Summary
Hypopharyngeal kjertel acinus størrelse er en robust mål sykepleier honey bee ernæring. Her gir vi en detaljert protokoll for dissekere, flekker, imaging og måle sykepleier bee hypopharyngeal kjertel acini.
Abstract
Sykepleier hypopharyngeal kjertlene produserer protein fraksjon av arbeidstaker og royal jelly som er lei å utvikle larver og queens. Disse par kjertler som ligger i hodet av bee er svært følsomme for antallet og kvaliteten på pollen og pollen erstatter at sykepleier bee forbruker. Kjertler får mindre når sykepleiere fôres mangelfull dietter og er stor når de er matet komplett dietter. Sykepleier hypopharyngeal kjertel størrelse er en robust indikator på sykepleier ernæring, er det viktig at de som studerer honey bee ernæring vet hvordan måle disse kjertlene. Her gir vi detaljert metoder for dissekere, flekker, imaging og måle sykepleier bee hypopharyngeal kjertler. Vi presenterer sammenligninger av unstained kvinne og farget vev og data som brukes for å studere virkningen av pollen kjertel størrelsen. Denne metoden har blitt brukt til å teste hvordan kosthold påvirker hypopharyngeal kjertel størrelse, men har ytterligere bruk for forståelsen av disse kjertlene i strukturen helse.
Introduction
Honning bier er avgjørende for jordbruk fordi de pollinering av en rekke avlinger som brukes av mennesker og dyr. Mye oppmerksomhet er betalt til nedgangen av honey bee populasjoner som koloni tap sveve rundt 30-40% hvert år i USA1 og 10-15% i Europa2,3. Flere faktorer, inkludert redusert tilgang til høykvalitets grovfôr, sannsynlig handle sammen for å ha en negativ innvirkning honey bee helse. Monokultur, tørke, bærekraftig birøkt praksis og andre faktorer redusere mangfoldet og mengde naturlig pollen tilgjengelig til koloniene4,5. Fordi honning bier utlede nesten alle kosttilskudd proteiner og lipider fra pollen, kan redusert tilgang til pollen sterkt begrense enkelte og kolonien helse.
Hypopharyngeal kjertler er sekretoriske strukturer i bee's hodet mellom øynene og hjernen6. Under normale omstendigheter, utviklingsmessige og funksjonelle banen av kjertler speil av bee de ligger i. På ca 5-10 dager gammel utfører bee sykepleie atferd i strukturen. Samtidig er dette nå hypopharyngeal kjertler deres største størrelsen og sekretoriske kapasitet, produsere store protein fraksjon av Foreldreomsorg og yngelens mat eller gelé matet å utvikle larver og andre voksne som dronningen. På denne toppen størrelsen kjertler ligne en gjeng druer der hver av disse er en diskret lobe struktur kalt acinus (flertall: acini). Arbeidstaker bee aldre og tar på ulike oppgaver i strukturen, hypopharyngeal kjertel krympe og ta på ulike funksjoner, som å bryte ned sukker i nektar7,8. Hypopharyngeal kjertler er derfor korrelert med bee og deres alder-assosiert oppgave.
Sykepleier hypopharyngeal er kjertel følsomme for kvantitet og kvalitet protein i deres kosthold9,10,11. Når sykepleier bier er godt næret, er deres kjertler store. Mens kjortelen er liten når bee fratatt av pollen, spesielt i den første uken av voksen utvikling. For å finne ernæringsmessig status for en sykepleier bee, forskere vanligvis måle hypopharyngeal kjertler, enten ved måling direkte kjertel acinus størrelse11,12,13,14 eller protein innhold15,16 eller ved å måle protein innhold11 vekt frisk17 av hele hodet hvor de befinner seg. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper. Vi foretrekker oppløsningen innhentet fra måle kjertel acini, men denne metoden kan være utfordrende på to viktige måter. Den første utfordringen er å korrekt identifisere og dissekere kjertel. Andre er å få et nøyaktig mål på hver acinus. Under dissecting lys mikroskop, kjertler vises klart eller melkeaktig hvitt og grenser til acini kan være vanskelig å definere. Har verktøy for bedre å definere kanten av acini og øke sannsynligheten for å oppnå nøyaktig kjertel målinger er gunstig for enhver som studerer honey bee ernæring.
Her viser vi interessert forskere å dissekere, flekker, bilde, og måle hypopharyngeal kjertler slik at presise målinger av acinus størrelse kan oppnås. Metoden beskriver vi tilbyr forskere en enkel, nøyaktig og repliserbar metode for å oppnå flere kjertel målinger i en relativt kort tidsperiode når eksperimentator tilstrekkelig praktiseres. Man kan trygt måle kjertler nesten 10 personer i litt over en time. Vi tilbyr informasjon om både metoden og materialer som er nødvendig for å oppnå disse målene. De viktigste aspektene av metodene beskrevet nedenfor er riktig dissection og flekker av kjertler. Selv om vi fange opp bilder forstørret og måle acini med kommersiell programvare, kan metodene presenterer vi lett tilpasses18andre plattformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dissekere og flekker Hypopharyngeal kjertler fra sykepleier arbeidere
- Gjøre en voks disseksjon plate ved smelting kule innstillingen voks i en liten (60 x 15 mm) eller stor (100 x 15 mm) glass Petriskål. Avkjøle voksen helt før du bruker platen for disseksjoner.
- For hver bee behandles, forberede 20 µL av en 1:20 arbeider Giemsa løsning (1:20 v/v forberedt Giemsa flekk i fosfat-bufret saltvann (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4)).
FORSIKTIG: Giemsa flekken inneholder metanol og er brannfarlig. Det er giftig svelging innånding, eller hvis den kommer i kontakt med huden. Det bør avhendes i henhold til lokale institusjonen.
Merk: Alltid gjør en frisk fungerende løsning for gjeldende bunke av prøvene fordi Giemsa flekken raskt forringer når det er utvannet. Kast fortynnede flekken hvis en utløse utvikler. - Pipetter 20 µL Giemsa flekk i brønnene på objektglass og 50-100 µL saltvann på lysbildet ved brønnen.
- Løsne hodet fra en bie, ved hjelp av 10 mm mikro-våren saks, og bygge inn hodet forsiden opp i voks disseksjon platen ved hjelp av tang og voks utskjæring penn. Feste hodet inn i voks plate for ekstra stabilitet ved innsetting pinner i øynene og en i munnen.
- Bruke en skarp knuselig barberblad fast inn en pin vise, lage en liten (~ 2-3 mm) snitt mellom øynene og Accolade på hver side av ansiktet plate. Forsiktig kjøre mikro saksen under ansiktet platen og skjær antennal nerve som går mellom antenner og hjernen.
- Bruke fine tang, ta ansikt platen av munnen, snu den opp og feste det til voks plate med fin spiss tang og en PIN-kode. Eventuelt fjerne ansikt platen helt.
- Pipetter 20 µL PBS på kuttet åpne delen av hodet.
Merk: Kjertlene kan flyte opp på dette punktet, eller man må søke etter dem. Kjertler ligne en rekke perler og ligger på toppen av hjernen hvis intakt. - Bruk super fin spiss tang forsiktig fjerne en av hypopharyngeal kjertler (kjertel kan bryte, krever det fjernes i segmenter), og øyeblikkelig overføre kjertel til Giemsa flekken på mikroskopi lysbildet.
- Tillate at til å ruge i den Giemsa løsningen for 5 min, og deretter bruke tang overføre kjertel til bassenget saltoppløsning i samme lysbilde. Om nødvendig kan du klippe kjertel i mindre biter med mikro saksen.
Merk: Dette bidrar til å gjøre kjertler ligger i et flatere fly, dermed gjør det enklere å få klare bilder av kjertel-acini.
2. måle hypopharyngeal til Acini
- Slå på mikroskopet og åpne programmet måling. Slå på lyskilden til mikroskopet hvis det ikke allerede er på. Satt mikroskop forstørrelse til 10 X.
- Finn kjertler og fokusere det forstørrede bildet i okular, uten at datamaskinen. Øke forstørrelsen til 60 – 80 X og fokus bildet i okularet.
- Under kategorien "Hent" justere og fokus kjertler på live bildet på datamaskinen.
- Skriv navnet/sample bildebeskrivelse i ' Image' boksen og klikk 'Skaffe bilde' å ta et bilde av kjertler for videre målinger.
- Velg kategorien "Analysen" Velg av 'området tool (uthevet i supplerende figur 1A) og uegennyttig "verdien" under "Visningsetikettene", som vil også uegennyttig "enhet". Angi alle andre innstillinger til standard (ekstra figur 1A).
Merk: Programvaren automatisk kalibrerer området målinger i henhold til forstørrelsesnivået slik at området fra forstørring er den samme som fra en høyere forstørrelse. - Måle hver acinus ved kontinuerlig å klikke eller kontinuerlig holde nede venstre museknapp mens sporing acinus omkretsen like forsiktig som mulig. Måle minst 10 acini per bee.
Merk: Mer kan være nødvendig avhengig av eksperimentet (se diskusjon). Det kan kreve flere bilder/deler av kjertel å finne nok klare, riktig orientert acini for måling. - Når alle acini fra et enkelt bilde har blitt målt, velg "Opprett rapport". Kontroller at alternativene er valgt som vist i supplerende figur 1B og klikk "Export".
- Lagre rapporten som ønsket. Hvis en fil er allerede opprettet for settet av prøver og flere målinger legges, sikre at rapporten ikke åpne slik at nye data legges til i den eksisterende filen.
- Når ferdig, slå av mikroskopet kameraet og lyskilde. Tørk av væske og kjertler av mikroskopi lysbildene og trygt avhende brukte materiale. Skyll lysbildene med destillert vann, og gni den ren med etanol (70% v/v i vann) for gjenbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypopharyngeal kjertler dissekert fra sykepleier arbeidere og visualisert med og uten flekk på 60 – 80 X forstørrelse (figur 1). I unstained kvinne vev er det vanskelig å finne riktig kontrast til fullt fokus og definerer acini. Farget vev er kantene på acini kraftig forbedret kontrasten mellom farget vev og den hvite bakgrunnen.
Figur 1: unstained kvinne (A, B) eller beiset (C, D) hypopharyngeal kjertler fra sykepleier-alderen arbeidere. Merk at mens kjertler er synlig i begge tilfeller, farget kjertler er mer godt definert og derfor enklere å måle. Note det noe krøllet og kveilet morfologi av hele kjertel resulterer også i forskjellige fokal fly. Kjertel kan deles for å hindre dette. Skalere barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Honey bee arbeidere ble samlet på ≤18 h etter fremveksten og ble tilordnet to forskjellige kosttilskudd regimer: en diett av våren pollen naturlig tilstede i Tucson, Arizona, USA blandet med honning eller bare honning med ingen pollen. For å begrense bier til disse diettene i strukturen, push-i ledning burene ble brukt, som beskrevet i tidligere studier13,14 -trange bier på en tetthet av ca en bee per kvadratcentimeter. Hver kosttilskudd behandling ble gjentatt i tre strukturer (N = 3). Bier utsatt for enten diett regime ble samlet på 5 d og 8 d alder for analyse av deres hypopharyngeal kjertler. Bruke dissection, flekker og måle metoder skissert ovenfor, hypopharyngeal kjertel acini av disse biene ble målt og sammenlignet (figur 2). I hver av de tre elveblest, ble tre bier målt for hver alder x kosthold behandling kombinasjon. Ti acini ble målt for hver bee. Acini mål var gjennomsnitt for hver bee å få en gjennomsnittlig acinus størrelse per bee. Disse verdiene ble deretter gjennomsnitt for å få en verdi for alderen x behandling kombinasjon for at strukturen. ANOVA analyse av acinus målene viste at kosthold (F1,8= 2.65, p = 0,001), alder (F1,8 = 10.03, p = 0.013), og samspillet mellom kosthold x alder (F1,8= 0,02, p = 0.020) hadde betydelige effekter. Vi observerte at hypopharyngeal kjertler vokste over tid i bier som ble matet pollen, som bestemmes av en Tukey "HSD". Dette mønsteret har vært vist tidligere9,11,19. Størrelsen på de kjertel acini skiller ikke mellom 5 d og 8 dager gamle bier når bier ble fratatt pollen.
Figur 2: Hypopharyngeal kjertel størrelser velfødde sykepleiere og de fratatt pollen. Arbeiderne ble matet en diett av pollen og honning (grå barer) eller en diett med honning alene (hvite søyler) for 5 eller 8 d. Samtidig bier var i strukturen og bur over honning eller honning og pollen. Deres hypopharyngeal kjertel acini ble målt som beskrevet ovenfor. Feilfelt representerer standardfeil for mener acinus størrelsen over tre koloniene (N = 3) testet. Tre bier ble målt fra hver kolonien for hver behandling alder x kosthold behandling kombinasjon. Barer forbundet med en stjerne er signifikant forskjellig fra hverandre etter en Tukey's "HSD" (α = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bier kan også opprettholdes i bur atskilt fra strukturen og matet definerte dietter. Honey bee arbeidere ble samlet på ≤ 18t etter fremveksten og ble tilordnet akryl glass bur (100 bier per bur) med en av fire kosttilskudd regimer: en diett som inneholder ingen pollen eller en diett som inneholder ett av tre samlet bee pollen: "mandel" pollen fra en mandel Orchard monokultur, "øde" pollen fra the Sonora-ørkenen som inneholder en blanding av ørkenen planter eller "SE" pollen fra koloniene ligger i det sørøstlige USA, som beskrevet i Corby-Harris et al. 12. sukrose (50% w/v), vann, og pollen (eventuelt) ble gitt annonse libitum. Fem burene ble bygget for hver av de fire kosttilskudd behandlingene, som resulterer i totalt 20 burene. På 8 d alder, ble hypopharyngeal kjertler ti bier samlet inn og målt. Ti acini ble målt for hver enkelt. Gjennomsnittlig acinus størrelsen ble beregnet for hver bee, og disse verdiene ble brukt til å få en gjennomsnittlig acinus størrelse for hver bur. Vi observerte at hypopharyngeal kjertel størrelse er følsom for begge tilstedeværelsen av pollen i kosten (pollen versus ingen pollen: t1 = 5.64, p < 0,0001) og pollen gitt (mandel vs ørkenen vs SE pollen: F2,148 = 8.06, p = 0,0005; Figur 3). Bier matet ørkenen eller mandel pollen hadde tilsvarende kjertel størrelser. Bier matet SE pollen hadde kjertler som var mindre enn bier matet mandel eller ørken pollen.
Figur 3: Hypopharyngeal kjertel størrelser av sykepleier-alderen arbeidere matet tre ulike typer pollen eller fratatt pollen. Sykepleier bier ble plassert i bur etter fremveksten og ble matet en diett bestående av sukrose alene (ingen pollen) eller sukrose og en av tre pollen (mandel, ørkenen eller SE pollen) til 8 d alder. Feilfelt representerer standardfeil for mener acinus størrelsen i bier samplet fra fem bur (N = 5). Ti bier samplet og målt i hver bur skaffer en gjennomsnittlig acinus størrelse for byrået og beregne variasjon blant burene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende fil 1: skjermbilder av måling programvare mens måle kjertel acini (A) og oppretter rapporten (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypopharyngeal kjertel størrelse er følsom for mengden av protein og pollen i kostholdet og er en viktig næring i ung voksen bier. Her viser vi en billig og reproduserbar måte å analysere og måle Dette vevet. Disse vevsprøvene kan være vanskelig å dissekere, men med praksis, kan man få stadig renere disseksjoner med vevet relativt intakt. Den største fordelen med metoden som presenteres her er at vevet er farget, som gjør at hun tydelig visualisere kantlinjene på hver kjertel acinus. Uten en flekk er grensene til disse acini vanskelig å visualisere og fokusere under mikroskop som reduserer forskerens evne til å skaffe en nøyaktig acinus måling. Til tross for enkelt flekker og få et klart bilde for acini, bør flere kritiske punkter vurderes for å få nøyaktige målinger; disse beskrives nedenfor.
Store kjertler kommer fra velfødde sykepleier bier ca 7-10 dager alder9,20. Det er enklere, spesielt når man lærer å dissekere disse vev, første praksis dissekere store kjertler før du går på mindre kjertler som de kan være liten, skjøre og vanskelige å dissekere. Ferskt vev også gir de beste disseksjoner. Hvis en må fryse bee for en periode før dissection, vet at jo lenger at en bie er frosset, jo mer skjøre vev blir. Dette kan gjøre disseksjoner problematisk. Med praksis og skarpe tang, vil forskeren til slutt overvinne disse problemene. Vi har ikke merket en forskjell i flekker mellom frosne og friskt vev.
Frisk flekk er nødvendig for å få riktig farging av kjertler. Eldre flekken kan klumpe seg, forlater flekken ikke riktig gjennomsyre vev. Det er viktig at frisk flekk tilberedes i små grupper, ca. hver time. Dette sikrer riktige kontrasten mellom vev og bakgrunnen under mikroskopet, som fører til skarpe bilder med definerte acinus kanter. Det er også nyttig å arbeide med en rekke flekken fortynninger hvis flekken ikke gjennomsyre vevet riktig. Vi fant at en 1:20 frisk arbeider lager flekken fungerer best, men andre fortynninger virker også hvis man ønsker en mørkere eller lysere flekker.
Vi brukte et kamera festet til dissecting mikroskop og kommersielt tilgjengelig programvare å måle og registrere acini data. Kameraet og programvaren er litt dyrt, og kan derfor ikke være tilgjengelig for alle labs. Selv om det er nødvendig å ha et kamera festet til dissecting mikroskop for å få bildet og måle acini finnes det flere lavere kostnader alternativer, inkludert gratis programvare18, som kan brukes.
Her viser vi grunnleggende fremgangsmåten for flekker og måler hypopharyngeal kjertel acini, men understreker at det til forskeren til å bestemme hvor mange acini mål, om å måle acini på en eller begge kjertler og om du vil måle flere områder av hver kjertel. For eksempel for å oppdage mer subtile forskjeller eksperimentelle behandlinger, kan man trenger å måle mer enn 10 acini per kjertel og mer enn 10 bier per behandling. Vi har ikke merket noen acini størrelse forskjeller basert på deres steder på kjertel. Vi har også ikke merket noen forskjeller i størrelser på acini som er plassert på venstre eller høyre kjertler. Hvis forskeren mistenker størrelse ulikheter, bør flere områder av hypopharyngeal kjertel og kanskje begge kjertler måles.
Forskerne skal kunne oppnår nøyaktige målinger av hypopharyngeal kjertel størrelse ved hjelp av protokollen som er beskrevet her for dissekere flekker kjertel vev og måler acini. Med praksis, kan disse målingene fås ganske raskt, slik at forskeren til å behandle flere eksempler i en sittende. Vi forventer at flere forskere vil bruke metodene som er nevnt her som de søker å videre forstå faktorene som påvirker hypopharyngeal kjertel størrelse, og hvordan disse kjertlene gjelder kolonien helse og individuell atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av interne midler fra USDA-ARS (prosjektnummeret: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA er en lik mulighet arbeidsgiver og leverandør.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
