Här presenterar vi de protokoll för att identifiera 1) virus-kodade immunmodulerande medel som främjar arbovirus replikering och 2) eukaryota värd faktorer som begränsar arbovirus replikering. Dessa fluorescens – och luminiscens-baserade metoder tillåter forskare att snabbt få kvantitativa avläsning av arbovirus replikering i förenklade analyser med lågt signal-till-brus-förhållande.
RNA interferens- och arvsmassan redigering-baserad screening plattformar har använts att identifiera värd cell faktorer som begränsar virusreplikation. Dessa skärmar bedrivs dock vanligtvis i celler som är naturligt tillåtande till viral patogenen under studien. Robust replikering av virus i kontroll villkor får därför begränsa det dynamiska omfånget av dessa skärmar. Dessutom kan dessa skärmar inte enkelt identifiera cellulära försvar vägar som begränsar virusreplikation om viruset är väl anpassade till värden och kan motverka antivirala försvar. I den här artikeln beskriver vi ett nytt paradigm för att upptäcka virus-host interaktioner med hjälp av skärmar det centrerar på naturligt misslyckade infektioner av arboviruses såsom vesikulär stomatit virus (VSV). Trots VSV förmåga att replikera i ett brett utbud av sorgmyggor insekter och däggdjur värdar, genomgår VSV en efter inresa, misslyckade infektion i en mängd olika cellinjer som härstammar från fjärilsarter insekter, såsom gypsy moth (Lymantria dispar). Dock kan dessa misslyckade VSV infektioner ”räddas” när mottagande cell antivirala försvar äventyras. Vi beskriver hur VSV stammar kodning bekvämt reporter gener och restriktiva L. dispar cellinjer kan kopplas till set-up skärmar att identifiera värd faktorer inblandade i arbovirus begränsning. Dessutom visar vi också nyttan av dessa screening verktyg i identifiering av viralt kodade faktorer som rädda VSV replikering under coinfection eller via ektopisk uttryck, inklusive de kodas av däggdjur virus. Den naturliga begränsningen av VSV replikering i L. dispar celler ger en hög signal-brus-förhållande när screening för de villkor som främjar VSV räddning, vilket möjliggör användning av förenklade luminiscens och fluorescens-baserade analyser att övervaka förändringar i VSV replikering. Dessa metoder är värdefulla för att förstå samspelet mellan värd antivirala svar och viral immune evasion faktorer.
Förmågan hos virus att produktivt replikeras i en viss värd styrs delvis av tillgången till mottagande cell faktorer som stöder viral intrade och replikering1. Den virus-spektrum kan också dikteras av kapaciteten av ett virus till counter cellulära antivirala försvar som annars hämma virusreplikation2,3. Det är resultatet av dessa komplexa virus-värd-interaktioner som slutligen avgör om ett virus kommer att kunna slutföra sin livscykel i en viss värddator. Tanke på de potentiellt patogena konsekvenserna för värden om virusreplikation inträder, är det viktigt att utveckla experimentella strategier för att främja förståelsen av det nycklarna-virus-host samspel som kan rubba balansen mellan misslyckade och produktiv infektioner. Klarlägga molekylära funktioner i virus-host samspel kommer att bidra i utvecklingen av nya och alternativa antivirala terapeutiska strategier.
Med tillkomsten av RNA interferens (RNAi)4,5 och editering verktyg (t.ex., CRISPR-Cas9, zink finger nukleotider, TALENs)6,7, det har blivit experimentellt genomförbart att förändra den uttryck av cellulära faktorer på genome-wide skalor och utforska effekterna av dessa förändringar på virusreplikation. Faktiskt, många RNAi och genomet-redigering-baserade skärmar har utförts i ryggradslösa och ryggradsdjur värd celltyper som har avtäcka ny fasetter av virus-host interaktioner8,9,10, 11 , 12. dessa skärmar vanligtvis anställa virus kodning reportrar, såsom firefly luciferas (LUC) eller fluorescerande proteiner (t.ex., GFP, DsRed), som ger bekvämt sätt kvantitativt bedöma viral genuttryck som en avläsning för virusreplikation9,12. Denna strategi tillåter forskare att identifiera värd faktorer som antingen främja eller motverka dexmedetomidininducerade virusreplikation vilket framgår av ökar eller minskar, respektive, i viral reporter signaler9,12. Dock i de allra flesta fall, har dessa skärmar utförts med virus som är väl anpassade till den mottagande celltyp där de studeras. Denna strategi kan vara viktiga för att förstå coevolutionary relationer mellan virala patogener och deras naturliga värdar, utgör det grundläggande oro för deras användning i avslöjande värd antivirala faktorer. I dessa fall en förbättring i virus reporter signal vid RNAi knockdown som granskas för eller inaktivering av en cellulär faktor som normalt förhindrar virusreplikation. Först om ett virus är redan kunna kraftfullt replikera i värdcellen undersöks kontroll villkor, kan det dynamiska omfånget på skärmen (dvs, förmågan att skilja mellan bakgrunden och förbättrad viral reporter signaler) begränsas. Det andra förvärras problemet ytterligare av de situationer där viruset är väl anpassade till värdcellen och effektivt motverka värd försvar vägar som är riktade i skärmen.
På grund av de ovanstående funderingar kring traditionella virus-host interaktion screeningmetoder, utvecklade vi ett nytt paradigm för att studera virus-värd-interaktioner som utnyttjar naturligt misslyckade arbovirus infektioner i fjärilsarter insekt celler. Denna strategi härrör från en observation att det väl studerat människors arbovirus, VSV, genomgår en misslyckade infektion i celler från gypsy moth (L. dispar)13. VSV är naturligt överförs av sorgmyggor insekter (dvs, sandmyggor) till däggdjur värdar och har visat experimentellt att infektera ett brett utbud av ryggradslösa djur och ryggradsdjur värdar både i cell kultur och i vivo14. 11-kb negativ-sense enkelsträngat RNA genomet hos VSV kodar fem subgenomic mRNA som översätts varje till de proteiner som utgör den höljeförsedda virion. VSV omvänd genetiska system har dock möjliggjorde skapandet av replikering-behöriga stammar kodning LUC eller fluorescerande proteiner, förutom de fem naturliga VSV gen produkter15,16,17. Eftersom dessa reporter proteiner inte införlivas i den VSV virion, ger de en bekväm avläsning för VSV genuttryck som uppstår efter posten. Använda VSV stammar kodning GFP eller LUC, har vi tidigare visat att VSV genuttryck är strängt begränsad vid tillträdeet av LD652 celler och att inte öka VSV titrar av 72 timmar efter infektion (hpi). Däremot leder coinfection av LD652 celler med VSV och de däggdjur poxvirus, vacciniavirus (VACV), till logaritmisk ökningar i både VSV genuttryck och titrar av denna tidpunkt. VACV genomgår tidiga genuttryck, DNA-replikation och sena genuttryck i LD652 cell infektioner, men VACV replikering cykeln är slutligen misslyckade på grund av ofullständig virion morfogenes18. Det stora ~ 192 kb DNA-genomet hos VACV kodar > 200 proteiner, varav många Visa immunmodulerande egenskaper som främjar virusreplikation genom dämpningen av värd immunsvar19. Därför hypotesen vi som ”räddning” av VSV replikering i LD652 celler av VACV coinfection var troligen medierad av VACV immunomodulatorer som hämmas L. dispar Svaren normalt begränsar VSV replikering. Till stöd för detta räddar behandling av LD652 celler med värd RNA-polymeras II-hämmaren actinomycin D också VSV replikering i LD652 celler, vilket indikerar att transkription-beroende värd Svaren blockera VSV replikering efter posten13.
De ovanstående observationerna tyder på att den naturligt restriktiva karaktären av LD652 celler till VSV infektion kan ge en relativt låg bakgrund när screening för de villkor som förbättrar VSV-kodade reporter signaler (dvs, de som hämmar värd antivirala försvar). Här, tillhandahåller vi metoder för att med hjälp av fluorescens eller LUC-baserade analyser till skärmen för villkor som lindra VSV begränsning i fjärilsarter celler. Först, vi visar hur dessa analyser kan användas för att identifiera viralt kodade immunmodulerande faktorer som bryta VSV begränsning under antingen coinfection experiment eller via ektopisk uttryck för kandidat viral faktorer. Som ett exempel illustrera vi hur vi använt dessa screening metoder för att identifiera poxvirus-kodade A51R proteiner som en ny familj av immunmodulerande faktorer som rädda VSV replikering i avsaknad av andra poxvirus faktorer13. Det andra illustrera vi hur RNAi screening i restriktiva VSV-LD652 cell infektioner kan användas för att direkt identifiera eukaryota värd faktorer inblandade i arbovirus begränsning13.
Här har vi beskrivit enkel fluorescens – och luminiscens-baserade analyser till skärmen för villkor som rädda VSV replikering i restriktiva fjärilsarter cellkulturer. Den misslyckade infektionen i VSV i fjärilsarter celler skapar en utmärkt signal-brus-förhållande när testmetoder för VSV genuttryck. Till exempel de LU signaler detekteras i lysates från enda VSV-LUC infektioner var ~ 1.000-faldig högre än i mock-infekterade lysates, men dessa signaler endast ändrats ungefär dubbelt under en 72-h tid. Däre…
The authors have nothing to disclose.
D.G. stöddes av finansiering från University of Texas Southwestern Medical Centers begåvad Scholars Program. Författarna tackar Michael Whitt (University of Tennessee Health Science Center) och Sean Whelan (Harvard Medical School) för tillhandahållande av VSV-DsRed och VSV-LUC. Författarna också tacka Gary Luker (University of Michigan Medical School) för slag gåvan av VACV-FL-GFP stammen.
6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 |