Summary
Hypopharyngeal ग्रंथि acinus आकार नर्स शहद मधुमक्खी के पोषण का एक मजबूत उपाय है । यहां, हम विच्छेदन, धुंधला, इमेजिंग, और मापने नर्स मधुमक्खी hypopharyngeal ग्रंथि acini के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Abstract
नर्स hypopharyngeal ग्रंथियों कार्यकर्ता और शाही जेली है कि लार्वा और क्वींस विकसित करने के लिए खिलाया जाता है के प्रोटीन अंश का उत्पादन । इन युग्मित ग्रंथियों कि मधुमक्खी के सिर में स्थित है अत्यधिक मात्रा और पराग और पराग विकल्प है कि नर्स मधुमक्खी की खपत की गुणवत्ता के प्रति संवेदनशील हैं । ग्रंथियों छोटे हो जब नर्सों की कमी आहार खिलाया जाता है और बड़े होते है जब वे पूरा आहार खिलाया जाता है । क्योंकि नर्स hypopharyngeal ग्रंथि आकार नर्स पोषण का एक मजबूत संकेतक है, यह आवश्यक है कि उन का अध्ययन शहद मधुमक्खी पोषण पता है कि इन ग्रंथियों को मापने के लिए । यहां, हम विच्छेदन, धुंधला, इमेजिंग के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं, और नर्स मधुमक्खी hypopharyngeal ग्रंथियों को मापने । हम दाग और दाग ऊतक और डेटा है कि ग्रंथि के आकार पर पराग के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया की तुलना उपस्थित । इस विधि का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कैसे आहार प्रभावों hypopharyngeal ग्रंथि का आकार लेकिन छत्ता स्वास्थ्य में इन ग्रंथियों की भूमिका को समझने के लिए आगे का उपयोग किया है ।
Introduction
शहद मधुमक्खियों कृषि के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि वे फसलों है कि मनुष्यों और जानवरों द्वारा भस्म कर रहे हैं की एक किस्म परागण । बहुत ध्यान कॉलोनी घाटे 30-40% के आसपास मंडराना के रूप में हनी मधुमक्खी की आबादी की गिरावट के लिए भुगतान किया गया है संयुक्त राज्य अमेरिका में1 और 10-यूरोप में 15%2,3। उच्च गुणवत्ता चारा के लिए कम उपयोग सहित कई कारकों, की संभावना एक साथ कार्य करने के लिए नकारात्मक प्रभाव शहद मधुमक्खी स्वास्थ्य । Monoculture, सूखा, टिकाऊ मधुमक्खी पालन प्रथाओं, और अंय कारकों विविधता और प्राकृतिक बृहदांत्र4,5के लिए उपलब्ध पराग की राशि में कमी । क्योंकि शहद मधुमक्खियों ने पराग से उनके आहार प्रोटीन और लिपिड के लगभग सभी प्राप्त, पराग के लिए उपयोग कम गंभीर रूप से व्यक्तिगत और कॉलोनी स्वास्थ्य सीमा कर सकते हैं ।
hypopharyngeal ग्रंथियों आंखों और मस्तिष्क6के बीच मधुमक्खी के सिर में स्थित स्रावी संरचनाओं रहे हैं । सामान्य परिस्थितियों में, विकासात्मक और कार्यात्मक पथ ग्रंथियों के दर्पण कि मधुमक्खी वे अंदर स्थित हैं उंर के लगभग 5-10 दिनों में, मधुमक्खी छत्ते में नर्सिंग व्यवहार करता है । इस एक ही समय में, hypopharyngeal ग्रंथियों अपने चोटी के आकार और स्रावी क्षमता तक पहुंचने, चिंता खाना या जेली के प्रमुख प्रोटीन अंश उत्पादन लार्वा और रानी के रूप में अन्य वयस्कों, विकसित करने के लिए खिलाया । इस चोटी के आकार में ग्रंथियों अंगूर का एक गुच्छा के समान है जहां प्रत्येक अंगूर एक असतत पालि acinus (बहुवचन: acini) के रूप में जाना जाता संरचना है । कार्यकर्ता मधुमक्खी उम्र के रूप में और छत्ते में विभिन्न कार्यों पर ले जाता है, hypopharyngeal ग्रंथियों हटना और अमृत7,8में नीचे शर्करा को तोड़ने की तरह, विभिन्न कार्यों पर लेते हैं । hypopharyngeal ग्रंथियों इसलिए मधुमक्खी की उंर और उनकी उंर से जुड़े कार्य के साथ संबंधित हैं ।
नर्स hypopharyngeal ग्रंथि का आकार उनके आहार9,10,11में मात्रा और प्रोटीन की गुणवत्ता के प्रति संवेदनशील है । जब नर्स मधुमक्खियों को अच्छी तरह से पाला जाता है, उनकी ग्रंथियों बड़े होते हैं । जबकि, ग्रंथियों छोटे है जब मधुमक्खी पराग से वंचित है, विशेष रूप से वयस्क विकास के पहले सप्ताह में । आदेश में एक नर्स मधुमक्खी के पोषण की स्थिति का निर्धारण करने के लिए, शोधकर्ताओं ने आम तौर पर hypopharyngeal ग्रंथियों को मापने, सीधे ग्रंथि acinus आकार को मापने के द्वारा या तो11,12,13,14 या प्रोटीन सामग्री15,16 या पूरे सिर जहां वे स्थित है के प्रोटीन सामग्री11 या ताजा वजन17 को मापने के द्वारा । प्रत्येक विधि अपने स्वयं के पेशेवरों और बुरा है । हम ग्रंथि acini को मापने से प्राप्त संकल्प पसंद करते हैं, हालांकि इस विधि दो प्रमुख तरीकों से चुनौतीपूर्ण हो सकता है । पहली चुनौती ग्रंथि को ठीक से पहचानने और काटना करने की है । दूसरा प्रत्येक acinus का एक सटीक उपाय प्राप्त कर रहा है. एक विच्छेदन प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, ग्रंथियों स्पष्ट या दूधिया सफेद दिखाई देते हैं और acini की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । उपकरण होने बेहतर acini के किनारे को परिभाषित करने के लिए, और सही ग्रंथि माप प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए शहद मधुमक्खी पोषण का अध्ययन किसी के लिए फायदेमंद है ।
यहां, हम रुचि शोधकर्ताओं दिखाने के लिए कैसे काटना, दाग, छवि, और उपाय hypopharyngeal ग्रंथियों ताकि acinus आकार का सही माप प्राप्त किया जा सकता है । विधि हम वर्णन प्रदान करता है शोधकर्ताओं ने एक आसान, सटीक, और replicable विधि समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि में कई ग्रंथि माप प्राप्त करने के लिए एक बार प्रयोगकर्ता पर्याप्त अभ्यास किया है । एक आत्मविश्वास से सिर्फ एक घंटे में लगभग 10 व्यक्तियों की ग्रंथियों को मापने सकता है । हम दोनों विधि और इन माप प्राप्त करने के लिए आवश्यक सामग्री पर विवरण प्रदान करते हैं । नीचे उल्लिखित तरीकों में से सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं उचित विच्छेदन और ग्रंथियों के दाग हैं । हालांकि हम बढ़ाया छवियों पर कब्जा और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ acini उपाय, हम वर्तमान तरीकों को आसानी से अंय प्लेटफार्मों18के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Protocol
1. नर्स श्रमिकों से Hypopharyngeal ग्रंथियों को विच्छेदन और धुंधला करना
- एक छोटे (६० मिमी x 15 मिमी) या बड़े (१०० मिमी x 15 मिमी) ग्लास पेट्री डिश में शांत सेटिंग मोम पिघलने से एक मोम विच्छेदन प्लेट बनाओ । विच्छेदन के लिए थाली का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से मोम शांत ।
- प्रत्येक मधुमक्खी के लिए संसाधित किया जा करने के लिए, एक 1:20 काम Giemsa समाधान के 20 µ एल तैयार (1:20 वी/तैयार Giemsa के दाग फॉस्फेट में बफर खारा (पंजाब: १३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी ना2HPO4, १.८ मिमी KH2पीओ4)).
सावधानी: Giemsa दाग मेथनॉल होता है और ज्वलनशील होता है. यह विषाक्त अगर निगल लिया, सांस, या यदि यह त्वचा के साथ संपर्क में आता है । इसका निपटारा स्थानीय संस्था की आवश्यकताओं के अनुसार करना चाहिए ।
नोट: Giemsa दाग जल्दी से नीचा एक बार यह पतला है क्योंकि हमेशा नमूनों की वर्तमान बैच के लिए सिर्फ एक ताजा काम समाधान करते हैं । पतला दाग त्यागें अगर एक हाला विकसित करता है । - प्लास्टिक 20 µ एल Giemsa माइक्रोस्कोप स्लाइड के कुओं में दाग और 50 – 100 µ एल खारा के लिए अच्छी तरह से सटे पर.
- एक मधुमक्खी से सिर अलग, 10 मिमी माइक्रो वसंत कैंची का उपयोग कर, और सिर सामने की ओर मोम विच्छेदन थाली में संदंश और एक मोम-नक्काशी कलम का उपयोग कर एंबेड । आंखों में पिन डालने और मुंह में एक के द्वारा अतिरिक्त स्थिरता के लिए मोम की थाली में सिर नीचे पिन ।
- एक तेज टूटना उस्तरा एक पिन वाइज में तय ब्लेड का प्रयोग, एक छोटे से (~ 2-3 मिमी) चेहरे की थाली के प्रत्येक पक्ष पर आंखों और mandibles के बीच चीरा बनाते हैं । धीरे से चेहरे की थाली के तहत माइक्रो कैंची चलाने के लिए और antennal तंत्रिका कि एंटीना और मस्तिष्क के बीच चलाता है कटौती ।
- ठीक संदंश का प्रयोग, मुंह से चेहरे की थाली हड़पने के लिए, यह फ्लिप अप, और यह ठीक बिंदु संदंश और एक पिन के साथ मोम की थाली को पिन । अगर जरूरत पड़े तो फेस प्लेट पूरी तरह से निकाल लें ।
- प्लास्टिक 20 µ एल पंजाबियों सिर के कट खुला अनुभाग पर ।
नोट: ग्रंथियों इस बिंदु पर नाव या एक उनके लिए खोज करना चाहिए हो सकता है । ग्रंथियों मोती की एक स्ट्रिंग की तरह दिखते हैं और अगर बरकरार मस्तिष्क के शीर्ष पर स्थित हैं । - सुपर ठीक बात संदंश का प्रयोग करें धीरे hypopharyngeal ग्रंथियों में से एक को दूर करने के लिए (ग्रंथि टूट सकता है, यह क्षेत्रों में हटाया जा करने की आवश्यकता), और तुरंत Giemsa के लिए ग्रंथि को माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर दाग हस्तांतरण ।
- ग्रंथि 5 मिनट के लिए Giemsa समाधान में मशीन की अनुमति दें, और फिर एक ही स्लाइड पर खारा के पूल में ग्रंथि हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, तो सूक्ष्म कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में ग्रंथि काट ।
नोट: इस इस प्रकार यह आसान ग्रंथि acini की स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए बना रही है, एक चापलूसी विमान में झूठ ग्रंथियों बनाने में मदद करता है.
2. hypopharyngeal ग्रंथि Acini को मापने
- माइक्रोस्कोप को चालू करें और मापन कार्यक्रम खोलें. माइक्रोस्कोप के लिए प्रकाश स्रोत पर बारी अगर यह पहले से ही नहीं है । 10x के लिए माइक्रोस्कोप आवर्धन सेट करें ।
- ग्रंथियों का पता लगाएं और ऐपिस में बढ़ाया छवि ध्यान केंद्रित, कंप्यूटर के बिना । 60-80X तक आवर्धन बढ़ाएँ और ऐपिस में छवि को फ़ोकस करें.
- 'मोल' टैब के तहत, कंप्यूटर पर लाइव छवि पर ग्रंथियों को समायोजित और ध्यान केंद्रित ।
- प्रकार छवि नाम/नमूना विवरण ' छवि नाम ' बॉक्स में और आगे की माप के लिए ग्रंथियों की एक छवि लेने के लिए ' प्राप्त छवि ' पर क्लिक करें.
- ' विश्लेषण ' टैब का चयन करें. ' क्षेत्र उपकरण ' का चयन करें ( पूरक चित्र 1aमें हाइलाइट किया गया) और 'प्रदर्शन लेबल' के अंतर्गत अचयनित 'मान', जो भी अचयनित 'इकाई' होगा. डिफ़ॉल्ट करने के लिए अन्य सभी सेटिंग्स सेट करें (पूरक चित्र 1a).
नोट: इस सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से आवर्धन के स्तर के अनुसार क्षेत्र माप जांचता है ताकि एक कम आवर्धन से प्राप्त क्षेत्र के रूप में एक ही है कि एक उच्च आवर्धन से प्राप्त की है । - प्रत्येक acinus लगातार क्लिक करके या लगातार बाईं माउस बटन दबाए रखते हुए acinus परिधि के रूप में संभव के रूप में ध्यान से अनुरेखण द्वारा उपाय । मधुमक्खी के प्रति कम से 10 acini उपाय ।
नोट: अधिक प्रयोग के आधार पर की जरूरत हो सकती है ( चर्चादेखें) । यह कई छवियों/ग्रंथि के वर्गों के लिए पर्याप्त स्पष्ट, माप के लिए ठीक से उंमुख acini मिल की आवश्यकता हो सकती है । - एक बार एक ही छवि से acini के सभी मापा गया है, 'रिपोर्ट बनाएं' का चयन करें । सुनिश्चित करें कि विकल्प के रूप में पूरक आंकड़ा 1b में दिखाया गया है और 'निर्यात' क्लिक चयन कर रहे हैं ।
- रिपोर्ट को इच्छित के रूप में सहेजें । यदि नमूने के सेट के लिए कोई फ़ाइल पहले ही बनाई जा चुकी है और अतिरिक्त माप जोड़ी जा रही है, तो सुनिश्चित करें कि रिपोर्ट फ़ाइल खुली नहीं है ताकि नए डेटा को मौजूदा फ़ाइल में जोड़ा जाए ।
- समाप्त होने पर, माइक्रोस्कोप कैमरा और प्रकाश स्रोत बंद कर दें । तरल और माइक्रोस्कोपी स्लाइड बंद ग्रंथियों पोंछ और सुरक्षित रूप से किसी भी इस्तेमाल सामग्री के निपटान । आसुत जल के साथ स्लाइड कुल्ला और पुनः प्रयोग के लिए इथेनॉल (७०% v/वी पानी में) के साथ साफ पोंछ ।
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Representative Results
Hypopharyngeal ग्रंथियों नर्स श्रमिकों से विच्छेदित और के साथ और 60 पर दाग के बिना visualized थे-80X आवर्धन (चित्रा 1) । दाग ऊतक में, यह उचित विपरीत खोजने के लिए पूरी तरह से ध्यान केंद्रित करने और acini के किनारों को परिभाषित करने के लिए मुश्किल है । सना हुआ ऊतक में, acini के किनारों के कारण दाग ऊतक और सफेद पृष्ठभूमि के बीच सुधार के विपरीत तेज कर रहे हैं ।
चित्र 1: सना हुआ (A, B) या सना हुआ (C, D) नर्स से आयु वर्ग के कार्यकर्ताओं से hypopharyngeal ग्रंथियों । ध्यान दें कि जब ग्रंथियों दोनों ही मामलों में दिखाई दे रहे हैं, दाग ग्रंथियों और अधिक अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे है और इसलिए आसान उपाय । यह भी ध्यान दें कि कुछ अलग फोकल विमानों में पूरे ग्रंथि के परिणाम के कर्ली और कुंडल आकृति विज्ञान । ग्रंथि को उत्पन्न होने से रोकने के लिए खोदी जा सकती है. स्केल बार्स = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
हनी मधुमक्खी श्रमिकों ≤ 18 एच में उभरने के बाद एकत्र हुए थे और दो अलग आहार शासन को सौंपा: वसंत पराग के एक आहार Tucson, एरिजोना, संयुक्त राज्य अमेरिका में स्वाभाविक रूप से मौजूद थे शहद या कोई पराग के साथ सिर्फ शहद के साथ मिलाया । आदेश में इन आहार के लिए मधुमक्खियों को प्रतिबंधित करने के लिए, जबकि छत्ते में पुश-तार पिंजरों में इस्तेमाल किया गया के रूप में पहले अध्ययन13,14 में वर्णित-वर्ग सेंटीमीटर प्रति लगभग एक मधुमक्खी के घनत्व पर मधुमक्खियों को परिष्कृत । प्रत्येक आहार उपचार तीन पित्ती (N = 3) में दोहराया गया था । या तो आहार शासन को उजागर मधुमक्खियों 5 डी और उनके hypopharyngeal ग्रंथियों के विश्लेषण के लिए उंर के 8 डी में एकत्र किए गए । विच्छेदन का उपयोग करना, धुंधला, और मापने के तरीकों ऊपर उल्लिखित, इन मधुमक्खियों के hypopharyngeal ग्रंथि acini मापा और तुलना (चित्रा 2) थे । प्रत्येक तीन पित्ती में तीन मधुमक्खियों प्रत्येक आयु एक्स आहार उपचार संयोजन के लिए मापा गया । प्रत्येक मधुमक्खी के लिए दस acini मापी गई । acini माप मधुमक्खी के प्रति औसतन acinus आकार प्राप्त करने के लिए प्रत्येक मधुमक्खी के लिए औसत थे. ये मान तब उस हाइव के लिए आयु x उपचार संयोजन के लिए कोई मान प्राप्त करने के लिए औसत थे । acinus मापन पर ANOVA विश्लेषण से पता चला कि आहार (एफ 1, 8= २.६५, पी = ०.००१), आयु (एफ1, 8 = १०.०३, पी = ०.०१३), और आहार के बीच बातचीत x age (f1, 8= ०.०२, पी = ०.०२०) महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा । हमने देखा है कि hypopharyngeal ग्रंथियों मधुमक्खियों कि खिलाया पराग, के रूप में एक Tukey एचएसडी द्वारा निर्धारित किया गया में समय के साथ बढ़ी । इस पैटर्न पहले9,11,19का प्रदर्शन किया गया है । ग्रंथि acini के आकार 5 डी और 8 दिन पुराने मधुमक्खियों के बीच अलग नहीं किया जब मधुमक्खियों पराग से वंचित थे ।
चित्रा 2: अच्छी तरह से खिलाया नर्सों और पराग के वंचित लोगों के Hypopharyngeal ग्रंथि आकार । श्रमिकों पराग और शहद (ग्रे सलाखों) के एक आहार या अकेले शहद का आहार (सफेद सलाखों) 5 या 8 डी के लिए खिलाया गया । इस समय के दौरान, मधुमक्खियों छत्ते के अंदर थे और शहद या शहद और पराग पर बंदी । ऊपर बताए अनुसार उनकी hypopharyngeal ग्रंथि acini मापी गई । त्रुटि पट्टियों का अर्थ acinus आकार के लिए मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व तीन कालोनियों में (N = 3) का परीक्षण किया । तीन मधुमक्खियों प्रत्येक उपचार आयु एक्स आहार उपचार संयोजन के लिए प्रत्येक कॉलोनी से मापा गया । तारांकन चिह्न से कनेक्टेड पट्टियां एक Tukey के एचएसडी (α = ०.०५) के अनुसार एक दूसरे से काफी भिंन होती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
मधुमक्खियों को भी छत्ते और फेड परिभाषित आहार से अलग पिंजरों में बनाए रखा जा सकता है । हनी मधुमक्खी श्रमिकों ≤ 18 एच में उभरने के बाद एकत्र किए गए थे और एक्रिलिक ग्लास पिंजरों (पिंजरे प्रति १०० मधुमक्खियों) चार आहार व्यवस्थाओं में से एक के साथ सौंपा: एक आहार नहीं पराग या एक आहार तीन मधुमक्खी के एक युक्त-पराग एकत्र कर रहे थे: "बादाम" एक बादाम से पराग बाग monoculture, "रेगिस्तान" Sonoran रेगिस्तान पौधों, या दक्षिण संयुक्त राज्य अमेरिका में स्थित कालोनियों से "एसई" पराग का मिश्रण युक्त रेगिस्तान से पराग, के रूप में Corby में वर्णित-हैरिस एट अल । 12. सुक्रोज (५०% w/v), जल, और पराग (जहां उपयुक्त हो) को ad libitumप्रदान किया गया । पांच पिंजरों चार आहार उपचार के प्रत्येक के लिए निर्माण किया गया, 20 पिंजरों की कुल में जिसके परिणामस्वरूप । उंर के 8 डी में, दस मधुमक्खियों के hypopharyngeal ग्रंथियों एकत्र और मापा गया । प्रत्येक व्यक्ति के लिए दस acini मापी गई । औसत acinus आकार प्रत्येक मधुमक्खी के लिए गणना की गई थी और इन मूल्यों प्रत्येक पिंजरे के लिए एक औसत acinus आकार प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हमने देखा है कि hypopharyngeal ग्रंथि का आकार दोनों आहार में पराग की उपस्थिति (पराग बनाम कोई पराग: टी1 = ५.६४, पी < 0.0001) और पराग के प्रकार प्रदान की संवेदनशील है (बादाम बनाम डेजर्ट बनाम एसई पराग: एफ२,१४८ = ८.०६, पी = ०.०००५; चित्रा 3) । मधुमक्खियों खिलाया रेगिस्तान या बादाम पराग बराबर ग्रंथि आकार था । मधुमक्खियों खिलाया एसई पराग ग्रंथियों कि मधुमक्खियों खिलाया बादाम या रेगिस्तान पराग से छोटे थे ।
चित्रा 3: नर्स आयु वर्ग के श्रमिकों के Hypopharyngeal ग्रंथि आकार पराग के तीन विभिंन प्रकार या पराग से वंचित खिलाया । नर्स मधुमक्खियों पिंजरों में उभरने के बाद रखा गया था और एक आहार खिलाया सुक्रोज अकेले (कोई पराग) या सुक्रोज और तीन पराग (बादाम, रेगिस्तान, या एसई पराग में से एक से मिलकर) जब तक 8 उंर के डी । त्रुटि पट्टियों पांच पिंजरों (N = 5) से नमूना मधुमक्खियों में मतलब acinus आकार के लिए मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । दस मधुमक्खियों का नमूना लिया और पिंजरे के लिए एक औसत acinus आकार प्राप्त करने के लिए और पिंजरों के बीच भिन्नता की गणना करने के लिए प्रत्येक पिंजरे में मापा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
अनुपूरक फ़ाइल 1: माप सॉफ्टवेयर के स्क्रीन शॉट्स जबकि ग्रंथि acini (क) को मापने और रिपोर्ट (ख) बनाने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
Hypopharyngeal ग्रंथि का आकार आहार में प्रोटीन और पराग की मात्रा के प्रति संवेदनशील है और युवा वयस्क मधुमक्खियों में पौष्टिकता का एक महत्वपूर्ण मार्कर है । यहां, हम काटना और इस ऊतक को मापने के लिए एक सस्ती और reproducible तरह का प्रदर्शन । इन ऊतकों काटना मुश्किल हो सकता है, लेकिन अभ्यास के साथ, एक अपेक्षाकृत बरकरार ऊतक के साथ तेजी से क्लीनर विच्छेदन प्राप्त कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत विधि का मुख्य लाभ यह है कि ऊतक दाग है, जो शोधकर्ता को स्पष्ट रूप से प्रत्येक ग्रंथि acinus की सीमाओं की कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है । एक दाग के बिना, इन acini की सीमाओं कल्पना और माइक्रोस्कोप जो एक सटीक acinus माप प्राप्त करने के लिए शोधकर्ता की क्षमता को कम के तहत ध्यान केंद्रित करने के लिए मुश्किल हैं । दाग की आसानी और acini के लिए एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने के बावजूद, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं क्रम में सटीक माप प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए; ये नीचे चर्चा कर रहे हैं ।
बड़ी ग्रंथियों अच्छी तरह से खिलाया नर्स मधुमक्खियों कि लगभग रहे है 7-9साल की उंर के 10 दिन,20। यह हमेशा आसान है, खासकर जब इन ऊतकों काटना सीखने के लिए, पहले छोटे ग्रंथियों पर जाने से पहले बड़े ग्रंथियों विदारक अभ्यास के रूप में वे छोटे, नाजुक हो सकता है, और काटना के लिए मुश्किल है । ताजा ऊतक भी सबसे अच्छा विच्छेदों पैदावार । अगर एक समय की अवधि के लिए विच्छेदन से पहले मधुमक्खी फ्रीज चाहिए, पता है कि अब है कि एक मधुमक्खी जमे हुए है, और अधिक नाजुक ऊतक हो जाता है । यह विच्छेदन समस्याग्रस्त कर सकते हैं । अभ्यास और तेज संदंश के साथ, शोधकर्ता अंततः इन मुद्दों पर काबू पा लेंगे । हम जमे हुए और ताजा ऊतक के बीच धुंधला में एक अंतर पर ध्यान नहीं दिया है ।
ताजा दाग ग्रंथियों के उचित दाग प्राप्त करने के क्रम में आवश्यक है । पुराने दाग का झुरमुट कर सकते हैं, दाग को ठीक से ऊतकों रिस में असमर्थ जा । यह महत्वपूर्ण है कि ताजा दाग छोटे बैचों में तैयार हो, लगभग हर घंटे । यह ऊतक और खुर्दबीन, जो परिभाषित acinus किनारों के साथ तेज छवियों की ओर जाता है के तहत पृष्ठभूमि के बीच उचित विपरीत सुनिश्चित करेगा । अगर दाग ऊतक ठीक से रिस नहीं करता है यह भी दाग कमजोर पड़ने की एक सीमा के साथ काम करने के लिए उपयोगी है । हमने पाया है कि एक 1:20 ताजा काम दाग के शेयर सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन अंय कमजोर पड़ने भी काम कर सकते है अगर एक इच्छाओं एक गहरा या हल्का दाग ।
हमने acini डेटा को मापने और रिकॉर्ड करने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर से जुड़े कैमरे का इस्तेमाल किया । कैमरा और सॉफ्टवेयर कुछ महंगा है और इसलिए सभी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है । हालांकि यह एक के लिए छवि को प्राप्त करने के लिए और माप acini वहां कई कम लागत विकल्प हैं, मुफ्त सॉफ्टवेयर18सहित, कि इस्तेमाल किया जा सकता है विदारक माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे के लिए आवश्यक है ।
यहां, हम धुंधला और hypopharyngeal ग्रंथि acini को मापने के लिए बुनियादी कदम दिखाने के लिए, लेकिन तनाव है कि यह शोधकर्ता को तय करने के लिए कितने acini को मापने के लिए, कि क्या एक या दोनों ग्रंथियों पर acini उपाय करने के लिए, और क्या प्रत्येक ग्रंथि के कई क्षेत्रों को मापने के लिए । उदाहरण के लिए, प्रयोगात्मक उपचार के बीच और अधिक सूक्ष्म मतभेदों का पता लगाने के लिए, एक ग्रंथि के प्रति 10 से अधिक acini और उपचार प्रति 10 से अधिक मधुमक्खियों को मापने की आवश्यकता हो सकती है । हम किसी भी acini आकार अंतर ग्रंथि पर अपने स्थानों पर आधारित पर ध्यान नहीं दिया है । हम भी acini के आकार में कोई अंतर है कि बाईं या सही ग्रंथियों पर स्थित है पर ध्यान नहीं दिया है । यदि शोधकर्ता किसी भी आकार मतभेद संदिग्ध, hypopharyngeal ग्रंथि के कई क्षेत्रों और शायद दोनों ग्रंथियों मापा जाना चाहिए ।
शोधकर्ताओं को सफलतापूर्वक hypopharyngeal ग्रंथि आकार की सटीक माप प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग विदारक और धुंधला ग्रंथि ऊतक और मापने acini के लिए । अभ्यास के साथ, इन माप के बजाय जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है, शोधकर्ता एक में कई नमूनों की प्रक्रिया के लिए बैठे । हम उंमीद करते है कि अधिक शोधकर्ताओं ने यहां उल्लिखित तरीकों को रोजगार के रूप में वे आगे कारकों है कि प्रभाव hypopharyngeal ग्रंथि आकार समझ चाहते हैं, और कैसे इन ग्रंथियों कालोनी स्वास्थ्य और व्यक्तिगत व्यवहार से संबंधित हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम USDA-ARS (परियोजना संख्या: 2022-21000-017-00-डी) से आंतरिक कोष द्वारा समर्थित किया गया था । ARS/USDA एक समान अवसर नियोक्ता और प्रदाता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
