Summary
Om de serologische diagnostische tests voor Mycobacterium tuberculoseantigenen te verbeteren, ontwikkelden we superparamagnetische ijzeroxide nanoprobes om extrapulmonale tuberculose op te sporen.
Abstract
Een moleculaire imaging sonde bestaande uit superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes en Mycobacterium tuberculose oppervlak antilichaam (MtbsAb) werd gesynthetiseerd om de beeldgevoeligheid voor extrapulmonale tuberculose (ETB) te verbeteren. Een SPIO nanoprobe werd gesynthetiseerd en geconjugeerd met MtbsAb. De gezuiverde SPIO-MtbsAb nanoprobe werd gekenmerkt met BEHULP VAN TEM en NMR. Om het targetingvermogen van de sonde te bepalen, werden SPIO-MtbsAb nanosondes geïncubeerd met Mtb voor in vitro imaging tests en geïnjecteerd in Mtb-ingeënte muizen voor in vivo onderzoek met magnetische resonantie (MR). De contrastverbeteringsreductie op magnetic resonance imaging (MRI) van Mtb- en THP1-cellen toonde evenredig aan de SPIO-MtbsAb nanosondeconcentratie. Na 30 min van intraveneuze SPIO-MtbsAb nanoprobe injectie in Mtb-geïnfecteerde muizen, werd de signaalintensiteit van de granulomatous site verbeterd met 14-voudige in de T2-gewogen MR-beelden in vergelijking met die bij muizen die PBS-injectie kregen. De MtbsAb nanoprobes kunnen worden gebruikt als een nieuwe modaliteit voor ETB detectie.
Introduction
Wereldwijd vertegenwoordigt extrapulmonale tuberculose (ETB) een aanzienlijk deel van de tuberculosegevallen (tbc). Niettemin wordt de ETB-diagnose vaak gemist of vertraagd vanwege de verraderlijke klinische presentatie en slechte prestaties op diagnostische tests; valse resultaten omvatten sputum uitstrijkjes negatief voor zuur-snelle bacillen, gebrek aan granulomatous weefsel op histopathologie, of het niet kweken van Mycobacterium tuberculose (Mtb). In vergelijking met typische gevallen komt ETB minder vaak voor en gaat het om weinig bevrijding van de Mtb bacilli. Bovendien is het meestal gelokaliseerd op moeilijk toegankelijke locaties, zoals lymfeklieren, pleura en osteoarticulaire gebieden1. Invasieve procedures voor het verkrijgen van adequate klinische specimens, waardoor bacteriologische bevestiging riskant en moeilijk is, zijn dus essentieel2,3,4.
Commercieel beschikbare antilichaamdetectietests voor ETB zijn onbetrouwbaar voor klinische detectie vanwege hun brede gevoeligheidsbereik (0,00-1,00) en specificiteit (0,59-1,00) voor alle extrapulmonale locaties gecombineerd5. Enzymgebonden immunospot (ELISPOT) testen voor interferon-γ, kweekfiltraateiwit (GVB) en vroege secretoire antigene target (ESAT) zijn gebruikt voor het diagnosticeren van latente en actieve tbc. De resultaten variëren echter tussen de verschillende ziekteplaatsen voor de diagnose van ETB6,7,8. Bovendien leverden de PPD van de huid (gezuiverd eiwitderivaat) en QuantiFERON-TB vaak valse negatieve resultaten9. QuantiFERON-TB-2G is een heel bloed immuun reactiviteit test, die geen monster van het getroffen orgaan vereist en dit kan een alternatief diagnostisch instrument6,10,11. Andere diagnostische methoden die doorgaans worden gebruikt voor meningitis bij tbc, zoals polymerasekettingreactie, zijn nog steeds te ongevoelig om klinische diagnose 12,13met vertrouwen uit tesluiten. Deze conventionele tests tonen onvoldoende diagnostische informatie om de extrapulmonale infectie site te ontdekken. Zo zijn nieuwe diagnostische modaliteiten klinisch vereist.
Moleculaire beeldvorming is gericht op het ontwerpen van nieuwe tools die specifieke moleculaire doelen van ziekteprocessen in vivo14,15direct kunnen screenen. Superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), een T2-gewogen NMR contrastmiddel, kan de specificiteit en gevoeligheid van magnetische resonantie (MR) beeldvorming (MRI)16,17aanzienlijk verbeteren. Deze nieuwe functionele beeldvormingmodaliteit kan weefselveranderingen op moleculair niveau nauwkeurig schetsen door middel van ligandreceptorinteracties. In deze studie werd een nieuwe moleculaire beeldsonde, bestaande uit SPIO nanodeeltjes, gesynthetiseerd om te conjuging met Mtb oppervlakteantilichaam (MtbsAb) voor ETB diagnose. SPIO nanoprobes zijn minimaal invasief voor weefsels en lichamen in onderzoek18,19. Bovendien kunnen deze nanosondes nauwkeurige MR-beelden aantonen bij lage concentraties vanwege hun paramagnetische eigenschappen. Bovendien lijken SPIO-nanosondes de minste allergische reacties uit te lokken omdat de aanwezigheid van ijzerionen deel uitmaakt van de normale fysiologie. Hier werden de gevoeligheid en specificiteit van de SPIO-MtbsAb nanoprobes gericht op ETB geëvalueerd in zowel cel- als diermodellen. De resultaten toonden aan dat de nanosondes toepasbaar waren als ultragevoelige beeldvormingsmiddelen voor etb-diagnose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocolmet betrekking tot dierexperiment volgt de standaard werkprocedures voor de veeteelt in het laboratorium in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, 2011) en is goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik.
1. SPIO nanodeeltjessynthese
- Bereid met dextran-gecoate ijzeroxide magnetische nanodeeltjes door krachtig roeren van een mengsel van dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) en waterige FeCl3×6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) en FeCl2×4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) oplossingen bij kamertemperatuur.
- Voeg nh4OH (10 mL; 7,5% v/v) snel toe.
- Roer de zwarte vering verder 1 uur; centrifugeer vervolgens bij 17.300 x g voor 10 min en verwijder vervolgens de aggregaten.
- Scheid de uiteindelijke SPIO-producten van unbound dextran T-40 door gelfiltratiechromatografie20.
- Laad het reactiemengsel (totaal volume = 5 mL) in een kolom van 2,5 cm × 33 cm en elute met een bufferoplossing met 0,1 M Na acetaat en 0,15 M NaCl bij pH 7.0.
- Verzamel de gezuiverde met dextran gecoate magnetische nanodeeltjes met een ijzeroxide in het lege volume en test de kolom ellaat voor ijzer en dextran op 330 en 490 nm met behulp van zoutzuur en de fenol/zwavelzuurmethoden20, respectievelijk.
2. SPIO-MtbsAb synthese
- Synthetiseren SPIO-geconjugeerde EDBE met behulp van eerder gerapporteerde methoden21,22.
- Synthetiseren SPIO-EDBE-succinische anhydride (SA).
- Roer een alkalische oplossing (5 M NaOH; 10 mL)) van SPIO-EDBE en SA (1 g; 10 μmol) bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
- Dialyze de oplossing met 20 veranderingen van 2 L gedestilleerd water met behulp van moleculaire poreuze membraan buizen (12.000-14.000 MW cutoff). 6 uur voor elke verandering.
- Voeg ten slotte 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL Fe) toe aan 400 μL van 4,5 mg/mL MtbsAb om SPIO-MtbsAb te synthetiseren met behulp van 1-hydroxybenzotriazole en (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosfonium hexafluorosfosfaat als katalysatoren en roer de oplossing bij kamertemperatuur voor 24 uur.
- Tot slot, scheiden van de oplossingen van de ongebonden antilichaam door middel van gel filtratie chromatografie.
- Laad het reactiemengsel (5 mL) op 2,5 cm × 33 cm kolom en uitsteken met behulp van een PBS-buffer. Bevestig Ab-nanodeeltjes complex (dat wil zeggen, nanoprobe) met behulp van een bicinchonine zuur eiwittest kit23.
3. Deeltjesmorologie observatie en ontspanningslaag meting
- Onderzoek de gemiddelde deeltjesgrootte, morfologie en grootteverdeling met behulp van transmissieelektronenmicroscoop bij een spanning van 100 kV.
- Drop-cast de composiet dispersie op een 200-mesh koperen raster en lucht drogen bij kamertemperatuur alvorens het te laden op de microscoop.
- Meet de ontspanningstijdwaarden (T1 en T2) van de nanosondes met behulp van de NMR-relaxometer op 20 MHz en 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Kalibreer de relaxometer voor elke meting.
- Neem de r1 en r2 waarden van de acht gegevens punten gegenereerd door inversie-herstel en de Carr-Purcell-Meiboom-Gill puls sequentie, respectievelijk, om te bepalen r1 en r2 relaxivities20.
4. Celbeeldvorming
- Cultiveren van menselijke monocyten THP-1 in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum, 50 μg/mL gentamycinesulfaat, 100 eenheden/mL penicilline G natrium, 100 μg streptomycinesulfaat en 0,25 μg/mL fungizone in een 5% CO2 incubator bij 37 °C.
- Incubeer SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) met 106 kolonievormende eenheden (CFU) van Mycobacterium bovis BCG pregeïncubated met 1 × 107 geactiveerde monocyten in microcentrifugebuizen (1 mL) in een 5% CO2 incubator bij 37 °C gedurende 1 h.
- Centrifugeer buizen bij 200 x g en gooi de supernatant weg. Pellets in het medium (200 μL) opnieuw oplossen.
- Scan de monsters met behulp van een snelle gradiënt echo puls sequentie (Herhaling tijd (TR) = 500; Echotijd(TE) = 20; Flip hoek = 10°) door middel van 3.0-T MRI om de specificiteit en gevoeligheid van de nanosonde te bepalen21,22.
5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) inenting
- Reconstrueren de lyophilized vaccin of bacteriële voorraad in medium Sauton's en vervolgens verdunnen van de voorraad met zoutlijn tot goed verspreid zoals eerder beschreven24.
- Inenting een levende verzwakte stam van M. bovis BCG, verkregen uit ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught stam; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) bij een volume van 0,1 mL/muis (d.w.z. 107 CFU) intradermally in de linker of rechter rugvormige scapulaire huid van muizen, zoals eerder beschreven23. Injecteer zout in muizen als negatieve controle. Controleer dieren dagelijks na BCG-inenting.
- Offer dieren 1 maand na bacteriën inenting met behulp van kooldioxide euthanasie. Oogst het weefsel van de intradermale inentingsplaats. Fix het weefsel in 10% formaline en insluiten in paraffine voor seriële secties op 5-10 μm. Vlek weefsel secties met de hematoxyline / eosine en Ziehl-Neelsen vlekken voor zuur-snelle bacteriën24 en met Berlijn blauw voor ijzer25.
6. In vivo MRI
- Injecteer ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12 mg/kg lichaamsgewicht) onderhuids in muizen voor dieranesthesie.
- Injecteer SPIO-TbsAb sondes (2 nmol/200 μL) in staartaderen van muizen. MR beeld muizen voor en onmiddellijk na sonde injectie en vervolgens elke 5 min voor 30 min te verwerven T2-gewogen snelle spin-echo beelden (TR = 3000; TE = 90; gezichtsveld = 8).
- Kwantitatief analyseren alle MR beelden met behulp van signaalintensiteit (SI), een meting van gedefinieerde regio's van belang in vergelijkbare locaties van een Mtb granuloma centrum en de rugspier grenzend aan een granulomatous gebied.
- Bereken relatieve signaalverbeteringen met behulp van de SI-meting vóór (SIpre; controle) en 0-3 uur na (SIpost) injectie van de contrastmiddelen met behulp van de formule
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
waar SIpre is de SI van de laesie op de vooraf verbeterde scan en SIpost is de SI van de laesie op de post-enhanced scan21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SPIO-MtbsAb nanosonde synthese en karakterisering
SPIO nanodeeltjes zijn ontworpen om samen te voegen met MtbsAb. De dextran gestabiliseerd op het oppervlak van SPIO nanodeeltjes werd gekruist door epichloorhydrine. SPIO nanodeeltjes werden vervolgens opgenomen met EDBE om primaire amine functionele groepen te activeren aan de dextran uiteinden. SA werd vervolgens geconjugeerd om SPIO-EDBE-SA te vormen. SPIO-MtbsAb nanoprobes vormden zich in de laatste stap door de vervoeging van MtbsAb met SPIO-EDBE-SA in aanwezigheid van de koppelingsagenten. Het TEM-beeld van SPIO-MtbsAb nanoprobes (Figuur 1) toont aan dat de SPIO-MtbsAb nanoprobes een goed verspreid uiterlijk hadden. De gemiddelde grootte van de SPIO-MtbsAb nanosonde kern was 3,8 ± 0,4 nm (200 deeltjesberekening).
In waterige oplossing waren de relaxiviteitswaarden, r1 en r2, van de nanosondes respectievelijk 23 ± 3 en 151 ± 8 mM-1s-1,op 20 MHz en 37,0 °C ± 0,1 °C. De r1/r2 verhouding van SPIO-MtbsAb nanoprobes was vergelijkbaar met die van Resovist; r 1 en r2 van Resovist (respectievelijk 26 en 164 mM-1s-1)waren iets hoger dan die van SPIO-MtbsAb nanoprobes.
In vitro SPIO-MtbsAb nanoprobe karakterisering en beeldvorming
Eerst ontdekten we M. bovis BCG, een zuursnelle bacterie, via Ziehl-Neelsen vlekken(figuur 2A). De bacteriën werden geïsoleerd en vervolgens gekweekt met sondes met ijzer, herkenbaar door Berlijnse blauwe vlekken (Figuur 2B). De Mtb-targeting graad van SPIO-MtbsAb nanoprobe werd bepaald door middel van T2-gewogen MRI; negatieve verbetering werd geproportioneerd aan de hoeveelheid sondes die aan de bacteriële cel vastzaten. De daling van de SI in aanwezigheid van de nanosondes trad op concentratieafhankelijke wijze op (figuur 2C). Op 2, 1 en 0,5 mM vertoonden de nanosondes die met Mtb waren geconjugeerd SI's van respectievelijk 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51 en 257,33 ± 5,03, allemaal hoger de SI van 90,75 ± 2,47 voor 1 mM nonconjugated nanoprobe. In vergelijking met PBS (SI = 1073,43 ± 13,62) werd bijna geen signaalreductie waargenomen in de tb-only groep (SI = 957,33 ± 12,53). Dus, SPIO sondes specifiek gericht Mtb bacilli; bovendien, op de verbeterde MR-beelden, de SI daalde met een toename van de hoeveelheid SPIO nanodeeltjes.
Op dezelfde manier werden de verminderingen van SI op verbeterde MR-beelden opgemerkt 1 uur na het kweken van THP-1 monocyten met de nanosondes. Een aanzienlijke vermindering van de SI van de TB-groep werd opgemerkt toen 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58) en 2 mM (SI = 104 ± 2,16) concentraties van de nanosondes werden gebruikt in vergelijking met de groepen die uitsluitend met PBS werden toegediend (SI = 1005,33 ± 16,74) of niet met de nanopr werden toegediend obe (SI = 991 ± 8,98). MRI SI-reductie in de Mtb-groepen voor 1 en 2 mM nanoprobes was vergelijkbaar met die in de positieve 1 mM nanoprobe alleen groep (SI = 112,33 ± 3,68). Volgens de bovenstaande resultaten, de SPIO-MtbsAb nanoprobes kunnen helpen bij het toezicht op de nanosonde-geactiveerde THP-1 monocyten handel.
In vivo SPIO-MtbsAb nanoprobe imaging
Na celbeeldvorming hebben we de werkzaamheid van in vivo MRI voor ETB vastgesteld. SPIO-MtbsAb nanosondes werden intraveneus geïnjecteerd aan mtb-geïnfecteerde muizen. In het mtb-granulomatousgebied werd na injectie een duidelijk detecteerbaar MR-signaal opgemerkt; echter, de hoogste SI naar de achtergrond werd waargenomen na 1 uur van de injectie. In het mtb-granulomatousgebied(figuur 3) werd een aanzienlijke vermindering van de MR-signalering geconstateerd . SI werd gemeten vóór (SIpre) en na (SIpost) contrastagentinjectie. Een uur na de injectie van de sonde was de T2-gewogen verbetering van de signaalreductie in de mtb granulamatousgebieden (figuur 3B) ongeveer 14 keer hoger dan die op de controleplaatsen (figuur 3A; -1,68% ± 1,32% en -23,43% ± 7,24%; p < 0,001).
Histologische en immunohistochemische evaluatie van SPIO-MtbsAb nanoprobes
Een onderhuids granuloma werd ontwikkeld 1 maand na infectie bij C57BL/6 muizen. Nieuwe bloedvascularisatie werd opgemerkt in deze laesies, samen met lymfocyten en epithelioïde-macrofaag aggregaten. Het georganiseerde granuloma was geleidelijk gegroeid (figuur 4A). De correlatie van tb laesies met SPIO-MtbsAb MR-signalen werd verder bepaald door de immunohistochemische reactie van Mtb-oppervlakteantigeen met anti-MtbsAb. Positieve MtbsAb expressie werd onthuld in de granulomatous gebieden (Figuur 4B), met zuur-snelle bacilli kleuring positief op de laesie site (figuur 4C). Berlin blue, een ferric ijzer-positieve vlek, werd gebruikt om de gevoeligheid van de sondes te bepalen voor Mtb. Berlin blauw-positieve SPIO sonde werd gevonden op dezelfde locatie als MtbsAb (Figuur 4D). Alle geco-gelokaliseerde paren werden weergegeven in figuur 4A-D.
Figuur 1: Gemiddelde kerngrootte van SPIO-MtbsAb nanoprobes in TEM. De gemiddelde grootte van de SPIO-MtbsAb nanosonde kern was 3,8 ± 0,4 nm, gemeten met behulp van TEM-beeldanalyse (200 deeltjesberekening). Schaalbalk = 15 nm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige studie26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: In vitro karakterisering van SPIO-MtbsAb nanoprobe. De zuursnelle bacillen worden geïdentificeerd door (A) Ziehl-Neelsen kleuring en (B) de vervoeging van het ijzer van de nanosonde aan bacteriën geïdentificeerd door Berlijn blauwe vlekken. (C) T2-gewogen MRI die negatieve verbetering weergeeft nadat de SPIO-MtbsAb nanosondes zijn geïncubeerd met Mtb. Eliminatie van SI die dosisafhankelijk optreedt na de opname van de nanosondes met Mtb: (1) 90,75 ± 2,47 (1,0 mM Probe); (2) 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM Probe); (3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM Probe); (4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Probe); (5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM Probe); (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). Geen detecteerbare signaalreductie opgemerkt in de PBS-controlegroep. (D) Dosisafhankelijke negatieve verbetering in THP-1 monocyten 1 h na incubatie met de nanosondes. Schaalstaven in (C) en (D) zijn 5 mm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige studie26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: In vivo SPIO-MtbsAb nanoprobes in onderhuidse ETB laesies van C57BL/6 muis. (A) Controle en (B) Mtb granulomatous gebieden. Een significante 14-voudige vermindering van MR-signalering is te vinden in de Mtb granulomatous gebieden in vergelijking met de controlegebieden 1 uur na sonde toediening (-1,68% ± 1,32% vs. -23,43% ± 7,24%, p < 0,001). Resultaten worden gegeven als middelen ± SDs. Statistische vergelijkingen gebruikt twee-tailed Student's t-tests. p < 0,05 werd als significant beschouwd. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige studie26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Correlaties van histologie, immunohistochemie, zuursnelle en Berlijnse blauwe vlekken. Histologie van Mtb granulomatous gebieden die voornamelijk lymfocyten en epithelioïde macrofagen demonstreren. Neovascularisatie en overvloedige aggregatie van lymfocyten en epithelioïde macrofagen waargenomen in deze laesies. (A) Georganiseerde granulomen die zich geleidelijk lijken te ontwikkelen. (B) Immunohistochemische kleuring die MtbsAb-expressie in de granulomatouslaesies aantoont, terwijl (C)zuursnelle bacillen in dezelfde gebieden worden verspreid. (D) Berlijn blauwe vlekken SPIO sondes zijn te vinden in de co-gelokaliseerde MtbsAb gebieden. Berlijnse blauwe vlekken voor ijzer toont sondevervoeging aan Mtb. De maten zijn 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van onze vorige studie26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Net als bij relevante studies toonden onze bevindingen met betrekking tot SPIO-MtbsAb nanoprobes een significante specificiteit aan voor Mtb27,28. De onderhuidse Mtb granuloma werd gevonden 1 maand na tb injectie in de muis modellen. De typische tbc granulomatous histologie bevindingen opgenomen lymfocyten infiltratie, aanwezigheid van epithelioïde macrofagen, en neovascularisatie. Zuursnelle bacillen werden verspreid in de tb laesies, die de mtbsAb immunohistochemie bevindingen bevestigden. Dit duidde op een immunologische reactie tussen Mtb oppervlakteantigeen en MtbsAb. Berlin blue benadrukte dezelfde gebieden met MtbsAb, wat de specificiteit van de sondes voor vervoeging met zuursnelle Mtb bevestigde.
Met name de omvang van negatieve contrastverbetering op MRI voor Mtb- en monocytische THP1-cellen was evenredig met de SPIO-MtbsAb nanosondeconcentratie. Wanneer muizen met Mtb granulomen SPIO-MtbsAb nanoprobes werden toegediend, werd een 14-voudige signaalreductie op de granulomatoussite genoteerd op T2-gewogen MR-beelden in vergelijking met een tegengestelde locatie met PBS-injectie. Dit duidt op een aanzienlijke accumulatie van het contrastmiddel. De resultaten tonen een mogelijkheid aan voor het verkrijgen van specifieke targeting van contrastmiddel, wat de dosisvereiste voor klinische diagnose zou kunnen verminderen.
Onze bevindingen geven aan dat deze nanosondes een detecteerbaar volume in Mtb granulomatous laesies accumuleren. Deze resultaten kunnen worden bevestigd door het ontwikkelen van een SPIO nanoprobe met behulp van anti-hMtbsAb. Aangezien de magnetische ijzeroxidekern van de SPIO is toegepast om T2-verkorting in MRI-contrastmiddelen te induceren, suggereren de bevindingen een praktische en niet-invasieve benadering om vergelijkbaar celgedrag voor klinische diagnosetoepassingen te detecteren.
Hier bieden we het protocol bestaande uit 2 delen: secties 4 tot en met 6 zijn cel- en dierbeeldvorming. De technieken hebben betrekking op de celteelt, dierproeven en optische beeldvorming. De secties 1 tot en met 3 zijn sondesyntheses. Sommige kritieke stappen helpen om het experiment te repliceren. De kritieke stap van SPIO nanodeeltjessynthese is het voorbereiden van een dextran-gecoate ijzeroxide magnetische nanodeeltjes; het is cruciaal om krachtig te roeren en volledig mengen van de dextran T-40, waterige FeCl3-6H2O, en FeCl2-4H2O oplossingen bij een kamertemperatuur. De kritieke stap voor sectie 2, SPIO-MtbsAb synthese, is het vervoegen van MtbsAb aan SPIO-EDBE-SA om SPIO-MtbsAb synthetiseren. Om de juiste katalysatoren te selecteren en de oplossing bij kamertemperatuur adequaat te roeren, zijn ze ook van cruciaal belang. En de kritische stap voor sectie 3, Deeltjesmorologie observatie en ontspanning tier meting, is het kalibreren van de relaxometer voor elke meting. Om de grootte van sondes nauwkeurig te berekenen, is ook een kalibratie van de relaxometer cruciaal.
In deze studie werden M. bovis BCG en konijn anti-Mtb gebruikt. De kruisreactiviteit van runder- en konijnenbronnen werd als mild beschouwd, hoewel uit de gegevens bleek dat MtbsAb-geconjugeerde SPIO sterke interacties met M. bovis BCG aan het licht bracht. Onze bevinding suggereerde dat SPIO nanoprobes specifiek op TBC richten. De incubatie van nanosonde en Mtb bacteriën toonde een negatieve verbetering manier dosis-afhankelijk, terwijl de daling van de verbetering waargenomen voor SPIO nanoprobes op MRI was gecorreleerd met het bestaan van SPIO deeltjes. Op basis van onze gegevens zou verder onderzoek naar mogelijke antilichaamvervoegingsbenaderingen om de specificiteit van de nanosonde te verbeteren welkom zijn.
Eerdere studies tonen aan dat SPIO een minimale cytotoxiciteit vertoont zonder de celactiviteit te veranderen bij een concentratie die in deze studie wordt gebruikt29,30. In overeenstemming met voorafgaand onderzoek, onze resultaten aangetoond minimaal effect van SPIO nanoprobes thp-1 cellen. THP-1 cellen werden geïncubeerd met SPIO nanoprobes met bacteriën vervoeging gedurende 1 uur. SI presenteerde een aanzienlijke daling in de Mtb-groepen met een concentratie van 1 mM of 2 mM nanoprobes, in vergelijking met de controlegroep zonder nanosondebehandeling of PBS alleen. Het resultaat ondersteunt de veiligheid van de SPIO nanoprobe, en meer studies die andere bacteriële belastingen toepassen om de gevoeligheid van de nanosonde te valideren, zijn welkom.
Een beperking van onze studie was dat we de biodistributie van de SPIO-MtbsAb nanoprobe bij muizen niet hebben kwantificeren. Bovendien hebben we de intravasculaire halflife en leverdepositie van de nanosonde niet onderzocht, wat de blootstellende tijd van de sondes naar THP-1 cellen op de Mtb laesies zou kunnen veranderen. Verder onderzoek naar biologische afbraak is gerechtvaardigd. Bovendien kon MRI niet onderscheiden of SPIO nanoprobes specifiek kunnen binden aan bacteriën of monocyten of dat deze sondes waren endocytosed.
Tot slot hebben we een duidelijk en haalbaar protocol ontwikkeld om biocompatibele SPIO-MtbsAb nanoprobes voor te bereiden en te karakteriseren. Deze nanosondes zijn hydrofiel en verspreiden zich goed onder fysiologische omstandigheden; ze zijn minimaal cytotoxisch bij lage concentraties. Ook deze SPIO-MtbsAb nanoprobes maken targeting en detectie van Mtb-infectie mogelijk, zoals blijkt uit onze in vitro en in vivo studies. Zo kunnen SPIO-MtbsAb nanoprobes worden toegepast als MRI-contrastmiddelen voor ETB-detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft enige eigen interesse in de materialen onderzocht in deze studie.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van het Ministerie van Economie Taiwan (subsidies NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) om dit onderzoek uit te voeren. Dit manuscript is bewerkt door Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
References
- Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
- Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
- Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
- Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
- Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
- Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
- Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
- Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
- Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
- Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
- Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
- Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
- Weissleder, R., Mahmood, U.
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
- Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
- Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
- Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
- Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
- Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
- Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
- Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
- Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
- Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
- Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
- Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
- von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).
