培养 P19 细胞系,其 FBS 和 0.5 μM RA 为 5%。4天后,细胞聚集体与胰蛋白酶分离,并播种在粘附细胞培养板上,接下来的4天。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:P19细胞系基因表达的变化。带图表示未分化的P19细胞系(Oct4,Nanog)和神经发生期间(Map2,NeuN)的基因表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)用作参考基因。样品装在甘蔗糖凝胶中 (1.5%)在双重复制中。缩写:未分化表示未分化的P19细胞系,无需RA处理;第1-4天表示细胞电镀后的后几天-RA治疗和细胞聚集阶段后4天。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:P19细胞系分析的代表性图像。(A) 未分化P19细胞系的光显微图像.(B) 在神经发生4天后-RA治疗和细胞聚集阶段后4天,P19细胞系的显微图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:分化P19细胞系的代表性免疫荧光图像。在电镀后4天内,与抗MAP2和DAPI染色的P19细胞系的合并免疫荧光图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 底漆 | 引种序列 | 产品 尺寸(bp) |
| 加普德 | F: TGACCTCAACTGTTTTTTTTTTACA R: CTCTCTATCTCGGCCGG |
85 |
| 地图2 | F: GCATATCACCACAC R: TCCTGCCAGAGCTCGCC |
211 |
| 10月4日 | F: GGCGTCTCTGGAAGGTTC R: CTCGAACCATCTCTTT |
313 |
| 诺伊恩 | F: GGCAATGTTCGGATTCG R: TCAATTTCTCCTCCTCAT |
160 |
| 纳诺格 | F: AAAGGATAGGAGGGGGGG R: CTGGCTGCCCTCTATATATAGC |
520 |
表1:用于RT-PCR的引性剂。
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Discussion
在这里,我们描述了使用P19细胞系的神经发生的简单方案。虽然在这方面已经发表了许多报告,但使用P19细胞系进行神经发生诱导的详细方法仍不清楚。此外,我们在整个实验中使用了简单的高葡萄糖(4,500mg/L)DMEM培养基,10%FBS。这使我们能够以用户友好的方式进行神经生成实验,并在未来扩展此方法的使用范围。
该协议中最重要的点是RA浓度以及在悬浮培养液中生成细胞聚集。P19细胞系神经发生刺激可以在不形成聚集体的情况下进行,但在细胞培养中产生的神经元细胞数量减少三分之二。Monzo等人通过在单层15中培养P19细胞系,在P19细胞系中表现出神经发生诱导。虽然它们的方法相当方便,因为我们可以消除悬浮培养过程,但还需要进一步研究,以比较它们的方法与其他描述良好的方法。介质中 0.5 μM 的 RA 浓度在电镀后产生大量细胞聚集体以及神经元,而 RA 为 1 μM。还必须注意,在RA治疗期间,当大多数骨料附着在悬浮培养盘的底部时,我们无法观察到有效的神经发生。在手术开始时使用的P19细胞系的最佳数量是1 x 106,每10mL的分化介质。在神经发生诱导期间,P19细胞系形成大小不同的聚集体,甚至在培养基中发现单个细胞。为了克服这个问题,我们在15 mL管中自由落体1.5分钟后收集了细胞聚集体。我们发现,这种方法允许排除单个细胞的污染。还建议使用抗线粒药物(如细胞氨酸阿拉伯氨酸)进行神经元扩增,以长期培养抑制胶质细胞的广泛增殖23。
来自P19细胞系的神经元表达N-甲基-D-阿斯巴酸(NMDA)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异二氮丙酸酯(AMPA)/开未体(KA)类型24、25的异位性谷氨酸受体,以及功能β-氨基丁酸(GABA)受体25。因此,P19细胞系在控制神经元分化的分子机制研究中被广泛使用26、27、28。更重要的是,细胞移植29、30后未观察到肿瘤发育。
为此,对阿尔茨海默氏病17、18等神经退行性疾病的研究也使用P19细胞系进行,我们相信本研究开发的方法将起到阐明分子的作用。神经发育异常和神经退行性疾病的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了波兰国家科学中心(赠款No.UMO-2017/25/N/NZ3/01886)和KNOW(领先的国家研究中心)科学联盟"健康动物-安全食品",科学和高等教育部第05-1/KNOW2/2015
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
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