Summary
Hypopharyngeal kirtel acinus størrelse er en robust foranstaltning af sygeplejerske honey bee ernæring. Her give vi en detaljeret protokol for dissekere, farvning, imaging og måle sygeplejerske bee hypopharyngeal kirtel acini.
Abstract
Sygeplejerske hypopharyngeal kirtler producere proteinfraktion af arbejdstager og royal jelly, der er fodret med udvikling af larver og queens. Disse parrede kirtler, der er placeret i hovedet af bi er meget følsomme over for mængden og kvalitet af pollen og pollen erstatninger, sygeplejerske Bien bruger. Kirtler blive mindre, når sygeplejersker fodres mangelfuld kost og er stor, når de fodres komplet kost. Da sygeplejerske hypopharyngeal kirtel størrelse er en stærk indikator for sygeplejerske ernæring, er det vigtigt, at de studerer honey bee ernæring ved, hvordan man måler disse kirtler. Her, leverer vi detaljerede metoder for dissekere, farvning, imaging og måle sygeplejerske bee hypopharyngeal kirtler. Vi præsenterer sammenligninger af unstained og farvede væv og data, der blev brugt til at studere virkningerne af pollen på kirtel størrelse. Denne metode har været brugt til at teste hvordan kosten påvirker hypopharyngeal kirtel størrelse men har yderligere brug for at forstå rollen, som disse kirtler i hive sundhed.
Introduction
Honningbier er vigtige for landbrug, fordi de bestøve en række afgrøder, der forbruges af mennesker og dyr. Meget opmærksomhed har betalt til nedgangen i bibestandene honning som koloni tab hover omkring 30-40% hvert år i USA1 og 10-15% i Europa2,3. Flere faktorer, herunder reduceret adgang til høj kvalitet foder, sandsynligvis handling sammen til negativ indflydelse på honey bee sundhed. Monokultur, tørke, uholdbare biavl praksis og andre faktorer nedsætte mangfoldighed og mængden af naturlige pollen til kolonier4,5. Fordi honningbier stammer næsten alle deres kosten proteiner og lipider fra pollen, kan reduceret adgang til pollen alvorlig grad begrænse enkelte og koloni sundhed.
Hypopharyngeal kirtler er sekretoriske strukturer placeret i biens hovedet mellem øjnene og hjernen6. Under normale omstændigheder udviklingstoksicitet og funktionelle bane af kirtler spejle for bi de er placeret i. På ca. 5 – 10 dage med alder udfører bien sygepleje adfærd i hiven. Samtidig er denne nå hypopharyngeal kirtler deres maksimale størrelse og sekretoriske kapacitet, producerer den store proteinfraktion af yngel mad eller gelé fodret til udvikling af larver og andre voksne, som dronningen. På denne maksimale størrelse kirtler ligner en klase druer, hvor hver drue er en diskret lap struktur kendt som acinus (flertal: acini). Som arbejdstager bi aldre og tager på forskellige opgaver i hiven, hypopharyngeal kirtler skrumpe og tage på forskellige funktioner, som nedbryde sukker nektar7,8. Hypopharyngeal kirtler er således korreleret med en alder af bi og deres alder-associerede opgave.
Sygeplejerske hypopharyngeal kirtel størrelse er følsomme over for mængden og kvaliteten af protein i deres kost9,10,11. Når sygeplejerske bier er godt ernæret, er deres kirtler stor. Kirtler er små når BI er berøvet af pollen, især i den første uge af voksne udvikling. For at bestemme den ernæringsmæssige status af en sygeplejerske bi, forskere typisk måle hypopharyngeal kirtler, enten ved direkte måling af kirtel acinus størrelse11,12,13,14 eller protein indhold15,16 eller ved at måle proteinet indhold11 eller vægt friske17 i hele hovedet, hvor de er placeret. Hver metode har sine egne fordele og ulemper. Vi foretrækker opløsning fremstillet måling kirtel acini, selv om denne metode kan være udfordrende i to vigtige måder. Den første udfordring er at identificere og dissekere kirtel ordentligt. Andet er at opnå en nøjagtig måling af hver acinus. Under en dissekere lysmikroskop kirtler vises klart eller mælket hvidt og acini grænser kan være vanskeligt at definere. At have værktøjer til bedre definere kanten af acini og øge sandsynligheden for at opnå nøjagtige kirtel målinger er til gavn for nogen at studere honey bee ernæring.
Her, viser vi interesserede forskere sådan dissekere, bejdse, billede, og måle hypopharyngeal kirtler, så der kan opnås nøjagtige målinger af acinus størrelse. Metoden beskriver vi tilbyder forskere en nem, nøjagtige og reproducerbare metode til at opnå flere kirtel målinger i en relativt kort periode når eksperimentatoren er tilstrækkeligt praktiseres. Man kan trygt måle kirtler i næsten 10 personer i lidt over en time. Vi tilbyder detaljer på både metode og materialer, der er nødvendig for at opnå disse målinger. De vigtigste aspekter af de metoder, der er skitseret nedenfor er ordentlig dissektion og farvning af kirtler. Selv om vi fange de forstørrede billeder og måle acini med kommerciel software, kan de metoder, vi præsenterer nemt tilpasses til andre platforme18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dissekere og farvning Hypopharyngeal kirtler fra sygeplejerske arbejdstagere
- Gøre en voks dissektion plade ved smeltning cool indstilling voks ind i en lille (60 mm x 15 mm) eller store (100 mm x 15 mm) glas petriskål. Cool voks helt inden brug pladen til dissektioner.
- For hver bi skal behandles, forberede 20 µL af en 1:20 arbejder Giemsa løsning (1:20 v/v forberedt Giemsa farvning i fosfatbufferet saltopløsning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4)).
Forsigtig: Giemsa pletten indeholder methanol og er brandfarligt. Det er giftigt ved indtagelse, indånding, indtagelse, eller hvis det kommer i kontakt med huden. Det skal bortskaffes i henhold til den lokale institution krav.
Bemærk: Sørg altid en frisk brugsopløsning kun for den aktuelle batch af prøver da Giemsa pletten nedbrydes hurtigt når det er fortyndet. Kassér den fortyndede pletten, hvis en bundfaldet udvikler. - Med pipette overfoeres 20 µL Giemsa farvning i wells mikroskop slides og 50-100 µL saltvand i tilstødende til brønden diaset.
- Fjern hoved fra en bi, ved hjælp af 10 mm micro-foråret saks, og integrere hoved forsiden op i voks dissektion plade med pincet og en voks-udskæring pen. PIN hovedet ned i voks pladen for ekstra stabilitet ved at indsætte pins i øjnene og en i munden.
- Ved hjælp af en skarp knuses barberblad fast i en pin skruestik, lave et lille (~ 2 – 3 mm) indsnit mellem øjne og hvaltænder på hver side af forpladen. Forsigtigt køre mikro saksen under forpladen og skære den antennal nerve, som løber mellem antennerne og hjernen.
- Bruger fine pincet, grab forpladen af munden, vend det op, og fastgøre den til voks plade med fin spids pincet og en pinkode. Hvis det er nødvendigt, skal du fjerne forpladen helt.
- Med pipette overfoeres 20 µL PBS på snittet åbner afdeling i hovedet.
Bemærk: Kirtler kan flyde op på dette tidspunkt eller man skal søge efter dem. Kirtler ligne en perlerække af perler og er placeret på toppen af hjernen hvis intakt. - Bruge super fin spids pincet forsigtigt fjerne en af de hypopharyngeal kirtler (kirtel kan bryde, kræver det at blive fjernet i segmenter), og straks overføre kirtel til Giemsa pletten på diasset mikroskopi.
- Tillade kirtel at udruge i opløsningen Giemsa i 5 min, og derefter bruge pincet til at overføre kirtlen til puljen af saltvand på det samme dias. Hvis det er nødvendigt, skæres kirtlen i mindre stykker med micro saksen.
Bemærk: Dette medvirker til at gøre kirtler ligger i en fladere fly, hvilket gør det lettere at få klare billeder af kirtel acini.
2. måling af hypopharyngeal kirtel Acini
- Tænde mikroskopet og åbne programmet måling. Tænde lyskilde for mikroskopet, hvis det ikke allerede er på. Sæt mikroskop forstørrelse til 10 X.
- Find kirtler og fokusere den forstørrede billede i okularet, uden at computeren. Øge forstørrelsen til 60 – 80 X og fokusere billedet i okularet.
- Under fanen 'erhverve' justere og fokusere kirtler på det levende billede på computeren.
- Skriv billede navn/prøve beskrivelse i boksen ' Image' og klik 'Erhverve billede' for at tage et billede af kirtler for yderligere målinger.
- Vælg fanen 'Analyse' sluttet den 'område tool"(fremhævet i supplerende figur 1A) og uegennyttig 'værdi' under 'Visningsetiketterne', som også vil fravælge 'enhed'. Alle andre indstillinger angivet til standard (supplerende figur 1A).
Bemærk: Softwaren automatisk kalibrerer område målingerne ud fra forstørrelse så området fra en lavere forstørrelse er den samme som hidrørende fra en højere forstørrelse. - Mål hver acinus ved kontinuerligt at klikke eller løbende holde venstre museknap nede mens sporing acinus perimeter så omhyggeligt som muligt. Måle mindst 10 acini pr. bi.
Bemærk: Mere kan være nødvendige afhængigt af eksperimentet (Se diskussion). Det kan kræve flere billeder/dele af kirtlen til at finde nok klare, ordentligt orienteret acini for måling. - Når alle acini fra et enkelt billede er blevet målt, Vælg 'Opret rapport'. Sikre, at indstillinger er markeret som vist i supplerende figur 1B og klik på 'Eksporter'.
- Gemme rapporten som ønsket. Hvis en fil er allerede blevet oprettet for sæt af prøver og yderligere målinger bliver tilføjet, sikre at rapportfilen ikke er åben, således at de nye data føjes til den eksisterende fil.
- Når du er færdig, slukke mikroskop kamera og lyskilde. Tørre væsken og kirtler ud mikroskopi dias og sikker bortskaffelse af brugt materiale. Skyl dias med destilleret vand og tørres af med ethanol (70% v/v i vand) til genbrug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypopharyngeal kirtler var dissekeret fra sygeplejerske arbejdstagere og visualiseret med og uden plet på 60 – 80 X forstørrelse (figur 1). I unstained væv er det vanskeligt at finde passende kontrast til fuldt fokus og definere kanterne af acini. I den farvede væv er kanterne af acini skarpe på grund af den forbedrede kontrast mellem den farvede væv og den hvide baggrund.
Figur 1: Unstained (A, B) eller plettet (C, D) hypopharyngeal kirtler fra sygeplejerske-alderen arbejdstagere. Bemærk, at mens kirtler er synlige i begge tilfælde, de farvede kirtler er mere veldefinerede og derfor lettere at måle. Bemærk at de lidt krøllede og rullet morfologi af hele kirtlen medfører også forskellige fokale planer. Kirtlen kan være sectioned for at forhindre dette i at ske. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Honey bee arbejdstagere blev indsamlet i ≤18 h efter fremkomsten og blev tildelt to forskellige kost regimer: en kost af foråret pollen naturligt er til stede i Tucson, Arizona, USA blandet med honning eller bare honning med ingen pollen. For at begrænse bierne til disse kostvaner i hiven, push-in wire bur blev brugt — som beskrevet i tidligere undersøgelser13,14 — begrænser bierne med en tæthed på cirka én bee pr. kvadratcentimeter. Hver kosten behandlingen blev gentaget i tre nældefeber (N = 3). Bier udsat for enten diætprodukter regime blev indsamlet på 5 d og 8 d alder for analyse af deres hypopharyngeal kirtler. Ved hjælp af dissektion, farvning, og målemetoder, der er skitseret ovenfor, hypopharyngeal kirtel acini af disse bier blev målt og sammenlignet (figur 2). I hver af de tre nældefeber, blev tre bier målt til hver alder x kost behandling kombination. Ti acini blev målt for hver bi. Acini målinger blev gennemsnit for hver bi for at opnå en gennemsnitlig acinus størrelse pr. bi. Disse værdier blev derefter gennemsnit for at få en værdi for alderen x behandling kombination for at hive. ANOVA analyse på acinus målinger viste, at diæt (F1,8= 2,65, p = 0,001), alder (F1,8 = 10,03, p = 0,013), og samspillet mellem kost x alder (F1,8= 0.02, p = 0.020) havde betydelige virkninger. Vi observeret, at hypopharyngeal kirtlerne voksede over tid i de bier, der blev fodret pollen, som bestemmes af en Tukey HSD. Dette mønster har været demonstreret tidligere9,11,19. Størrelsen af kirtel acini afviger ikke mellem 5 d og 8 dage gamle bier når bierne blev frataget pollen.
Figur 2: Hypopharyngeal kirtel størrelser af velnærede sygeplejersker og dem frataget pollen. Arbejderne blev fodret med en kost af pollen og honning (grå søjler) eller en diæt af honning alene (hvid barer) for 5 eller 8 d. I løbet af denne tid, bier var inde i bikuben og bur over honning eller honning og pollen. Deres hypopharyngeal kirtel acini blev målt som beskrevet ovenfor. Fejllinjer udgør standardfejl for den gennemsnitlige acinus størrelse på tværs af de tre kolonier (N = 3) testet. Tre bier blev målt fra hver koloni for hver behandling alderen x kost behandling kombination. Barer forbundet af en stjerne er væsentligt forskellige fra hinanden efter en Tukey's HSD (α = 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bier kan også holdes i bure adskilt fra hiven og fodret defineret kost. Honey bee arbejdstagere blev indsamlet på ≤ 18 h efter fremkomsten og blev tildelt til akryl glas bure (100 bier pr. bur) med en af fire kosten regimer: en kost, der indeholder ingen pollen eller en kost, der indeholder et af tre bi-indsamlet pollen: "mandel" pollen fra en mandel Orchard monokultur, "ørken" pollen fra Sonoran Desert indeholdende en blanding af ørken planter eller "SE" pollen fra kolonier ligger i det sydøstlige USA, som beskrevet i Corby-Harris et al. 12. saccharose (50% w/v), vand, og pollen (hvis relevant) blev leveret ad libitum. Fem bure blev bygget for hver af de fire kosten behandlinger, hvilket resulterer i alt 20 bure. På 8 d af alder, blev hypopharyngeal kirtler i ti bier indsamlet og målt. Ti acini blev målt for den enkelte. Den gennemsnitlige acinus størrelse blev beregnet for hver bi og disse værdier blev brugt til at opnå en gennemsnitlig acinus størrelse for hvert bur. Vi observerede, at hypopharyngeal kirtel størrelse er følsomme over for både tilstedeværelsen af pollen i kosten (pollen versus ingen pollen: t1 = 5.64, p < 0,0001) og typen af pollen forudsat (mandel vs ørken vs. SE pollen: F2,148 = 8.06, p = 0.0005; Figur 3). Bierne fodres ørken eller mandel pollen havde tilsvarende kirtel størrelser. Bierne fodres SE pollen havde kirtler, der var mindre end bierne fodres mandel eller ørken pollen.
Figur 3: Hypopharyngeal kirtel størrelser af sygeplejerske-alderen arbejdstagere fodret tre forskellige typer af pollen eller frataget pollen. Sygeplejerske bier blev placeret i bure efter fremkomsten og blev fodret med en kost bestående af saccharose alene (ingen pollen) eller saccharose og en af tre pollen (mandel, ørkenen eller SE pollen) indtil 8 d af alder. Fejllinjer udgør standardfejl for den gennemsnitlige acinus størrelse i bier stikprøven fra fem bure (N = 5). Ti bier var udtages og måles i hvert bur til at opnå en gennemsnitlig acinus størrelse for buret og til at beregne variationen blandt bure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: skærmbilleder af måling software mens måling kirtel acini (A) og oprettelse af rapporten (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypopharyngeal kirtel størrelse er følsomme over for mængden af protein og pollen i kosten og er en kritisk markør af næring i unge voksne bier. Her viser vi en billig og reproducerbar måde at dissekere og måle dette væv. Disse væv kan være vanskeligt at dissekere, men med praksis, man kan få i stigende grad renere dissektioner med væv forholdsvis intakt. Den største fordel ved metoden præsenteres her er, at vævet er plettet, som gør det muligt for forskeren at klart visualisere for hver kirtel acinus grænser. Uden en plet er for disse acini grænser svært at visualisere og fokus under mikroskop, som mindsker forskerens evne til at opnå en nøjagtig acinus måling. Trods lethed af farvning og opnå et klart billede til acini, bør flere kritiske punkter overvejes for at opnå nøjagtige målinger; disse er beskrevet nedenfor.
Store kirtler kommer fra velnærede sygeplejerske bier, der er ca. 7 – 10 dage med alder9,20. Det er altid nemmere, især når lære at dissekere disse væv, at første praksis dissekere store kirtler inden du flytter ind på mindre kirtler, som de kan være lille, skrøbelig og vanskelig at dissekere. Frisk væv giver også de bedste dissektioner. Hvis man skal fryse bi i en periode før dissektion, ved, at jo længere tid, at en bi er frosset, jo mere skrøbelige vævet bliver. Dette kan gøre dissektioner problematisk. Med praksis og skarpe pincet, vil forskeren til sidst overvinde disse problemer. Vi har ikke bemærket en forskel i farvning mellem frosne og ferske væv.
Friske pletter er nødvendige for at opnå ordentlig farvning af kirtler. Ældre pletter kan klumpe, forlader pletten ikke kan ordentligt gennemsyre væv. Det er vigtigt, at frisk pletten være forberedt i små partier, ca. hver time. Dette vil sikre passende kontrast mellem væv og baggrund under mikroskop, hvilket fører til skarpe billeder med definerede acinus kanter. Det er også nyttigt at arbejde med en vifte af pletten fortyndinger, hvis pletten ikke gennemsyre vævet korrekt. Vi fandt, at 1:20 friske arbejde status over pletten fungerer bedst, men andre fortyndinger kan også arbejde hvis man ønsker et mørkere eller lysere pletten.
Vi brugte en kamera knyttet til dissekere mikroskop og kommercielt tilgængelige software til at måle og registrere acini data. Kamera og software er noget dyrt og kan derfor ikke være tilgængelig for alle laboratorier. Selv om det er nødvendigt at have et kamera knyttet til dissekere mikroskop for at få billedet og måle acini der er flere lavere omkostninger muligheder, herunder gratis software18, der kan bruges.
Her viser vi grundlæggende trin til farvning og måling af hypopharyngeal kirtel acini, men understreger at det op til forsker at beslutte hvor mange acini til foranstaltningen, om at måle acini på én eller begge kirtler, og om at måle flere områder af hver kirtel. For eksempel for at opdage mere subtile forskelle blandt eksperimentelle behandlinger, kan man nødt til at måle mere end 10 acini pr. kirtel og mere end 10 bier pr. behandling. Vi har ikke bemærket nogen acini størrelse forskelle baseret på deres placeringer på kirtel. Vi har også ikke bemærket nogen forskelle i størrelser af druer, der er placeret på de venstre eller højre kirtler. Hvis forskeren har mistanke om nogen størrelse forskelle, bør flere områder af hypopharyngeal kirtel og måske begge kirtler måles.
Forskere skal kunne med held få nøjagtige målinger af hypopharyngeal kirtel størrelse ved hjælp af protokollen beskrevet her for dissekere og farvning kirtel væv og måle acini. Med praksis, kan disse målinger opnås temmelig hurtigt, så forskeren til at behandle flere prøver i et møde. Vi forventer, at flere forskere vil ansætte de metoder, der er skitseret her, som de søger at yderligere at forstå de faktorer, der påvirker hypopharyngeal kirtel størrelse, og hvordan disse kirtler vedrører koloni sundhed og individuelle adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af interne midler fra USDA-ARS (projektnummer: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA er en lige muligheder arbejdsgiver og udbyder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
