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Immunology and Infection

虫媒病毒感染作为鉴定病毒免疫调节剂和宿主抗病毒因子的筛选工具

doi: 10.3791/58244 Published: September 13, 2018

Summary

在这里, 我们提出了识别 1) 病毒编码的免疫调节剂的协议, 以促进虫媒病毒复制和 2) 限制虫媒病毒复制的真核宿主因素。这些荧光和发光的方法, 使研究人员能够迅速获得定量读数的虫媒病毒复制在简单的检测, 低信噪比。

Abstract

RNA 干扰-和基因组编辑为基础的筛选平台已广泛用于识别宿主细胞因子, 限制病毒复制。然而, 这些屏幕通常进行的细胞, 自然纵容的病毒病原体正在研究中。因此, 在控制条件下的病毒的健壮复制可能会限制这些屏幕的动态范围。此外, 如果病毒适应宿主并能够抵抗抗病毒防御, 这些屏幕可能无法轻易识别出限制病毒复制的细胞防御通路。在本文中, 我们描述了一个新的范式, 以探索病毒宿主相互作用, 通过使用的屏幕, 中心的自然流产感染的虫媒病毒, 如水泡性口炎病毒 (VSV)。尽管 VSV 能够在广泛的 dipteran 昆虫和哺乳动物寄主中进行复制, VSV 还是经历了进入后, 在鳞翅目昆虫 (毒蛾) 的各种细胞系中流产后的感染。然而, 当宿主细胞抗病毒防御被破坏时, 这些流产的 VSV 感染可以被 "拯救"。我们描述如何 VSV 菌株编码方便的报告基因和限制性的L. 蛾细胞系可以配对设置屏幕, 以确定宿主因素参与虫媒病毒限制。此外, 我们还显示了这些筛选工具的效用, 以确定维拉利编码因素, 拯救 VSV 复制期间复合感染或通过异位表达, 包括那些编码的哺乳动物病毒。VSV 复制在L. 蛾细胞中的自然限制在筛选促进 VSV 救援的条件时提供了高信噪比, 从而使使用简单的荧光和荧光检测方法能够监测VSV 复制的更改。这些方法对于了解宿主抗病毒反应与病毒免疫规避因素之间的相互作用是有价值的。

Introduction

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病毒在特定宿主中进行高效复制的能力, 部分取决于支持病毒输入和复制1的宿主细胞因子的可用性。病毒宿主范围也可以由病毒抵御细胞抗病毒防御的能力决定, 否则会阻碍病毒复制2,3。这是这些复杂的病毒宿主交互的结果, 最终决定病毒是否能够在特定主机上完成其生命周期。鉴于病毒复制的出现可能会对宿主造成致病性后果, 制定实验策略以进一步了解可能导致流产和生产效率平衡的关键病毒宿主相互作用至关重要。感染。阐明病毒宿主相互作用的分子特征将有助于制定新的和替代的抗病毒治疗策略。

随着 RNA 干扰 (核糖核酸)45和基因组编辑工具 (CRISPR-Cas9、锌指核酸、TALENs)67的出现, 改变细胞因子在全基因组范围内的表达, 并探讨这些改变对病毒复制的影响。事实上, 在无脊椎动物和脊椎动物宿主细胞类型中进行了大量的基于 rna 和基因组编辑的屏幕, 揭示了病毒宿主相互作用的新方面8910,11,12. 这些屏幕通常使用病毒编码的记者, 如萤火虫荧光素酶 (卢克) 或荧光蛋白 (e., GFP, DsRed), 提供了方便的手段定量评估病毒基因表达作为一个读数病毒复制9,12。这一策略允许研究人员确定宿主因素, 它们要么促进或拮抗病毒复制, 在病毒报告信号9,12中分别增加或减少。然而, 在绝大多数情况下, 这些屏幕使用的病毒是很好地适应了他们正在研究的宿主细胞类型。虽然这一策略对于理解病毒病原体及其自然宿主之间的进化关系是很重要的, 但对于它们在揭示宿主抗病毒因子方面的应用却构成了根本的担忧。在这些情况下, 正在寻找病毒报告器上的信号增强, 或者是一种通常会阻碍病毒复制的细胞因子的失活。首先, 如果病毒已经能够在控制条件下检查的宿主细胞中进行强力复制, 则屏幕的动态范围 (区分背景和增强的病毒报告信号的能力) 可能会受到限制。第二, 这个问题进一步复杂化的情况下, 病毒是良好的适应宿主细胞, 并有效地对抗主机防御路径, 是在屏幕上的目标。

由于上述对传统病毒宿主交互筛选方法的关注, 我们开发了一种新的模式来研究病毒宿主相互作用, 利用鳞翅目昆虫细胞中自然流产的虫媒病毒感染。这一策略来源于一项观察, 即研究良好的人类虫媒病毒, VSV, 在来自吉普赛蛾 (L. 蛾)13的细胞中经历了一次流产感染。VSV 是自然传播的 dipteran 昆虫 (, 沙蝇) 的哺乳动物宿主, 并已证明实验性感染广泛的无脊椎动物和脊椎动物宿主在细胞培养和体内14。VSV 的 11 kb 负感单链 RNA 基因组编码五 subgenomic 基因, 它们分别转化为构成包络病毒的蛋白质。然而, VSV 反向遗传系统已经允许创建复制能力的菌株编码卢克或荧光蛋白, 除了五自然 VSV 基因产品15,16,17。由于这些记者的蛋白质没有纳入 VSV 病毒, 他们提供了一个方便的读数 VSV 基因表达, 发生后进入。我们以前曾表明, 使用 VSV 菌株编码 GFP 或卢克, VSV 基因表达严重限制在 LD652 细胞的进入, VSV 的滴度不会增加72小时后感染 (hpi)。相比之下, LD652 细胞与 VSV 和哺乳动物痘, 痘苗病毒 (VACV) 的复合感染, 导致在 VSV 基因表达和效价的这一时间点的对数增加。VACV 在 LD652 细胞感染中经历早期基因表达、DNA 复制和晚期基因表达, 但 VACV 复制周期最终由于不完全病毒形态发生18而流产。VACV 编码 > 200 蛋白的大 ~ 192 kb DNA 基因组, 其中许多显示免疫调节特性, 通过抑制宿主免疫应答19来促进病毒复制。因此, 我们假设 VACV 复合感染在 LD652 细胞中 VSV 复制的 "营救" 可能是由 VACV 免疫调节剂引起的, 抑制L. 蛾响应通常限制 VSV 复制。为支持这一点, LD652 细胞与宿主 RNA 聚合酶 II 抑制剂放线菌 D 的治疗也拯救 VSV 在 LD652 细胞复制, 表明转录依赖主机响应阻止 VSV 复制后进入13

上述观察表明, LD652 细胞对 VSV 感染的自然限制性, 在筛选增强 VSV 编码的报告信号的条件时可能提供相对较低的背景 (那些抑制宿主抗病毒防御)。在这里, 我们提供的方法, 以荧光或卢克为基础的化验, 以筛选条件, 以缓解 VSV 限制鳞翅目细胞。首先, 我们展示了如何使用这些检测方法来识别维拉利编码的免疫调节因子, 在复合感染实验中或通过候选病毒因子的异位表达打破 VSV 限制。举例来说, 我们说明了我们如何使用这些筛选技术来识别痘编码的 A51R 蛋白作为一种新的免疫调节因子家族, 在没有其他痘因素13的情况下拯救 VSV 复制。其次, 我们说明了如何在限制性 VSV-LD652 细胞感染中进行 rna 干扰筛选, 以直接识别虫媒病毒限制13中所涉及的真核宿主因素。

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Protocol

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1. 一般(LD652) 细胞和病毒培养

  1. LD652 细胞培养与电镀
    1. 培养LD652 细胞, 维持生长培养基 (材料表) 中的细胞单层, 在正常大气下孵化27摄氏度。保持细胞在10厘米组织培养处理的菜肴和通过细胞后, 达到80% 融合。
    2. 对板, 去除黏附的 LD652 细胞从板材通过吹打媒介反复地到单层 (这些细胞不要求 trypsinization 去除), 并且稀释样品在生长媒介到大约密度 1 x 105细胞/毫升。吸管1毫升稀释培养/井的24井板。种子至少三复制井/治疗类型为每个时间点 (最大八治疗/板材)。
    3. 允许单元格至少满足1小时。
  2. 痘苗病毒制剂
    1. 为了准备 VACV 的储存, 在 HeLa 细胞中放大病毒20或非洲绿猴肾细胞 (BSC-1 或 BSC-40 细胞)20,21,22
      注: VACV 应变西部储备 (VACV) 在这里描述的化验工作很好。
    2. 滴定 VACV 菌株通过斑块检测 BSC-1 或 BSC-40 细胞20,22
      注: 所有显示的 VACV 多重感染 (语言) 这里描述的 LD652 细胞感染是基于从 BSC-40 斑块化验得出的效价。
  3. 水泡口炎病毒制剂
    1. 为了准备 VSV 种群, 在 BHK 细胞中放大病毒23
    2. 滴定 VSV BSC-40 或 BHK 细胞膜上的斑块测定13,23
      注意: 这里描述的所有 VSV mois 》杂志 LD652 细胞感染是基于从 BSC-40 斑块化验得出的滴度。

2. 基于荧光的 VSV 的联合感染和活细胞成像抢救方法

  1. LD652 细胞的播种与感染
    1. 板 4万 LD652 细胞/井8井室。
    2. 对于基于荧光的活细胞成像, 使用 VSV 菌株编码荧光蛋白。在这里提出的实验使用 VSV-DsRed17, 一种重组 VSV 菌株, 表达自由 DsRed 蛋白不融合到任何其他 VSV 蛋白。
      注: VSV 感染 LD652 细胞不病变 96 hpi, 因此, 在评估 VSV 复制在这个时间框架内, 细胞死亡不是一个混杂的因素。
    3. 在无血清的培养基中制备 VSV DsRed 和 VACV-GFP-绿色荧光蛋白 (可以持续森林;材料表)分别在1和25的教学语言中。
      注: VACV-gfp 是一种重组 VACV 菌株, 表达了卢克和 GFP24之间的融合。使用25或更大的 VACV 菌株的语言确保所有 LD652 细胞感染13。如果使用不同的 coinfecting 病毒, 该语言将必须由用户的经验判断。每种感染治疗应建立在重复的水井, 包括模拟感染的治疗, 其中只有可持续森林可持续的添加到细胞。
    4. 在27摄氏度的0.2 毫升接种中孵化细胞2小时。
    5. 用0.5 毫升/良好的生长培养基冲洗细胞。
    6. 在生长培养基中孵化25微米细胞活性染料 (材料表) 中的细胞, 45 分钟27摄氏度。
    7. 吸入介质, 用0.5 毫升/井冲洗井 1x, 去除过量染料。
    8. 保持细胞在0.3 毫升/井的生长培养基。
  2. 活细胞图像捕获
    1. 提前30分钟打开共聚焦显微镜, 并装上8井腔盘。
      注: LD652 细胞可以在室温下成像, 从20–25°c, 但为最佳条件, 房间的温度应调整为27摄氏度。
    2. 设置适当的激发/发射设置, 每个荧光标记蛋白的成像, 以及相对比图像设置。
    3. 调整每个通道的激光强度。
      注: 这可能需要运行一个试点实验, 以确定在整个时间过程中观察到的荧光信号强度范围, 将在最后的实验中使用。
    4. 使用10X 目标, 捕获每个井的相对比度和荧光图像每 1–5 h 为传染的期间到一个期望的时间点 (e. g, 48–72 hpi)。
      注意: 在每个井中捕获多个视野是很重要的, 以便准确估计整个文化中的感染率。
  3. 图像分析
    1. 使用图像分析软件对适当的荧光通道进行自动图像分析 (e., 405 毫微米, 488 nm, 568 nm)。
    2. 要计算受感染细胞的百分比, 请将表示 VSV 感染 (e., DsRed 阳性细胞为 VSV DsRed 感染) 的荧光细胞总数除以细胞活性染料标记的存活细胞总数所有治疗的视野。

3. LD652 细胞中基于发光的 VSV 抢救方法的一般病毒感染协议

  1. 接种的制备
    1. 30分钟前的感染, 解冻的股票 VSV-卢克16 (重组 VSV 菌株, 表达自由萤火虫荧光素酶蛋白不融合到任何其他 VSV 蛋白)。如果在 VACV 复合感染中对 VSV-卢克的抢救进行化验, 也会使 VACV-西铁病毒在冰上解冻。
      注: 其他病毒 (除 VACV) 可能在复合感染期间抢救 VSV-卢克, 但这将必须由每个用户经验主义地确定。
    2. 在 VACV 的存在或不存在的情况下, 通过稀释 VSV-卢克来制备接种, 以便在增加总接种体积0.2 毫升/井时, 分别达到10和25的教学效果。
  2. 细胞感染
    1. 仔细吸入成熟的 LD652 培养基, 以避免干扰单层和接种0.2 毫升病毒/好。这一次被定义为 0 hpi。增加无菌可持续森林管理, 以作为 "模拟感染" 的阴性对照治疗。
    2. 在接种中孵化细胞2小时, 在27摄氏度。
    3. 在 2 hpi, 取出接种的吸入, 并替换为1毫升/良好 LD652 生长介质。
    4. 允许感染继续 24–72 hpi。

4. 荧光素酶测定法

  1. 细胞裂解物的制备
    1. 小心地吸入上清, 并添加1毫升的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)/好。
    2. 使用1毫升注射器的柱塞, 将细胞刮成 DPBS。
    3. 将细胞转移到离心管, 离心机在 400 x g 20 分钟4摄氏度。
    4. 同时, 在2O 无菌 RLB 中, 制备5x 报告裂解缓冲液的1x 稀释剂。
    5. 离心后, 在不干扰细胞颗粒的情况下吸入 DPBS。
    6. 并用重悬每个颗粒在150µL 1x RLB。
    7. 冷冻-解冻样品1x 使用5分钟孵化在-80 °c 冰箱后, 一个快速解冻的室温水浴。将裂解物存储在-80 摄氏度, 直到准备分析。
  2. 荧光素酶测定
    1. 在冰上解冻裂解物。
    2. 吸管 20 ul 的裂解成一个坚实的黑色或白色的96井微板块。
    3. 添加 100 ul 的荧光素酶检测试剂每一个井。
    4. 立即测量光强度使用紫外线 (适当的设置为特定 luminometers 将必须由用户经验主义地确定)。
  3. 荧光素酶检测分析
    1. 对 lu 信号进行规范化处理, 从控制处理获得的 lu 读数 (代表性结果)。在至少进行了三项独立实验之后, 通过适当的统计检验, 可以分析每个治疗/对照组获得的平均 LU。

5. 应用免疫印迹

  1. 使用适当的试剂和仪器, 用裂解物提取用于 SDS 页和后续免疫印迹法的卢克化验。

6. LD652 细胞培养 VSV 的效价

  1. 根据步骤 1.1, 板 LD652 细胞。
  2. 病毒根据步骤3感染细胞。
  3. 在所需的时间点, 收集上清液到无菌离心管。
  4. 颗粒细胞使用 1000 x g 10 分钟在4摄氏度和转移上清液到新的管。
  5. 贮存上清液在-80 摄氏度或进行滴定通过斑块检测 BSC-40 细胞。
    注: 如果滴定 VSV 来自含有 VACV 的 LD652 细胞培养物, 建议在2苷内将100微克/毫升胞嘧啶 AraC (BSC-40) 添加到 hpi 培养基中, 以防止残留 VACV 颗粒在 BSC-40 膜13上形成斑块。AraC 是一种病毒 dna 聚合酶抑制剂, 阻止 VACV DNA 复制25 , 但不影响 VSV 复制。

7. LD652 细胞中基于发光的 VSV 抢救方法的变异: rna 干扰和质粒转染实验

  1. 病毒或寄主转录 rna 干扰介导的 dsRNA 的制备
    1. 设计基因特异引物尾在 5 ' 末端与 T7 启动子序列 (TAATACGACTCACTATAGGG) 瞄准 coinfecting 病毒 (例如, VACV) 或L. 蛾mRNA 的兴趣。这些引物应产生 400–600 bp 的 PCR 产物, 用于有效的 rna 介导的击倒。见金门13用于在 LD652 细胞中通过 dsRNA 介导的干扰来击倒 VACV 或L. 蛾记录的引物序列。
      注: l. 蛾mRNA 记录可以从出版的 l. 蛾转录数据库262728中确定。
    2. 通过rt-pcr 生成 DNA 模板 (cDNA 合成: 1 周期50°c 30 分钟;PCR:40 周期94°c 为十五年代, 50 °c 三十年代和68°c 为四十五年代每个)。
    3. 使用 pcr 纯化试剂盒净化 pcr 产品。
    4. 以纯化 PCR 产品为模板, 用体外转录纯化试剂盒对 dsRNA进行转录纯化。
  2. dsRNA 或质粒 DNA 转染 LD652 细胞的研究
    1. 种子 1 x 105细胞/井24井板并且让细胞安定至少 1 h。
    2. 为每个井被转染, 稀释 4 ul 再染试剂入 100 ul 的可持续森林。在室温下孵育高达15分钟。可以对此进行缩放, 以便为所有 transfections 执行主组合。
    3. 稀释多达1微克的 dsRNA 或总质粒 DNA 与 100 ul 的可持续森林研究为每个井被转染。在室温下孵育高达15分钟。
      注: 我们以前发现, 转染1微克的 dsRNA/105 LD652 细胞足以用于 > 80% 击倒的病毒或主机成绩单13, 但 dsRNA 剂量需要修改实验设置/条件将不得不有经验的确定。
    4. 结合转染试剂和 dsRNA/质粒 DNA 稀释与1:1 比值 (例如, 100 ul 稀释 dsRNA 与 100 ul 稀释转染试剂) 和孵化20分钟室温。
    5. 同时, 用1毫升/井的可持续森林洗涤水井, 然后在每个井中添加 500 ul 的可持续森林。
    6. 慢慢添加转染试剂 dsRNA (或质粒 DNA) 混合物滴入每个井。
    7. 用细胞孵化5小时的转染试剂。
      1. 对于涉及 coinfecting 病毒编码的转录记录的干扰实验 (VACV), 在5小时转染潜伏期后, 用含有 VSV-卢克的病毒接种取代转染试剂 (有或无 VACV 或另一种 coinfecting 病毒) (步骤 3)。随后, 将包含 VSV 的病毒接种替换为完全生长介质 2 hpi。卢克化验 (步骤 4) 然后可以执行在提取裂解物在不同的时间点, 以确定是否 coinfecting 病毒记录的击倒导致 VSV-卢克救援的损失。
      2. 对于转录的 rna 干扰实验, 用完整的生长介质替换转染组合, 并允许在 VSV (步骤 4) 感染前24小时进行击倒。卢克化验 (步骤 4) 然后可以执行在提取裂解物在不同的时间点, 以确定如果记录的被击倒促进 VSV-卢克抢救。
      3. 对于 transfections 的质粒表达载体的免疫调节剂, 用 VSV-卢克 (步骤 4) 取代转染试剂, 允许在感染前24小时进行蛋白表达。卢克化验 (步骤 4) 然后可以执行在提取裂解物在不同的时间点, 以确定是否候选免疫调节蛋白的表达促进 VSV-卢克抢救。
        注: 在这里描述的转染条件使用质粒 DNA 的1微克/井, 导致 40–60%13的转染效率。

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Representative Results

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作为活体细胞成像应用监测 VSV 救援 VACV 复合感染的例子, LD652 细胞被镀在一个8井腔内的盘子里, 然后在 VACV--GFP (语言 = 25) 的存在或不存在的情况下, 在 VSV-DsRed (语言 = 1) 中被模拟感染或感染。因为 VSV-DsRed 表达 DsRed 作为一个自由的蛋白质, 并没有融合到结构 VSV 蛋白 (图 1A), 它只是检测后, VSV 进入和基因表达启动。所有细胞都被标记为细胞活性染料, 可以自由通过细胞的等离子膜, 转化成膜-impermeant 产品, 从而促进在标记细胞中保留荧光信号。图像获得每5小时多达 65 hpi, 使用 405 nm, 488 nm, 568 nm, 白光过滤器, 以捕获细胞活力染料, VACV-GFP, VSV DsRed 和相对比 (PC) 通道, 分别。在单一感染条件下, LD652 细胞限制 VSV DsRed 复制;因此, 只有少量的细胞表现出 DsRed 信号。然而, 复合感染 VSV-DsRed 与 VACV-FL-GFP 导致大多数细胞显示 DsRed 信号的时间课程结束 (图 1B)。每个时间点捕获的图像都经过图像分析软件, 其中 405 nm 和 568 nm 通道图像分别用于自动确定总和 DsRed 阳性细胞数。每个处理中显示 DsRed 信号的单元格的百分比是通过在 568 nm 通道中的目标 (单元) 除以 405 nm 通道中每个时间点所标识的对象数, 然后乘以100% 来计算的。.如图 1C所示, VSV-DsRed 单感染的细胞中有2% 是 DsRed 阳性, 65 hpi。相比之下, VSV-DsRed + VACV-FL-GFP coinfections 中的77% 的细胞在这个时间点 DsRed 阳性。电影 S1 和 S2显示 VSV-DsRed 感染的进展, 在整个65小时的时间课程的单一感染和复合感染条件, 分别。重要的是要注意到, 在 DsRed 信号之前, VACV-hpi gfp 的 gfp 表达是可检测到的, 表明在 VSV-DsRed 抢救之前需要足够的 VACV 基因表达 (不显示)。总的来说, 这些结果清楚地表明, VACV 复合感染拯救了 VSV-DsRed 的复制。如果 coinfecting 病毒无法拯救 VSV-DsRed, 我们预计在单感染和复合感染治疗之间 DsRed 阳性细胞的百分比相等。

在使用 VSV-卢克菌株时, LD652 细胞中的 VSV 复制可以用发光的方法进行量化 (图 2A)。举例来说,图 2B显示了一个卢克化验的结果, 使用裂解物在72小时的过程中, 从模拟感染的细胞或感染 VSV-卢克 (语言 = 10) 的细胞存在或没有 VACV-西铁 (语言 = 25)。从分之细胞裂解物制备的任意 LU 的对数增加, 与单 VSV-卢克感染的裂解物相比, 对 VSV 复制的积极抢救表明。一个阴性的结果将表明, 在这一检测失败的复合感染改变的 LU 读数从那些观察到的单一 VSV-卢克感染治疗。如果需要, 制备的裂解物也可用于免疫印迹法, 以确认增强 VSV 基因在复合感染治疗中的表达。例如,图 2C显示了一个典型的应用免疫印迹结果为 VSV 编码的卢克和矩阵 (M) 蛋白质在裂解物准备从模仿-, VSV-卢克, 和 VSV-卢克 + VACV-西铁治疗 72 hpi。免疫印迹法 VACV I3L 蛋白作为 VACV 感染的标志物, 并以免疫印迹法为细胞肌动蛋白作为负荷控制。复合感染裂解物中 VSV 编码的卢克和 M 蛋白的明显增强进一步证实了 VACV VSV 的抢救。最后, 可以通过从这些 LD652 细胞培养中收集上清液并滴定 BSC-40 单膜上的感染病毒 (图 2D) 来确认生产性 VSV 复制。这一结果表明, 只有在 VACV 复合感染 VSV 有成效地复制。

一旦发现 coinfecting 病毒能够在 LD652 细胞中抢救 VSV 复制, 则可使用 rna 筛选来确定 coinfecting 病毒编码的因素, 有助于 VSV 抢救。在这个实验中, 屏幕上的干扰条件, 导致 "失去救援" 表型期间 VSV-卢克复合感染与抢救病毒。我们以前通过对许多 VACV 编码的成绩单13的 rna 筛选来确定 VACV A51R 蛋白为 VSV 的抢救因子。例如, 我们已经概括了这个屏幕的较小规模版本 (图 3)。rna 干扰是介导的转染体外转录 dsRNAs 的目标转录 coinfecting 病毒编码。在这里显示的数据中, 编码 VACV A50R、A51R 和 A52R 蛋白的病毒转录是用来进行 rna 攻击的。作为对抢救损失的消极控制, 细胞也被转染了 dsRNAs 靶向 GFP 编码记录。作为一个积极的控制损失的抢救表型, 细胞被转染 dsRNAs 对卢克编码记录。这种治疗在复合感染期间产生了很强的 LU 信号丢失, 并帮助研究人员确认转染/rna 干扰协议正在起作用。在 dsRNA 转染5小时后, 细胞分之 VSV-卢克 (语言 = 10) 和 VACV-西铁 (语言 = 25)。另外, 只有 VSV-卢克的单独感染也被执行, 以建立 LU 信号的背景水平。裂解物被收获了 72 hpi 并且使用了在卢克试验。通过 dsRNA 治疗 VSV 的水平与 GFP dsRNA 控制治疗的比较, 结果表明 VACV A51R 的击倒导致了抢救表型的强烈损失, 而 A50R 和 A52R 的击倒产生了一个负面结果 (没有损失救援相比, GFP dsRNA)。

作为一种替代 rna 筛选, 以确定有助于 VSV 抢救的病毒因素, 过度表达 tshr 候选病毒因素 LD652 细胞, 然后检测 VSV 卢克抢救。这可以通过克隆感兴趣的候选基因到适当的表达载体如 p16629和转染这些质粒成 LD652 细胞在 VSV-卢克挑战之前完成。例如,图 4A显示了一个营救实验, 其中标记的 GFP (FGFP) 或标志标记的 A51R (FA51R) p166 载体被转染成 LD652 细胞在不同的浓度, 其次是 VSV-卢克感染 (MO = 10) 24 h 以后。作为 VSV 抢救的一个消极控制, 另外的文化被模仿转染并且没有接受质粒脱氧核糖核酸。裂解物从文化 72 hpi 收集和被接受了卢克化验。FA51R 治疗产生了积极的 VSV 抢救结果, 证明了加强 LU 信号的模拟转染治疗的多剂量。相比之下, FGFP 治疗是阴性的 VSV 抢救在任何剂量测试。图 4A中裂解物的免疫印迹法证实了 FGFP 和 FA51R 蛋白的相似表达 (图 4B)。

通过对候选因子的 rna 筛选, 我们发现 LD652 细胞中 VSV 的限制是由属于抗病毒 rna 干扰通路 ( AGO2 和 Dicer-2)的各种细胞因子介导的, 核因子nf-κb (NF) 相关的 IMD 通路 (例如,津津有味), 和泛素-蛋白酶体系统 (e., polyubiquitin)13。作为一个例子, 我们重复了一个较小的规模版本的这些干扰实验与 dsRNAs 目标L. 蛾记录, 加强 VSV-卢克复制后, 击倒 (e., AGO2, Dicer-2, 津津有味, polyubiquitin) 或没有效果 (AGO1)13。经过24小时的 dsRNA 转染, 细胞被挑战与 VSV-卢克72小时, 以确定是否 rna 干扰治疗增强 LU 信号的阴性控制 GFP dsRNA 治疗。增强 LU 信号的 rna 干扰疗法表明, 目标转录编码的因素限制了 VSV 复制。作为对 rna 干扰的积极控制, dsRNAs 靶向的卢克编码记录也在平行治疗中被转染。由于在 GFP dsRNA 控制处理中检测到的低背景 LU 信号, 使用 rna 筛选识别主机编码的限制因子相对简单, 因为它们的击倒产生了10到1000倍的 lu 信号增加 (图 5)。因此, 有可能利用相对较低的 VSV 基因表达在 LD652 细胞的背景水平, 以筛选宿主干扰击倒条件, 缓解 VSV 限制。

Figure 1
图 1: 基于荧光的活细胞成像技术识别 LD652 细胞的病毒复合感染 VSV 抢救.(A) 这个小组显示了一个 VSV DsRed 基因组的示意图, 表明 DsRed (dR) 基因的位置。(B) 这些具有代表性的10X 共焦显微图像被捕获 60 hpi。405 nm 通道表明有活细胞染色, 488 nm 通道表明 VACV-GFP 感染, 568 nm 通道表明 VSV DsRed 感染。同时还显示了相位对比度 (PC) 图像。刻度条 = 100 µm. (C) 本小组在整个65小时感染时间课程中显示 DsRed 阳性 LD652 细胞的百分比。显示每个时间点显示 DsRed 信号的单元格的平均值 (SD) 百分比。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 使用卢克化验法评估 LD652 细胞的 VSV 抢救.(A) 这个小组显示了一个 VSV-卢克基因组的示意图。(B) 本小组在 VACV 没有或存在的情况下, 显示任意轻型单位 (卢克) 对被模拟感染的细胞或感染 VSV-卢克的细胞裂解物的测定。(C) 这个小组显示了卢克、VSV M、VACV I3L 和细胞肌动蛋白在裂解物从小组A收集的 72 hpi 应用免疫印迹。(D) 这个小组显示了从B组获得的文化上清液的 VSV。小组BD中的定量数据代表了三项实验中的方法。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在 LD652 细胞复合感染中通过 rna 干扰筛选识别维拉利编码的 VSV 拯救因子.此面板显示了在裂解物从 72 hpi 细胞中检测到的与 VSV-卢克和 VACV-西铁在指示的 rna 干扰治疗后发现的褶皱变化, 相对于在裂解物从单独感染 VSV-卢克的细胞中检测到的 lu。这些数据代表了三项实验中的方法。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 通过在 LD652 细胞中过度表达病毒免疫调节剂来抢救 VSV.(A) 这个小组显示了一个卢克化验从 VSV-卢克感染细胞 72 hpi 是模拟转染 (模拟) 或转染的 FGFP 或 FA51R p166 表达质粒。在模拟转染控制处理中, 每种处理信号均归一化为检测信号。这些数据代表了三项实验中的方法。(B) 这个小组显示裂解物从小组A, immunoblotted 与旗子和肌动蛋白抗体。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 通过 rna 筛选来识别限制 LD652 细胞 VSV 复制的宿主因素.该面板显示了 LU 信号中的褶皱变化, 表明与 GFP dsRNA 控制治疗有关的 72 hpi 与 VSV-卢克的干扰治疗。这些数据代表了三项实验中的方法。请单击此处查看此图的较大版本.

电影 S1: 代表 405 nm (细胞活力染料) 和 568 nm (DsRed) 通道图像捕获65小时的时间路线 (每帧 = 5 小时间隔) 后 VSV DsRed 感染 LD652 细胞.请单击此处下载此文件.

电影 S2: 代表性的 405 nm (细胞活力染料) 和 568 nm (DsRed) 通道图像捕获65小时的时间路线 (每帧 = 5 h 间隔) 后, 复合感染 LD652 细胞与 VSV DsRed 和 VACV-佛罗里达州 GFP.请单击此处下载此文件.

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Discussion

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在这里, 我们描述了简单的荧光和发光的检测, 以筛选条件, 拯救 VSV 复制在限制性的鳞翅目细胞培养。VSV 在鳞翅目细胞中的流产感染在 VSV 基因表达的检测中产生了良好的信噪比。例如, 裂解物从单 VSV 感染中检测到的 LU 信号比模拟感染的裂解物高1000倍, 然而这些信号在72小时的时间内只改变了大约两个。相比之下, VSV 的复合感染与 VACV 增强的 LU 信号相比, 300 倍于单 VSV-卢克感染 72 hpi。因此, VSV 救援化验显示了一个良好的动态范围, 包括几个数量级。

建立这些化验的关键步骤之一是决定使用荧光或发光的方法来检测 VSV 的抢救。我们已经展示了如何使用活细胞成像技术和软件包定量检测 VSV 编码的 DsRed 信号的例子, 这有助于在缺乏或存在救援的情况下自动量化 DsRed 阳性细胞。复合感染.如果研究人员能够获得活细胞成像能力, 这些化验方法是不昂贵的设置, 并允许他们捕捉到广泛的时间点, 可能有助于检测 VSV 复制动力学的差异, 只有在狭窄的时间观察窗户。相比之下, 基于发光的方法实质上是终点检测, 需要在预定的时间点准备细胞裂解物, 而裂解制剂可能耗时。另一方面, 基于发光的检测不需要复杂的显微设备-只有一个能够读取发光信号的平板阅读器。此外, 基于荧光的化验有一个更大的动态范围比显微镜的化验, 计算细胞的百分比感染。例如, 在显微学化验中, DsRed 阳性细胞 (表明 VSV DsRed 感染) 只能从一个视野中的分析细胞的0–100% 范围。相比之下, 在单 VSV 和复合感染条件 (或其他救援条件) 之间的 LU 信号可以超过几个数量级。

使用 VSV细胞系统的一个关键优点是在这里给哺乳动物病毒编码的免疫调节剂进行筛选, 它本身就选择了病毒因子的识别, 抑制了可能被保存和古代抗病毒反应, 早于脊椎动物特定的干扰素反应。事实上, 初步观察表明, A51R 蛋白抑制了保守的抗病毒泛素-蛋白酶体相关的细胞反应 (见火腿13和未发表的数据)。VACV A51R 抢救 VSV 的发现是在无脊椎动物宿主13中由脊椎动物病毒拯救异源病毒的第一个例子, 而且这些筛选系统很可能会发现更多的脊椎动物病毒编码免疫调节剂.重要的是要注意, 使用 VSV 救援作为一个读数的条件, 抑制主机免疫力的关键是, VSV 复制必须严格限制 (或流产) 的细胞类型, VSV 复制正在审查中。因此, 大多数哺乳动物细胞类型可能不适合这些类型的化验, 因为 VSV 复制良好的哺乳动物细胞。这就是为什么在这里使用蛾细胞作为一种自然限制性的宿主细胞类型的 VSV。

先前研究的果蝇细胞表明, 病毒抑制的抗病毒 rna 应答反应可以通过 cotransfection 表达质粒编码候选的 rna 干扰抑制和自我复制的羊群房子病毒基因组 RNA,编码 GFP 代替 B2, 它的自然干扰抑制器30。羊群房基因组 RNA 的复制和 gfp 的生产依赖于 cotransfected 候选因子抑制 rna 干扰, 因此, GFP 表达的抢救表明了 rna 抑制30。我们未发表的研究表明, 病毒编码的 rna 干扰抑制剂的过度表达也挽救了 VSV-卢克基因在L. 蛾细胞中的表达, 表明该系统也可用于识别 rna 干扰反应的抑制因子在感染一个真正的病毒病原体, 而不是一个传代。事实上, 发现, rna 干扰, IMD, 和泛素-蛋白酶体相关的途径有助于限制 VSV 复制在L. 蛾细胞13表明, 病毒拮抗剂的几种抗病毒途径可以识别的 VSV这里提供了救援化验。

这些筛选方法在鉴定宿主抗病毒蛋白方面的潜在限制是基因组序列尚不可用。然而, 有公开可利用的transcriptomes, 可以用来识别候选主机目标的 rna 攻击击倒26,27,28。此外, 我们以前已经表明, VSV 是限制在来自其他 lepidopterans13的细胞系, 现在有一个公开的基因组 (例如, Manduca 天蛾)31。因此, 由其他 lepidopterans 序列基因组衍生出的细胞系, 可替代本协议中描述的L. 蛾细胞。

鉴于虫媒病毒32的经济和公共卫生威胁日益严重, 这里提出的筛选方法可以提供新的策略, 以确定虫媒病毒宿主相互作用的新特征, 在设计新型抗病毒药物时可能有价值。疗法。此外, 由于我们对限制 RNA 病毒复制的鳞翅目机制的理解相对有限, 此处介绍的工具提供了新的机会来探测由这个经济上重要的主机防御机制编码的昆虫的秩序。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

危险品得到了德克萨斯大学西南医学中心资助的学者计划提供的资金支持。作者感谢迈克尔 Whitt (田纳西州大学健康科学中心) 和肖恩. 惠兰 (哈佛医学院) 提供 VSV-DsRed 和 VSV-卢克。作者还感谢加里 Luker (密歇根大学医学院) 为 VACV--FL-GFP 菌株的亲切礼物。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture plates CELLTREAT 229106
24-well tissue culture plates CELLTREAT 229124
10 cm tissue culture dishes Corning C430167
Grace’s Insect Medium Sigma G8142
EX-CELL 420 Sigma 14420C
Fetal Bovine Serum - Optima Atlanta Biologicals S12450
Growth medium 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) Sigma A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma D8662
Serum Free Media (SFM) Thermo Fisher 10902096
Cytosine arabinoside Sigma C1768
Transfection reagent Thermo Fisher 10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25950CQC
Reporter lysis buffer 5x Promega E3971
Luciferase Assay Reagent Promega E1483
96-Well Microplates Corning 3915
Mouse anti-FLAG antibody Wako 014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody Abcam ab21176
Mouse anti-actin antibody Sigma A2066
Mouse anti-VSV M N/A N/A Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L N/A N/A Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish Lab-Tek II 155409
Cell viability dye Thermo Fisher C12881
FLUOstar microplate reader BMG Labtech FLUOstar
Confocal microscope Olympus FV10i-LIV
Image analysis software Olympus v1.18 cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge Eppendorf 22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System Li-COR Biosciences Odyssey Fc
LD652 cells N/A N/A Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells ATCC CRL-2761
BHK cells ATCC CCL-10
HeLa cells ATCC CCL-2
BSC-1 cells ATCC CCL-26
in vitro transcription and purification kit Thermo Fisher AM1626
PCR purification kit Qiagen 28104

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虫媒病毒感染作为鉴定病毒免疫调节剂和宿主抗病毒因子的筛选工具
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Rex, E. A., Seo, D., Gammon, D. B. Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors. J. Vis. Exp. (139), e58244, doi:10.3791/58244 (2018).More

Rex, E. A., Seo, D., Gammon, D. B. Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors. J. Vis. Exp. (139), e58244, doi:10.3791/58244 (2018).

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