Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.
Interferenza di RNA – e genoma editing basato su piattaforme di screening sono stati ampiamente usati per identificare fattori di cellula ospite che limitano la replicazione del virus. Tuttavia, questi schermi sono in genere condotti in cellule che sono naturalmente permissive al patogeno virale in fase di studio. Di conseguenza, la robusta replicazione del virus in condizioni di controllo può limitare la gamma dinamica di queste schermate. Inoltre, questi schermi potrebbero essere Impossibile identificare facilmente i percorsi di difesa cellulare che limitano la replicazione del virus, se il virus è in grado di contrastare le difese antivirali e ben adattati all’host. In questo articolo, descriviamo un nuovo paradigma per esplorare le interazioni virus-ospite attraverso l’uso di schermi che centro a naturalmente abortite infezioni da arbovirus come virus della stomatite vescicolare (VSV). Nonostante la capacità di riprodursi in una vasta gamma di insetti Ditteri e ospita mammiferi dei VSV, VSV subisce un’infezione post-voce, abortita in una varietà di linee cellulari derivate da lepidotteri insetti come il bombice dispari (Lymantria dispar). Tuttavia, queste infezioni VSV abortive possono essere “salvate” quando le difese antivirali di cellula ospite sono compromesse. Descriviamo come VSV ceppi codifica geni reporter conveniente e restrittive dispar L. linee cellulari possono essere accoppiate agli schermi di messa a punto per identificare fattori dell’ospite coinvolti nella restrizione da arbovirus. Inoltre, mostriamo anche l’utilità di questi strumenti di screening nell’identificazione dei fattori viralmente codificati che replica VSV durante il coinfection o attraverso l’espressione ectopica, compresi quelli codificati dal virus dei mammiferi di soccorso. La limitazione naturale della replica di VSV in dispar L. cellule fornisce un elevato rapporto segnale-rumore quando lo screening per le condizioni che favoriscono il salvataggio VSV, consentendo in tal modo l’uso di metodi semplicistici luminescenza e fluorescenza-basata per monitorare le modifiche nella replica di VSV. Queste metodologie sono utili per comprendere l’interazione tra risposte antivirali ospite e fattori virali evasione immune.
La capacità di un virus di replicare in modo produttivo in un particolare host è in parte regolata dalla disponibilità di fattori di cellula ospite che supportano entrata virale e replica1. La gamma di virus-ospite può essere dettata anche dalla capacità di un virus a contatore antivirale le difese cellulari che altrimenti impedirebbero la replicazione virale2,3. Esso è il risultato di queste interazioni virus-ospite complessi che in ultima analisi, decidere se un virus sarà in grado di completare il suo ciclo di vita in un particolare host. Dato le conseguenze potenzialmente patogene per l’host se ne deriva la replicazione virale, è fondamentale per sviluppare strategie sperimentali per avanzare la nostra comprensione delle interazioni virus-ospite chiave che l’ago della bilancia tra abortiti e produttivo infezioni. Chiarire le caratteristiche molecolari di interazione virus-ospite sarà determinante nello sviluppo di strategie terapeutiche antivirali nuove e alternative.
Con l’avvento di RNA interferenza (RNAi)4,5 e strumenti di modifica del genoma (ad es., CRISPR-Cas9, zinco dito nucleasi, TALENs)6,7, è diventato sperimentalmente fattibile per alterare la espressione di fattori cellulari sul genoma scale ed esplorare l’impatto di queste alterazioni sulla replicazione del virus. Infatti, sono stati condotti numerosi RNAi e genoma di editing basati su schermi in tipi di cellule ospite invertebrati e vertebrati che hanno svelato nuove sfaccettature del virus-ospite interazioni8,9,10, 11 , 12. queste schermate di solito impiegano virus codifica reporter, come la luciferasi di lucciola (LUC) o proteine fluorescenti (ad es., GFP, DsRed), che forniscono comodo mezzo per valutare quantitativamente l’espressione genica virale come una lettura per la replicazione virale9,12. Questa strategia permette ai ricercatori di identificare fattori ospite che sia promuovono o antagonizzano replicazione virale, come evidenziato da aumenti o diminuzioni, rispettivamente, virale Reporter segnala9,12. Tuttavia, nella stragrande maggioranza dei casi, questi schermi sono stati condotti usando i virus che si siano ben adattati al tipo di cellula ospite in cui stanno studiandi. Mentre questa strategia può essere importante per comprendere le relazioni coevolutionary tra agenti patogeni virali e loro ospiti naturali, pongono fondamentali preoccupazioni per quanto riguarda il loro uso in scoprendo fattori antivirali dell’ospite. In questi casi, un miglioramento in reporter di virus segnale di RNAi atterramento è ricercato, o l’inattivazione di un fattore cellulare che normalmente impedisce la replicazione virale. In primo luogo, se un virus è già in grado di replicare con fermezza nella cellula ospite all’esame in condizioni di controllo, la gamma dinamica dello schermo (cioè, la capacità di distinguere tra sfondo e segnali reporter virale avanzata) può essere limitata. In secondo luogo, questo problema è ulteriormente aggravato dalle situazioni in cui il virus è ben adattato alla cellula ospite ed efficace nel contrastare le vie di difesa ospite che sono presi di mira nella schermata.
A causa delle preoccupazioni di cui sopra per quanto riguarda l’interazione virus-ospite tradizionali metodi di screening, abbiamo sviluppato un nuovo paradigma per lo studio delle interazioni virus-ospite che sfruttano le infezioni da arbovirus naturalmente abortiti in cellule di insetto lepidottero. Questa strategia deriva da un’osservazione che l’arbovirus umano ben studiata, VSV, subisce un’infezione abortita in cellule derivate dal lepidottero zingaresco (L. dispar)13. VSV è naturalmente trasmessa da insetti Ditteri (cioè, flebotomi) agli host dei mammiferi e ha dimostrato sperimentalmente di infettare una vasta gamma di invertebrati e vertebrati host sia in cella cultura ed in vivo14. Il genoma di 11-kb-senso single-stranded RNA di VSV codifica cinque mRNAs subgenomic che ciascuno si traducono in proteine che compongono il virione avvolta. Tuttavia, sistemi di genetica inverso VSV hanno permesso la creazione di ceppi replica-competente codifica LUC o proteine fluorescenti, oltre le cinque naturale VSV gene prodotti15,16,17. Poiché queste proteine reporter non sono incorporate nel virione VSV, forniscono una lettura comoda per l’espressione genica VSV che si verifica post-voce. Utilizzo di ceppi VSV codifica GFP o LUC, precedentemente abbiamo indicato che l’espressione genica VSV è severamente limitato al momento dell’entrata delle cellule LD652 e che i titoli VSV non aumentano da post-infezione 72 ore (hpi). Al contrario, la coinfezione di cellule LD652 con VSV e mammiferi di poxvirus, virus vaccinico (VACV), conduce ad un aumento logaritmico sia espressione genica VSV ed i titoli da questo punto di tempo. VACV subisce precoce espressione genica, la replicazione del DNA e tardi espressione genica nelle infezioni delle cellule LD652, ma il ciclo di replica VACV è in definitiva abortito a causa di incompleta virione morfogenesi18. Il grande genoma DNA ~ 192 kb di VACV codifica proteine > 200, molti dei quali visualizzare proprietà immunomodulatorie che promuovono la replicazione virale attraverso la soppressione di host le risposte immunitarie19. Di conseguenza, abbiamo supposto che il “salvataggio” di replica VSV in cellule LD652 da coinfezione VACV probabilmente è stato mediato da immunomodulatori VACV che ha inibito dispar L. risposte normalmente limitando replica VSV. A sostegno di ciò, il trattamento delle cellule di LD652 con l’inibitore di host RNA polimerasi II actinomicina D salva anche replica VSV in cellule di LD652, che indica che la risposta dell’ospite di trascrizione-dipendente blocco VSV replica post-voce13.
Queste osservazioni indicano che la natura naturalmente restrittiva delle cellule di LD652 all’infezione di VSV può fornire uno sfondo relativamente basso quando lo screening per le condizioni che migliorare i segnali reporter VSV-codificati (cioè, quelli che inibiscono host difese antivirali). Qui, mettiamo a disposizione i metodi per l’utilizzo di fluorescenza o saggi basati su LUC alla schermata per condizioni che alleviano la restrizione di VSV in cellule di lepidotteri. In primo luogo, vi mostriamo come queste analisi possono essere utilizzate per identificare i fattori immunomodulatori viralmente codificato che rompono restrizione VSV durante entrambi gli esperimenti di coinfezione o attraverso l’espressione ectopica di fattori virali candidato. Ad esempio, vi illustriamo come abbiamo usato queste tecniche di screening per identificare proteine codificate poxvirus di A51R come una nuova famiglia di fattori immunomodulatori che replica VSV in assenza di altri fattori di poxvirus13di soccorso. In secondo luogo, vi illustriamo come RNAi di screening nelle infezioni di cella restrittive VSV-LD652 può essere utilizzato per identificare direttamente coinvolti da arbovirus restrizione13fattori dell’ospite eucariotica.
Qui abbiamo descritto analisi semplice di fluorescenza e luminescenza basata allo schermo per condizioni che replica VSV in colture cellulari di lepidotteri restrittive di soccorso. L’infezione abortita di VSV in cellule di lepidotteri crea un eccellente rapporto segnale-rumore quando analizzando per espressione genica VSV. Ad esempio, sono stati i segnali di LU rilevati nei lysates dalle singole infezioni VSV-LUC ~ 1.000 superiore a nei lysates mock-infettati, eppure questi segnali solo cambiato circa duplice sopra un c…
The authors have nothing to disclose.
D.G. è stato sostenuto da finanziamenti da dotato Scholars Program dell’Università del Texas Southwestern Medical Center. Gli autori ringraziano Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) e Sean Whelan (Harvard Medical School) per la fornitura di VSV-DsRed e VSV-LUC. Gli autori ringraziano anche Gary Luker (University of Michigan Medical School) per il gentile dono del ceppo VACV-FL-GFP.
6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 |