Summary
Гортаноглотки железы Ацинус размер является надежной мерой медсестра мед пчелы питания. Здесь мы предоставляем подробный протокол для рассечения, окрашивание, изображений и измерение медсестра пчел гортаноглотки железы Ацинусы.
Abstract
Медсестра гортаноглотки железы производят белковые фракции работника и маточное молочко, которое подается для развивающихся личинок и королев. Эти парные железы, которые находятся в голове пчелы очень чувствительны к количество и качество пыльцы и пыльцы заменяет, что медсестра пчела потребляет. Желез уменьшаются, когда медсестры кормят недостаточно диеты и велики, когда они кормили полной диеты. Потому, что медсестра гортаноглотки железы размер является надежным показателем медсестра питания, важно, что тех, кто обучается мед пчелы питания знают как измерить эти железы. Здесь мы предоставляем подробные методы для рассечения, окрашивание, изображений и измерение медсестра пчел гортаноглотки желез. Мы представляем сравнения окрашенных и неокрашенных ткани и данных, которые использовались для изучения влияния пыльцы на размер железы. Этот метод был использован для тестирования как диета влияет на размер гортаноглотки железы, но имеет дальнейшего использования для понимания роли этих желез в улье здоровья.
Introduction
Медоносных пчел имеют важное значение для сельского хозяйства, потому что они опыляют различных культур, которые потребляются людьми и животными. Большое внимание было уделено сокращение популяций пчел мед как колонии потери парить около 30-40% каждый год в Соединенных Штатах1 и 10 – 15%, в Европе2,3. Несколько факторов, включая сокращение доступа к высокому качеству корма, вероятно, действовать сообща в целях негативно сказаться на здоровье пчел мед. Монокультуры, засуха, неустойчивых пчеловодства практики и других факторов уменьшение разнообразия и количества природных пыльца для колоний4,5. Потому, что пчелы получают почти все их пищевых белков и липидов из пыльцы, сокращение доступа к пыльцы может серьезно ограничить здоровья личности и колонии.
Гортаноглотки железы являются секреторной структур, расположенных в голове пчелы между глаз и мозга6. При нормальных обстоятельствах траекторию развития и функциональных желез зеркало, что пчелы, когда они находятся в. В возрасте примерно дней 5 – 10 пчела выполняет кормящих поведения в улье. В это же время гортаноглотки железы достигают их пикового размера и секреторную потенциала, производить крупные белковые фракции пищу расплода или желе, кормили развивающихся личинок и других взрослых, такие, как королева. На этот пик размер желез напоминают гроздь винограда, где каждый виноград является дискретной доли структуры, известной как Ацинус (во множественном числе: ацинусов). Как пчела рабочих возрастов и принимает различные задачи в улье, гортаноглотки желез сокращаться и брать на себя различные функции, как разрушение сахара в нектар7,,8. Гортаноглотки желез таким образом коррелирует с возрастом пчелы и их возраста связанные задачи.
Медсестра гортаноглотки железы размер чувствителен к количеству и качеству белка в их диета9,10,11. Когда медсестра пчел хорошо питаться, их желез являются большими. В то время как желез являются небольшими когда пчела лишен пыльцы, особенно в первую неделю взрослых развития. Чтобы определить состояние питания медсестра пчел, исследователи обычно измеряют гортаноглотки желез, либо непосредственно измерения железы Ацинус размер11,12,,1314 или белка содержание15,16 или путем измерения протеин содержание11 или свежие вес17 всю голову, где они расположены. Каждый метод имеет свои плюсы и минусы. Мы предпочитаем резолюции, полученные от измерения железы ацинусов, хотя этот метод может быть сложным в два основных пути. Первая задача – правильно идентифицировать и анализировать железы. Второй является получение точное измерение каждого Ацинус. Под микроскопом рассечения света железы появляются четкие или молочно белый и границы Ацинусы может быть трудно определить. Имея инструменты лучше определить края ацинусов и увеличить вероятность получения точных железы измерения выгодно кому изучать питание мед пчелы.
Здесь мы показать заинтересованным исследователям как вскрыть, пятно, изображения и измерить гортаноглотки желез, так что точных измерений Ацинус размера может быть достигнуто. Метод, который мы описываем предлагает исследователям легко, точные и воспроизводимые метод для достижения нескольких измерений железы в относительно короткий период времени после того, как экспериментатор практикуется достаточно. Один уверенно можно измерить желез почти 10 лиц в чуть более часа. Мы предлагаем детали на как метода, так и материалы, необходимые для получения этих измерений. Самые важные аспекты методов, описанных ниже, надлежащего вскрытия и пятнать желез. Хотя мы захватить увеличенного изображения и измерить Ацинусы с коммерческим программным обеспечением, методы, которые мы представляем может быть легко адаптирована для других платформ18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. разбор и пятнать гортаноглотки желез от медсестра рабочих
- Сделайте плиты рассечение воск плавления воска прохладно параметр в малых (60 x 15 мм) или больших (100 x 15 мм) стекла Петри. Воск полностью остыть перед использованием пластины для вскрытия.
- Для каждой пчелы для обработки, подготовить 20 мкл рабочего раствора Гимзы 1:20 (1:20 v/v подготовленных Гимзе в фосфат амортизированное saline (PBS: 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4)).
Предупреждение: Гимзе содержит метанола и является легковоспламеняемым. Он токсичен при проглатывании и вдыхании, или если она приходит в контакт с кожей. Она должна удаляться согласно требованиям местные учреждения.
Примечание: Всегда сделайте свежий рабочий раствор только для текущего пакета образцов, потому что Гимзе быстро снижается после того, как она растворяется. Если осадок развивается отказаться от разбавленных пятно. - Накапайте 20 мкл Гимзе в скважины Микроскоп слайды и 50 – 100 мкл saline на слайд, прилегающих к колодцу.
- Снимите головку с пчелой, используя ножницы микро Весна 10 мм и вставлять голову лицевой стороне вверх воск рассечение пластину с помощью щипцов и воск резьба пера. Придавить голову в пластину воск для дополнительной стабильности, вставив ПИН в глаза и в рот.
- Использование резкого бьющихся лезвием бритвы фиксированной в тиски PIN-код, сделать небольшой (~ 2-3 мм) разрез между глазами и мандибулы на каждой стороне лицевой панели. Осторожно запустить микро ножницы под лицевой и вырезать усиков нерв, который проходит между антеннами и мозг.
- С помощью тонкой щипцы, захватить лицевой рот, переверните его вверх, и закрепите его на пластину воск с тонкой точке щипцы и ПИН-код. При необходимости полностью удалите пластину лицо.
- Накапайте 20 мкл PBS на срезе открыть раздел головы.
Примечание: Желез может плавать вверх на данный момент, или один должны искать их. Желез выглядят как нитка жемчуга и расположены на верхней части мозга, если нетронутыми. - Используйте супер тонкой точке щипцами осторожно удалить одну из гортаноглотки железы (железы может сломаться, требуя его будут удалены в сегментах) и немедленно передать железы Гимзе на слайде микроскопии.
- Разрешить железы для инкубации в раствор Гимза 5 минут, а затем использовать щипцы для передачи в железе в пул физиологического раствора на тот же слайд. При необходимости, сократить железы на более мелкие куски с микро ножницами.
Примечание: Это помогает сделать железы лежат в плоскости льстить, что облегчает для получения четких изображений Ацинусы железы.
2. Измерение гортаноглотки Ацинусы железы
- Включите микроскопом и открыть программу измерений. Включите источник света для микроскопа, если это уже не на. Набор микроскоп увеличением до 10 X.
- Найдите желез и сосредоточиться увеличенное изображение в окуляр, без компьютера. Увеличить масштаб до 60-80 X и резкость изображения в окуляр.
- На вкладке «получить» корректировать и сосредоточиться желез на живой изображения на компьютере.
- Введите описание имя/образец изображения в поле «Имя образа» и нажмите «Приобрести изображение» принимать изображение желез для дальнейших измерений.
- Выберите вкладку «Анализа» выберите «области инструмента (выделены Дополнительные рис. 1A) и снимите флажок «значение» в разделе «Отображать метки», который будет также отменить «блок». Установите все остальные настройки по умолчанию (Дополнительные рис. 1A).
Примечание: Программное обеспечение автоматически калибрует области измерений согласно уровень увеличения, так, что площадь, полученные из нижней увеличение же, что полученные с большим увеличением. - Измерьте каждый Ацинус, постоянно нажимая или непрерывно удерживая нажатой левую кнопку мыши во время трассировки Ацинус периметру так же тщательно, как можно скорее. Измерения по меньшей мере 10 Ацинусы на пчел.
Примечание: Более может потребоваться в зависимости от эксперимент (см. обсуждение). Это может потребовать несколько изображений/секций железы найти достаточно четко, правильно ориентированные Ацинусы для измерения. - После того, как были измерены все Ацинусы с одного изображения, выберите «Создать отчет». Убедитесь, что параметры выбраны, как показано в дополнительном Рисунок 1B и нажмите кнопку «Экспорт».
- Сохраните отчет как желаемого. Если файл уже был создан для набора образцов и добавляются дополнительные измерения, убедитесь, что файл отчета не открыт, так что новые данные будут добавлены в существующий файл.
- Закончив, выключите камеры микроскопа и источник света. Протрите жидкости и желез у микроскопии слайды и безопасно распоряжаться любой используемый материал. Промойте слайды с дистиллированной водой и протрите этанола (70% v/v в воде) для повторного использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гортаноглотки железы были расчленены от медсестра рабочих и визуализированы с и без пятен на 60-80 X увеличением (рис. 1). В неокрашенных ткани трудно найти надлежащий контраст полностью сосредоточиться и определить края Ацинусы. В окрашенные ткани края Ацинусы острые из-за улучшения контраста между окрашенных тканей и белый фон.
Рисунок 1: незапятнанное (A, B) или витражи (C, D) гортаноглотки желез от медсестра престарелых работников. Обратите внимание, что хотя желез являются видимыми в обоих случаях, окрашенных желез более четко и поэтому легче измерить. Также, обратите внимание, что несколько курчавый и спиральный морфология всей железы результатов в разных плоскостях фокуса. Железы могут быть секционного чтобы это предотвратить. Масштаб баров = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рабочие пчелы мед были собраны на ≤18 h после эмерджентности и были назначены два различных диетических режимов: диета Весна пыльцы, естественным образом присутствуют в Тусоне, штат Аризона, США смешивают с медом или просто мед с нет пыльцы. Чтобы ограничить эти диеты в ульях пчел, были использованы вставные проволочные клетки — как описано в предыдущих исследованиях13,14 — удерживающего пчел на плотность примерно одна Пчела на квадратный сантиметр. Каждое лечение было повторено в трех ульев (N = 3). Пчелы, подвергается либо диетического режима были собраны на 5 d и 8 d возраста для анализа их гортаноглотки желез. С помощью рассечение, окрашивание и методы, описанные выше, измерения гортаноглотки железы Ацинусы этих пчел были измеряется и сравнивается (рис. 2). В каждом из трех ульев три пчелы были измерены для каждого возраста x диета лечение комбинации. Десять Ацинусы были измерены для каждой пчелы. Ацинусы измерения были среднем для каждой пчелы для получения размер средняя Ацинус на пчел. Эти значения были затем среднем для получения значения для возраста x сочетание лечения в этот куст. Анализа ANOVA Ацинус измерения показали, что диета (F1,8= 2,65, p = 0,001), возраст (F1,8 = 10.03, p = 0,013) и взаимодействие между диета x возраст (F1,8= 0.02, p = 0,020) имели значительные последствия. Мы наблюдали, что гортаноглотки железы вырос с течением времени в пчел, которые кормили пыльцы, как определяется Тьюки HSD. Этот шаблон был ранее продемонстрировали9,11,19. Размер Ацинусы железы не отличается между 5 d и 8 дней старых пчел когда пчелы были лишены пыльцы.
Рисунок 2: Размеры железы гортаноглотки сытых медсестер и тех, кто лишен пыльцы. Рабочие скармливали рацион пыльцу и мед (серые полосы) или диета меда самостоятельно (Белый баров) для 5 или 8 d. В это время пчелы были внутри улья и клетке мед или мед и пыльца. Их гортаноглотки железы Ацинусы были измерены как описано выше. Планки погрешностей представляют стандартная ошибка для размера средней Ацинус через три колонии (N = 3) испытания. Три пчелы были измерены от каждой колонии для каждого возраста лечения x диета лечение комбинации. Бары, соединены звездочка значительно отличаются друг от друга согласно Тьюки HSD (α = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Пчелы может быть сохранена в клетках отдельно от улья и кормили определенной диеты. Рабочие пчелы мед были собраны в ≤ 18 h после эмерджентности и были назначены акрилового стекла клетки (100 пчел в клетке) с одним из четырех диетических режимов: диета, содержащая нет пыльцы или диеты, содержащей один из трех собрали пчелы пыльца: «миндаль» пыльцы из миндаля Орчард монокультуры, «пустыне» пыльцы из пустыни Сонора, содержащие смесь пустынных растений или «ГП» пыльцы из колоний, расположенных в Юго-Восточной части Соединенных Штатов, как описано в Corby-Харрис et al. 12. сахарозы (50% w/v), вода и пыльца (при необходимости) были предоставлены ad libitum. Для каждого из четырех диетических курсов, что приводит к в общей сложности 20 клеток были построены пять клетки. На 8 d возраст гортаноглотки желез десяти пчел были собраны и измерить. Десять Ацинусы были измерены для каждого человека. Размер Средняя Ацинус была рассчитана для каждой пчелы, и эти значения были использованы для получения Ацинус среднего размера для каждой клетке. Мы наблюдали, что размер железы гортаноглотки чувствительны к присутствию пыльцы в рационе (пыльца против не пыльцы: t1 = 5,64, p < 0.0001) и тип предоставляемых пыльцы (миндаль против пустыни против SE пыльцы: F2,148 = 8.06, p = 0.0005; Рисунок 3). Пчелы кормят пустыни или миндаля пыльцы было эквивалентные железы размеров. Пчелы кормят SE пыльцы желез, которые были меньше, чем пчелы кормят миндаля или пустыни пыльцы.
Рисунок 3: Размеры железы гортаноглотки медсестра пожилых работников кормили три различных типов пыльцы или лишенных пыльцы. Медсестра пчел были помещены в клетках после эмерджентности и скармливали рацион, состоящий из сахарозы в одиночку (без пыльцы) или сахароза и один из трех пыльцы (миндаль, пустыни или SE пыльцы) до 8 d возраста. Представляют баров ошибка стандартная ошибка для среднего Ацинус размер в выборку из пяти клетки пчелы (N = 5). Десять пчелы были отобранных и измеренных в каждой клетке, чтобы получить средний Ацинус размер для клетки и вычисления различия между клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл 1: скриншоты программного обеспечения измерений при измерении Ацинусы железы (A) и создание отчета (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гортаноглотки железы размер чувствителен к количество белков и пыльцы в рационе питания и критических маркер питания в молодых взрослых пчел. Здесь мы демонстрируем недорогой и воспроизводимые способ вскрыть и измерения этой ткани. Эти ткани может быть трудно анализировать, но с практикой, можно получить все более чистых вскрытия с ткани относительно нетронутыми. Основным преимуществом метода, представленные здесь является, что окрашенные ткани, что позволяет исследователю четко визуализировать границы каждой железы Ацинус. Без пятен границы этих Ацинусы трудно визуализировать и сосредоточить под микроскопом, которая уменьшает способность исследователя для получения точных Ацинус измерения. Несмотря на простоту окрашивание и получения четкого изображения для ацинусов следует рассмотреть несколько критических точек для получения точных измерений; Эти вопросы обсуждаются ниже.
Крупных желез берутся сытых пчел, которые приблизительно 7-10 дней возраст9,20. Это всегда легче, особенно когда научиться анализировать эти ткани, первой практике рассечения крупных желез перед двигать на мелких желез, как они могут быть небольшие, хрупкие и трудно вскрыть. Свежие ткани также дает лучший вскрытия. Если один должны заморозить пчелы для определенного периода времени до вскрытия, знают, что дольше, что пчела заморожен, тем более хрупкой ткани становится. Это может сделать проблематичным вскрытия. С практикой и острые щипцы исследователь будет в конечном итоге преодолеть эти проблемы. Мы не заметили разницу в пятнать между замороженные и свежие ткани.
Свежее пятно является необходимым для того, чтобы получить правильное окрашивание желез. Старые пятна можно комок, оставляя пятна, не в состоянии должным образом проникают в ткани. Важно, что свежее пятно подготавливаться небольшими партиями, примерно каждый час. Это обеспечит надлежащий контраст между ткани и фон под микроскопом, что приводит к резкие изображения с определенным Ацинус краями. Это также полезно для работы с широкий спектр пятном разведениях, если пятно не пропитывают ткань правильно. Мы обнаружили, что в 1:20, свежий запас рабочей пятно работает лучше, но другие разведениях может также работать если желания пятно темнее или светлее.
Мы использовали камеры, прикрепленной к рассечения микроскоп и коммерчески доступное программное обеспечение для измерения и записи данных Ацинусы. Камеры и программное обеспечение являются довольно дорогостоящими и поэтому не могут быть доступны для всех лабораторий. Хотя это необходимо иметь камеры, прикрепленной к рассечения микроскоп для того, чтобы получить изображение и измерить ацинусов, что существует несколько вариантов ниже стоимости, включая бесплатное программное обеспечение18, который может быть использован.
Здесь, мы покажем основные шаги для окрашивания и измерения гортаноглотки железы ацинусов, но подчеркиваем, что оно до исследователь решить сколько Ацинусы мера, следует ли измерять Ацинусы на одной или обеих желез и ли измерить несколько областей каждой железы. Например для того чтобы обнаружить более тонкие различия между экспериментальное лечение, один может потребоваться измерить более 10 Ацинусы на железе и более чем 10 пчел за лечение. Мы не заметили каких-либо различий Ацинусы размер на основе их расположения на железе. Также мы не заметили никаких различий в размерах ацинусов, которые расположены на левой или правой желез. Если исследователь заподозрит любого размера различия, несколько областей гортаноглотки железы и возможно обеих желез должны быть измерены.
Исследователи должны быть в состоянии успешно получить точные измерения размера железы гортаноглотки, используя протокол, описанные здесь для рассечения и окрашивание ткани железы и измерения Ацинусы. С практикой эти измерения можно получить довольно быстро, позволяя исследователя для обработки нескольких образцов в один присест. Мы ожидаем, что больше исследователей будет использовать методы, описанные здесь, как они стремятся понять факторы, влияющие на размер гортаноглотки железы, и как эти железы относятся к колонии здоровья и индивидуального поведения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана внутренних средств от USDA-ARS (номер проекта: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA является работодатель равных возможностей и поставщика.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
