Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Syntes, karakterisering och tillämpning av superparamagnetiska järnoxid nanosonder för extrapulmonary tuberkulos Upptäckt

Published: February 16, 2020 doi: 10.3791/58227
Automatic Translation
1, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 2,5,9
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

Summary

För att förbättra serologiska diagnostiska tester för Mycobacterium tuberkulos antigener, utvecklade vi superparamagnetic järnoxid nanosonder för att upptäcka extrapulmonary tuberkulos.

Abstract

En molekylär bildsond bestående av superparamagnetiska järnoxid (SPIO) nanopartiklar och Mycobacterium tuberkulos ytantikroppar (MtbsAb) var syntetiseras för att förbättra bildåtergivningskänslighet för extrapulmonary tuberkulos (ETB). En SPIO nanosond syntetiserades och konjugerats med MtbsAb. Den renade SPIO-MtbsAb nanosonden kännetecknades med TEM och NMR. För att bestämma sondens inriktningsförmåga inkuberades SPIO-MtbsAb nanosonder med Mtb för in vitro-bildavbildningsanalyser och injicerades i Mtb-inokuerade möss för in vivoundersökning med magnetisk resonans (MR). Kontrastförbättringen minskning på magnetisk resonanstomografi (MRI) av MTB och THP1 celler visade proportionell mot SPIO-MtbsAb nanoprobe koncentration. Efter 30 min intravenös SPIO-MtbsAb nanosond injektion i Mtb-infekterade möss, var signalintensiteten i granulomatous området förbättras med 14-faldigi T2-viktade MR-bilder jämfört med den hos möss som får PBS injektion. MtbsAb nanosonder kan användas som en ny modalitet för ETB upptäckt.

Introduction

Globalt sett utgör extrapulmonary tuberkulos (ETB) en betydande andel av tuberkulos (tbc) fall. Ändå är ETB diagnos ofta missas eller försenas på grund av dess lömska kliniska presentation och dåliga resultat på diagnostiska tester; falska resultat inkluderar sputum utstryk negativt för syra-snabb bacilli, brist på granulomatous vävnad på histopathology, eller underlåtenhet att odla Mycobacterium tuberkulos (Mtb). I förhållande till typiska fall inträffar ETB mindre ofta och innebär lite befrielse av Mtb bacilli. Dessutom är det oftast lokaliseras på svåra att komma åt platser, såsom lymfkörtlar, lungsäcken och osteoartikulära områden1. Invasiva förfaranden för att erhålla adekvata kliniska prover, vilket gör bakteriologisk bekräftelse riskabel och svår, är därför nödvändiga2,3,4.

Kommersiellt tillgängliga antikroppsdetekteringstester för ETB är otillförlitliga för klinisk upptäckt på grund av deras breda känslighetsområde (0,00-1,00) och specificitet (0,59-1,00) för alla extrapulmonary platser tillsammans5. Enzymkopplade immunospot (ELISPOT) analyser för interferon-γ, kulturfiltrate protein (CFP), och tidig sekretorisk antigen mål (ESAT) har använts för att diagnostisera latent och aktiv TB. Resultaten varierar dock mellan olika sjukdomsplatser för diagnos av ETB6,7,8. Dessutom gav huden PPD (renat proteinderivat) och QuantiFERON-TB ofta falska negativa resultat9. QuantiFERON-TB-2G är en hel blod immun reaktivitet analys, som inte kräver ett prov från det drabbade organet och detta kan vara ett alternativt diagnostiskt verktyg6,10,11. Andra diagnostiska metoder som vanligtvis används för tbc hjärnhinneinflammation, såsom polymeras kedjereaktion, är fortfarande alltför okänsliga för att tryggt utesluta klinisk diagnos12,13. Dessa konventionella tester visar otillräcklig diagnostisk information för att upptäcka extrapulmonary infektion webbplats. Således krävs nya diagnostiska metoder kliniskt.

Molekylär avbildning syftar till att utforma nya verktyg som direkt kan skärmspecifika molekylära mål för sjukdomsprocesser in vivo14,15. Superparamagnetisk järnoxid (SPIO), en T2-viktad NMR kontrastmedel, kan avsevärt öka specificitet och känslighet magnetisk resonans (MR) imaging (MRI)16,17. Denna nya funktionella bildframställning modalitet kan exakt skissvävnad förändringar på molekylär nivå genom ligand-receptor interaktioner. I denna studie, en ny molekylär bildbehandling sond, bestående av SPIO nanopartiklar, var syntetiserad att konjuca med Mtb yta antikroppar (MtbsAb) för ETB diagnos. SPIO nanosonder är minimalt invasiva till vävnader och organ under undersökning18,19. Dessutom kan dessa nanosonder visa exakta MR-bilder vid låga koncentrationer på grund av deras paramagnetiska egenskaper. Dessutom uppträder SPIO-nanosonder framkalla minst allergiska reaktioner eftersom förekomsten av järnjoner är en del av normal fysiologi. Här utvärderades känsligheten och specificiteten hos SPIO-MtbsAb-nanosonderna som riktade sig mot ETB i både cell- och djurmodeller. Resultaten visade att nanosonderna var tillämpliga som ultrakänsliga bildmedel för ETB-diagnos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla protokoll om djurförsök följer standardrutinerna för djuruppfödning i laboratorium i enlighet med National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, 2011) och godkänns av djurvård och användningskommitté.

1. SPIO nanopartikelsyntes

  1. Förbered dextran-belagda järnoxid magnetiska nanopartiklar genom att kraftigt röra en blandning av dextran T-40 (5 ml; 50% w /w) och vattenhaltiga FeCl3× 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) och FeCl2× 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) lösningar i rumstemperatur.
  2. Lägg till NH4OH (10 ml; 7,5% v/v) snabbt.
  3. Rör om ytterligare den svarta fjädringen för 1 h; därefter centrifugerar vid 17 300 x g i 10 min och tar sedan bort aggregaten.
  4. Separera de slutliga SPIO-produkterna från obundna dextran T-40 genom gelfiltreringkromatografi20.
  5. Ladda reaktionsblandningen (total volym = 5 ml) i en 2,5 cm × 33 cm kolonn och elute med en buffertlösning som innehåller 0,1 M Na acetat och 0,15 M NaCl vid pH 7.0.
  6. Samla den renade dextran-belagda järnoxid magnetiska nanopartiklar i tomrummet volym och analys kolonnen eluates för järn och dextran på 330 och 490 nm med saltsyra och fenol / svavelsyra metoder20,respektive.

2. SPIO-MtbsAb syntes

  1. Syntetisera SPIO-konjugerat EDBE med tidigare rapporterade metoder21,22.
  2. Syntetisera SPIO-EDBE-succinic anhydride (SA).
    1. Rör om en alkalisk lösning (5 M NaOH; 10 ml)) av SPIO-EDBE och SA (1 g; 10 μmol) vid rumstemperatur i 24 timmar.
    2. Dialyze lösningen med 20 förändringar av 2 L av destillerat vatten med hjälp av molekylärt porösa membranrör (12.000-14.000 MW cutoff). 6 h för varje förändring.
  3. Tillsätt slutligen 100 μl SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml av Fe) till 400 μl 4,5 mg/mL MtbsAb för att syntetisera SPIO-MtbsAb med hjälp av 1-hydroxybenzotriazol och (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate som katalysatorer och rör om lösningen vid rumstemperatur för 24 h.
  4. Slutligen separera lösningarna från den obundna antikroppen genom gelfiltreringkromatografi.
  5. Ladda reaktionsblandningen (5 ml) på 2,5 cm × 33 cm kolonn och elute med hjälp av en PBS-buffert. Bekräfta Ab-nanopartikelkomplex (dvs. nanosond) med hjälp av en bicinchoninsyra protein analys kit23.

3. Partikelmorfologi observation och avslappning nivå mätning

  1. Undersök genomsnittlig partikelstorlek, morfologi och storleksfördelning med hjälp av transmissionselektronmikroskop vid en spänning på 100 kV.
    1. Drop-cast komposit spridning på en 200-mesh koppar rutnät och luft torr vid rumstemperatur innan du laddar den på mikroskopet.
  2. Mät avslappningstidsvärdena(T1 och T2)för nanosonderna med nmr-relaxometer vid 20 MHz och 37,0 °C ± 0,1 °C.
    1. Kalibrera relaxometern före varje mätning.
    2. Spela in r1 och r2 värden från de åtta datapunkter som genereras genom inversion-återhämtning och Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulssekvens, respektive, för att bestämma r1 och r2 relaxivities20.

4. Cellavbildning

  1. Odla mänskliga monocyter THP-1 i RPMI 1640 med 10% fetalt bovinserum, 50 μg/mL gentamycinsulfat, 100 enheter/mL penicillin G natrium, 100 μg streptomycinsulfat, och 0,25 μg/ml fungizone i en 5% CO 2-inkubator vid 37 °C.
  2. Inkubera SPIO-MtbsAb nanosonder (2 mM) med 106 koloniformningsenheter (CFU) av Mycobacterium bovis BCG förinkubarad med 1 × 107 aktiverade monocyter i mikrocentrifugrör (1 ml) i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C för 1 h.
  3. Centrifugrör en 200 x g och kassera supernatanten. Återupplösa pellets i mediet (200 μL).
  4. Skanna proverna med en snabb gradient ekopulssekvens (Repetitionstid (TR) = 500; Echo time(TE) = 20; Vändvinkel = 10°) genom 3,0-T MRI för att bestämma nanosondens specificitet och känslighet21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) inokulering

  1. Rekonstruera det lyofiliserade vaccinet eller bakteriebeståndet i Sautons medium och späd sedan ut beståndet med saline tills det är korrekt förspridd som tidigarebeskrivits 24.
  2. Inokulera en levande försvagad stam av M. bovis BCG, som erhållits från ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught stam; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) vid en volym av 0,1 ml/mus (dvs. 107 CFU) intradermally i vänster eller höger ryggscapular hud av möss, som beskrivs tidigare23. Injicera saline i möss som negativ kontroll. Övervaka djur dagligen efter BCG-inokulering.
  3. Offra djur 1 månad efter bakterieinokulering med hjälp av koldioxid dödshjälp. Skörda vävnaden från intradermala inokuleringsstället. Fixa vävnaden i 10% formalin och bädda in i paraffin för seriella sektioner på 5-10 μm. Fläckvävnadsektioner med hematoxylin/eosin och Ziehl-Neelsen fläckar för syrasnabba bakterier24 och med Berlin blått för järn25.

6. In vivo MRI

  1. Injicera ketamin (80 mg/kg kroppsvikt) och xylkotin (12 mg/kg kroppsvikt) subkutant i möss för djuranestesi.
  2. Injicera SPIO-TbsAb-sonder (2 nmol/200 μL) i svansvener av möss. MR bild möss före och omedelbart efter sond injektion och sedan var 5 min i 30 min för att förvärva T2-viktade snabba spin-echo bilder (TR = 3000; TE = 90; synfält = 8).
  3. Kvantitativt analysera alla MR-bilder med hjälp av signalintensitet (SI), en mätning av definierade regioner av intresse för jämförbara platser i en Mtb granulom centrum och ryggmuskeln intill ett granulomatområde.
  4. Beräkna relativa signalförbättringar med Hjälp av SI-mätningen före (SIpre; control) och 0-3 h efter (SIpost) injektion av kontrastmedel med hjälp av formeln

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100

    där SIpre är SI av lesion på förförbättrad skanning och SIpost är SI av lesion på efter förstärkt genomsökning21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SPIO-MtbsAb nanosondsyntes och karakterisering
SPIO nanopartiklar har utformats för att konjugera med MtbsAb. Dextranstabiliserades på ytan av SPIO nanopartiklar korslänkades av epichlorohydrin. SPIO nanopartiklar införlivades därefter med EDBE för att aktivera primära amin funktionella grupper vid dextran ändarna. SA konjugerats sedan för att bilda SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb nanosonder bildades i det sista steget genom konjugation av MtbsAb med SPIO-EDBE-SA i närvaro av kopplingsmedlen. TEM-bilden av SPIO-MtbsAb nanosonder(figur 1) visar att SPIO-MtbsAb nanosonderna hade ett välskingrat utseende. Den genomsnittliga storleken på SPIO-MtbsAb nanoprobe-kärnan var 3,8 ± 0,4 nm (200 partikelberäkning).

I vattenlösning var relaxivitetsvärdena, r1 och r2,av nanosonderna 23 ± 3 respektive 151 ± 8 mM-1s-1,respektive vid 20 MHz respektive 37,0 °C ± 0,1 °C. Förhållandet r1/r2 av SPIO-MtbsAb nanosonder liknade Resovist; R 1 respektive r2 av Resovist (26 respektive 164 mM-1s-1)var dock något högre än spio-MtbsAb nanosonder.

In vitro SPIO-MtbsAb nanosond karakterisering och bildbehandling
Först upptäckte vi M. bovis BCG, en syrasnabb bakterier, genom Ziehl-Neelsen färgning(figur 2A). Bakterierna isolerades och odlades sedan med sonder som innehåller järn, identifierbargenom Berlin blå färgning(figur 2B). Den MTB-inriktningsgraden för SPIO-MtbsAb nanoprobe fastställdes genom T2-vägd mri; negativ förbättring proportionerades till mängden avsökningar som är kopplade till bakteriecellen. Minskningen av SI i närvaro av nanosonderna inträffade på ett koncentrationsberoende sätt(figur 2C). Vid 2, 1 och 0,5 mM, de nanosonder som konjugerats med MTB uppvisade SI på 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51 och 257,33 ± 5,03, alla högre SI på 90,75 ± 2,47 för 1 mM nonconjugated nanoprobe. Jämfört med PBS (SI = 1073,43 ± 13,62) noterades nästan ingen signalreduktion i tb-gruppen (SI = 957,33 ± 12,53). Således riktade SPIO sonder specifikt Mtb bacilli; Dessutom minskade SI med en ökning av mängden SPIO-nanopartiklar på de förbättrade MR-bilderna.

På samma sätt noterades minskningarna av SI på förbättrade MR-bilder 1 h efter odlingen av THP-1 monocyter med nanosonderna. En signifikant minskning av SI i TB-gruppen noterades när 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58 ± 8,58) och 2 mM (SI = 104 ± 2,16) koncentrationer av nanosonderna användes jämfört med de grupper som administrerades med PBS (SI = 1005,33 ± 16,74) eller som inte administrerades med nanopr obe (SI = 991 ± 8,98). MRI SI-minskningen av MTB-grupperna för 1 och 2 mM nanosonder var jämförbar med den i den positiva nanosonden på 1 mM (SI = 112,33 ± 3,68). Enligt ovanstående resultat skulle Nanosonderna på SPIO-MtbsAb kunna hjälpa till att övervaka den nanosondaktiverade människohandeln med thp-1.

In vivo SPIO-MtbsAb nanoprobe imaging
Efter cellavbildning en bestämd vi effekten av in vivo MRI för ETB. SPIO-MtbsAb nanosonder injicerades intravenöst till Mtb-infekterade möss. En tydligt detekterbar MR-signal noterades i Mtb granulomatous-området 0,5 h efter injektionen. den högsta SI till bakgrund observerades dock efter 1 h injektion. En betydande minskning av MR-signalering noterades i Mtb granulomatous-området(figur 3). SI mättes före (SIpre) och efter (SIpost) kontrastmedel injektion. En timme efter sondinjektionen var Den T2-vägda förbättringen av signalreduktionen vid Mtb granulamatous områden(figur 3B)ungefär 14 gånger högre än vid kontrollplatserna(figur 3A; -1,68% ± 1,32% och -23,43% ± 7,24%; p < 0,001).

Histologisk och immunohistokemisk utvärdering av SPIO-MtbsAb nanosonder
En subkutan granulom utvecklades 1 månad efter infektion i C57BL/6 möss. Nya blod vascularization noterades inom dessa skador tillsammans med lymfocyter och epithelioid-makrofag aggregat. Den organiserade granulom hade vuxit successivt (figur 4A). Korrelationen mellan TB-lesioner med SPIO-MtbsAb MR-signaler fastställdes vidare genom den immunohistokemiska reaktionen av Mtb ytantigen med anti-MtbsAb. Positiva MtbsAb uttryck avslöjades i granulomatous områden(figur 4B),med syrasnabb bacilli färgning positivt vid lesion plats(figur 4C). Berlinblå, en järnpositiv fläck i järnhalten i Paris, användes för att bestämma sondernas känslighet för Mtb. Berlinblå-positiv SPIO-sond hittades på samma plats som MtbsAb(figur 4D). Alla colocalized par visades i figur 4AD.

Figure 1
Figur 1: Genomsnittlig kärnstorlek på SPIO-MtbsAb nanosonder i TEM. Den genomsnittliga storleken på SPIO-MtbsAb nanoprobe-kärnan var 3,8 ± 0,4 nm, mätt med Hjälp av TEM-bildanalys (200 partikelberäkning). Skalstång = 15 nm. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: In vitro karakterisering av SPIO-MtbsAb nanosond. Den syrasnabba bacilli identifieras genom (A) Ziehl-Neelsen färgning och (B) konjugation av järnjärn et av nanosonden till bakterier som identifierats genom Berlin blå färgning. (C)T2-vägd mri uppvisar negativ förbättring efter att Nanosonderna spio-MtbsAb inkuberas med Mtb. Eliminering av SI som inträffar dosberoende efter att nanosonderna har införlivats med Mtb: (1) 90,75 ± 2,47 (1,0 m MM Probe). 2. 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM Probe). (3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM Probe). (4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Probe). (5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM Probe). (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). Ingen detekterbar signalreduktion noteras i PBS-kontrollgruppen. (D)Dosberoende negativ förbättring i THP-1 monocyter 1 h efter inkubation med nanosonderna. Skalstänger i (C) och (D) är 5 mm. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: In vivo SPIO-MtbsAb nanosonder i subkutana ETB-lesioner av C57BL/6 mus. (A)Kontroll och (B)Mtb granulomatous områden. En betydande 14-faldig minskning av MR-signalering finns i Mtb granulomatous områden jämfört med kontrollområdena 1 h efter sond administrering (-1,68% ± 1,32% jämfört med -23,43% ± 7,24%, p < 0,001). Resultaten ges som medel ± SD. Statistiska jämförelser använde tvåsidiga Students t-tester. p < 0,05 ansågs vara betydande. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Korrelationer mellan histologi, immunohistokemi, syrasnabb och Berlinblå färgning. Histologi av Mtb granulomatous områden främst visar lymfocyter och epithelioid makrofager. Neovascularization och riklig aggregering av lymfocyter och epithelioid makrofager observerats i dessa skador. (A)Organiserade granulomer verkar utvecklas successivt. (B)Immunohistochemical färgning som visar MtbsAb uttryck i granulomatous skador, medan (C)syrasnabb bacilli är utspridda inom samma områden. (D)Berlin blå färgning SPIO sonder finns i colocalized MtbsAb områden. Berlin blå färgning för järn iller visar sondkonjugation till Mtb. Skala barer är 100 μm. Denna siffra har ändrats från vår tidigare studie26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I likhet med relevanta studier visade våra resultat avseende SPIO-MtbsAb nanosonder en betydande specificitet för Mtb27,28. Den subkutana Mtb granulom hittades 1 månad efter TB injektion i musmodellerna. Den typiska TB granulomatous histologi resultaten ingår lymfocyter infiltration, förekomst av epithelioid makrofager, och karvaskulärisering. Syrasnabb bacilli var utspridda i TB skador, bekräftar MTBsAb immunohistochemistry resultaten. Detta indikerade en immunologisk reaktion mellan Mtb ytantigen och MtbsAb. Berlinblått lyfte fram samma områden med MtbsAb, vilket bekräftade sondernas specificitet för konjugation med syrasnabb Mtb.

Noterbart är omfattningen av negativ kontrastförbättring på MRI för Mtb och monocytiska THP1-celler proportionell mot Koncentrationen sPIO-MtbsAb nanoprobe. När möss med Mtb granulom administrerades SPIO-MtbsAb nanosonder noterades en 14-faldig signalreduktion vid granulomatous-stället på T2-viktade MR-bilder jämfört med ett motstående ställe med PBS-injektion. Detta indikerar en betydande ansamling av kontrastmedlet. Resultaten visar en möjlighet att få specifik inriktning på kontrastmedel, vilket kan minska doskravet för klinisk diagnos.

Våra resultat tyder på att dessa nanosonder ackumulerar en påvisbar volym i Mtb granulomatous skador. Dessa resultat kan bekräftas genom att utveckla en SPIO nanosond med anti-hMtbsAb. Eftersom SPIO: s magnetiska järnoxid kärna har tillämpats för att inducera T2 förkortning i MRI kontrast medel, resultaten tyder på en praktisk och noninvasive strategi för att upptäcka liknande cellbeteenden för kliniska diagnosapplikationer.

Här tillhandahåller vi protokollet bestående av 2 delar: avsnitten 4 till 6 är cell- och djuravbildning. Teknikerna omfattar cellodling, djurförsök och optisk avbildning. Avsnitten 1 till 3 är sondsyntheses. Vissa kritiska steg hjälper till att replikera experimentet. Det kritiska steget i SPIO nanopartikelsyntes är att förbereda en dextran-belagda järnoxid magnetiska nanopartiklar; det är viktigt att kraftfullt röra och helt blanda dextran T-40, vattenhaltiga FeCl3-6H2O, och FeCl2-4H2O lösningar vid rumstemperatur. Det kritiska steget för avsnitt 2, SPIO-MtbsAb syntes, konjugerar MtbsAb till SPIO-EDBE-SA för att syntetisera SPIO-MtbsAb. För att välja lämpliga katalysatorer och på lämpligt sätt rör lösningen vid rumstemperatur är kritiska också. Och det kritiska steget för avsnitt 3, Partikelmorfologi observation och avslappning nivå mätning, är att kalibrera relaxometern före varje mätning. För att exakt beräkna storleken på sonder, en kalibrering av relaxometer är avgörande också.

I denna studie användes M. bovis BCG och kanin anti-Mtb. Korsreaktivitet av nötkreatur och kanin källor ansågs mild, även om uppgifterna visade att MtbsAb-konjugerat SPIO visade starka interaktioner med M. bovis BCG. Vårt resultat föreslog att SPIO nanosonder rikta TB specifikt. Inkubationsinkubations- och Mtb-bakterier visade ett negativt förbättringssätt dosberoende, medan minskningen av den förbättring som observerats för SPIO-nanosonder på MRI korrelerades med förekomsten av SPIO-partiklar. Baserat på våra data, ytterligare forskning för att undersöka möjliga antikroppskonjugation metoder för att förbättra specificitet nanosonden skulle vara välkomna.

Tidigare studier visar att SPIO visar minimal cytotoxicitet utan att ändra cellaktiviteten vid en koncentration som används i denna studie29,30. I samförstånd med tidigare forskning visade våra resultat minimal effekt av SPIO-nanosonder till THP-1-celler. THP-1 celler inkuberades med SPIO nanoprobes med bakterier konjugation i 1 timme. SI presenterade en betydande nedgång i Mtb-grupperna med en koncentration på 1 mM eller 2 mM nanosonder, jämfört med kontrollgrupp utan nanosondbehandling eller pbs ensam. Resultatet stöder säkerheten för SPIO nanoprobe, och fler studier som tillämpar andra bakteriella belastningar för att validera känsligheten hos nanosonden är välkomna.

En begränsning i vår studie var att vi inte kvantifierabiodistributionen av SPIO-MtbsAb-nanosonden hos möss. Dessutom undersökte vi inte den intravande halveringstiden och levernedfallet av nanosonden, vilket kan förändra utläggningstiden för sonderna för THP-1-celler som ligger vid Mtb-lesionerna. Ytterligare forskning om biologisk nedbrytning är berättigad. Dessutom kunde MRI inte skilja om SPIO nanosonder specifikt kunde binda till bakterier eller monocyter eller om dessa sonder var endocytosed.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett tydligt och genomförbart protokoll för att förbereda och karakterisera biokompatibla SPIO-MtbsAb nanosonder. Dessa nanosonder är hydrofila och skingrar sig väl under fysiologiska förhållanden; de är minimalt cytotoxiska vid låga koncentrationer. Dessa SPIO-MtbsAb nanoprobes möjliggör också inriktning och upptäckt av Mtb-infektion, vilket framgår av våra in vitro- och in vivo-studier. Således kan SPIO-MtbsAb nanoprobes appliceras som MRI kontrastmedel för ETB upptäckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av författarna har något egenintresse av de material som undersökts i denna studie.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från ekonomiministeriet Taiwan (beviljar NSC-101-2120-M-038-001, DE FLESTA 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) för att utföra detta forskningsarbete. Detta manuskript redigerades av Wallace Academic Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Tags

Medicin Extrapulmonary molekylär avbildning Mycobaterium tuberkulos nanoprobe diagnos Berlin blå fläck Ziehl-Neelsen fläck.
Syntes, karakterisering och tillämpning av superparamagnetiska järnoxid nanosonder för extrapulmonary tuberkulos Upptäckt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C.… More

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter