Summary
ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator 式が容易になります。
Abstract
バイナリ転写システムは、広く可視化して細胞の特定のグループの細胞運命と遺伝子発現やモデル生物の組織を操作するための強力な遺伝的ツールです。これらのシステムは、個別の遺伝子組換え行に 2 つのコンポーネントを含まれています。ドライバーのラインはターゲット遺伝子は転写活性化因子の結合部位に下流に置かれたレポーター/エフェクター ライン港湾組織固有のプロモーター/エンハンサーは、の管理下の転写活性化因子を表しています。両方のコンポーネントをかくまっている動物は、ターゲット遺伝子発現の組織特異を転写活性化を誘導します。対象となる組織の遺伝子発現の正確な時空間は、細胞・遺伝子活動の公平な解釈にとって重要です。したがって、排他的な細胞/組織固有のドライバーの行を生成するための手法の開発が不可欠です。ここで採用することにより高い組織特異的標的発現システムを生成する手法を提案、「定期的にクラスター化 Interspaced 短い回文繰り返し/CRISPR 関連」(CRISPR/Cas)-ゲノム編集技術をベース。このメソッドでは、Cas9 は、2 つのキメラを狙われてエンドヌクレアーゼ (DSB) の二重鎖切断を作成するショウジョウバエのゲノムの遺伝子の最初のコーディングのエクソンの特定のサイトに Rna (gRNA) をガイドします。転写活性化シーケンスを含む外因性ドナー プラスミドを使用すると、その後、セル自律修復機械正確な削除と、トランスと、エクソンの交換の結果、DSB のホモロジー監督修復 (HDR) が可能にします。シーケンス。ノックでトランスは細胞でのみ発現するcis-置き換えられた遺伝子の調節配列が機能。ショウジョウバエ fgfで表されるバイナリ転写ドライバーを生成するここで説明した詳細なステップバイ ステップ プロトコル/無店舗-任意遺伝子の組織特異的発現に採用されることができます/神経上皮細胞を作り出します。
Introduction
ターゲット遺伝子発現の遺伝のツールボックスをショウジョウバエ、それにさまざまな細胞プロセスにかかわる遺伝子の機能を調べるための最高のモデル システムの 1 つでも開発しました。ショウジョウバエの遺伝学的モデル1 (図 1) で組織固有のエンハンサー トラップと遺伝子ヒトのGal4/UA (上流活性化配列)、酵母などのバイナリ表現システム初採用。このシステムは、多数の遺伝子の過剰発現、ヒト、セルもセル アブレーション、セル マーキング、細胞と分子のライブ トレースの選択されたグループでノックアウトの時空間的制御などの技術の開発を促進開発中にモザイク解析トレースする血統と組織胚プロセス。LexA細菌のようなバイナリの転写システムの数/LexAopシステム (図 1) およびアカパンカビQ システム、強力な遺伝学的ツールに加えて、ショウジョウバエ、広く使われるようになりました目標とされた遺伝子発現1,2,3元の Gal4/UAS システム。
ゲノム編集技術を採用することにより信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術の最近の進歩は、有機体の広い範囲で指示されたゲノムを変更する前例のない機会を許可しています。その他の利用可能なゲノム編集技術と比較して、CRISPR/Cas9 システムは安価で効率的、かつ信頼性の高いです。この技術は細菌の適応免疫系の構成要素を利用:化膿連鎖球菌二重鎖切断 (DSB) を作成して特定のゲノムのサイト、Cas9 をガイドするキメラ ガイド RNA (gRNA) の Cas9 エンドヌクレアーゼターゲットを絞った DSB4。セルには、異なる経路を用いて DSB の修復する機械が含まれて。非相同末端結合 (NHEJ) は、ホモロジー監督修理 (HDR) がテンプレートとして外因性の HDR ドナーを使用して、定義された監督/望ましいゲノム ノック-/ノック アウトを紹介しながら遺伝子機能を混乱させる小さな挿入または削除に します。HDR ベース交換戦略は、伝統的なエンハンサー トラップ法のすべての制限を克服することができます信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する効率的に利用できます。ショウジョウバエの内因性転写と転写後調節の制御の下で表されるバイナリ転写ドライバー行を生成する HDR の CRISPR/Cas9 ベース修理の利用手順について述べる遺伝子。このプロトコル ドライバーのラインのために特定の世代を示す無店舗気管の気道上皮5の分岐の形態形成を調節する FGF ファミリー蛋白質 (bnl) 遺伝子。この例では、 bnl遺伝子の最初のコーディング エクソンが細菌LexA転写活性化シーケンスのシーケンスによって、内因性のcisを変更することがなく置き換えられました- bnl遺伝子の制御配列。戦略が時空bnl -排他的にLexAoperator (LexAopまたはシャワー) の下流に配置されますレポーター遺伝子の発現を制御するbnl LexAドライバー行を生成することを示す上皮・間葉系/神経細胞を表現します。
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Protocol
1. 設計と gRNA 発現ベクターの構築
- エクソンの長い定義された領域を正確に置き換える、デュアル gRNA アプローチ6、各 gRNA することができます具体的には選択した関心領域の両端をターゲットを使用します。ドライバーの正確な遺伝子特定の時空間表現を得るためには、遺伝子の最初のコーディング エクソン内の 2 つの gRNA ターゲット サイトを選択します。
-
ショウジョウバエ、flyCRISPR 最適なターゲットのファインダー ツール (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) を使用して、gRNA ターゲット ・ サイトを選択します。CRISPR 設計の最適化ツール (http://crispr.mit.edu)、FlyCas9 を含む、同様に他 CRISPR のデザイン ツールを使用ことができます (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9)、および E-ぱりっとした (www.e-crisp.org/E-CRISP)。
注: gRNA デザインおよびクローン作成の次のプロトコル方法前述6,7から採用されました。- オンライン ツールで提供されるボックスに実際のシーケンスをコピーします。「選択のゲノム」のドロップ ダウン メニューで最も最近リリースされたショウジョウバエキイロショウジョウバエ ゲノムの注釈版、"r_6、"を選択します。フィールド「選択ガイド長 (nt)」で「20」を入力「すべて CRISPR 目標」見つけるし、「CRISPR ターゲットの検索」をクリックするを選択します。
- "PAM"「厳密」と「NGG のみ」の「最大値」を設定することによってすべての候補 gRNA ターゲットを評価します。任意の潜在的なオフ-ターゲットまたはターゲットを離れて可能な限りの最小番号を付けず gRNA サイトを選択してください。Web ツールを使用しては、潜在的な「良い」アクティビティ スコアと gRNAs を選択する 2014年8 Doenchらで説明します。
- 同時に、親のフライラインに注入 (例えば、nos Cas9 BL # 54591 X 染色体で) のために選択のゲノムでの gRNA ターゲットの一塩基多型がないことを確認します。グラッツら20157親フライラインからゲノム DNA を抽出するために記載されているプロトコルに従ってください。PCR 増幅、フランクの関心と忠実度の高い DNA ポリメラーゼ; シーケンス プライマーを使用して 500-1,000 nt 地域約、PCR によって増幅される製品のシーケンスを確認します。
-
タンデム gRNA 発現ベクターを生成するには、2 つの protospacer シーケンス pCFD4 RNA 発現ベクターに導入する結紮独立クローニング プロトコル6に従ってください。両方の sgRNAs は、強い U6:3 プロモーター9 (https://www.crisprflydesign.org) から表現されますが、改善されたマルチ gRNA 発現ベクター (pCFD5) は利用可能な今ことに注意。PCFD4 ベクトルに、gRNAs を複製するのに DNA アセンブリ メソッドを使用します。
- 設計し、発注 RNA 発現ベクター pCFD4 に 2 つの protospacer シーケンスを導入するための前方および逆のプライマー (表 1 a)。前述の6、前方のプライマーには U6 1 プロモーターと pCFD4; gRNA コアに対応する領域が並ぶ最初の protospacer シーケンスが含まれています逆のプライマーには、gRNA コアと pCDF4 で 3 U6 プロモーターに対応する領域が並ぶ 2 番目 protospacer 逆の補数シーケンスが含まれています。
- DNase、RNase フリーの二重蒸留水 (ddH2O) を 100 μ M にプライマーを再懸濁します。10 μ M の作業濃度のプライマーを作る。PCFD4 プラスミッドのテンプレートとして使用し、忠実度の高いポリメラーゼを用いた PCR 反応6の設定をお勧めします PCR 反応を設定します。
- PCFD4 に増幅産物のクローンを作成、次の反応を設定して BbsI 酵素 pCFD4 プラスミドをダイジェスト: 2-5 μ g の pCFD4 プラスミド、消化バッファー x 10 の 5 μ、1 μ L BbsI 酵素と ddH2O 50 μ L の最終巻をさせるの。やさしく簡単なスピンによって管の壁から下にすべての散乱の滴を収集管をタップして反応内容をミックスします。2 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
- ステップ 2 やステップ 3 から消化の製品から 1% の agarose のゲルの PCR の製品を実行します。DNA のバンドを完全に分離する十分な時間のための電気泳動を行います。正しいカットは製造元の指示、次ゲル溶出列を使用して予想される製品を浄化する前に UV のトランス照明下での DNA バンドをサイズ (材料の表を参照してください)。PCR の製品は 600 をする必要があります、bp と一直線に並べられた pCFD4 プラスミド ~6.4 kb 6をする必要があります。
- 製造元の命令ごとの PCR チューブに DNA アセンブリ反応を設定 (材料の表を参照してください)。
- アセンブリ製品の 2 μ L を (DH5α または ΔrecA1、ΔendA1と似たような系統) 有能な細菌に変換、アンピシリンのプレート (100 μ g/mL) LB (ポンド/Amp) 寒天を含む、37 ° C で一晩インキュベートします。DNA アセンブリ ミックス可能性があります特定の細菌の系統に有毒であるが、毒性を減少させることができるアセンブリのミックスを希釈することに注意してください。
- 一晩培養プレートから 3-4 アンピシリン抵抗性コロニーをピックアップ、3 mL の 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB にコロニーを接種して 37 ° C シェーカー内のバクテリアの一晩を接種。製造元の指示に従ってプラスミド ミニ準備キットを使用して一晩培養細菌プラスミドを抽出 (材料の表を参照してください)。
- タンデム gRNA 挿入を含む正しいクローン画面に T3 普遍的なプライマーでプラスミドをシーケンスします。細菌、シーケンス確認 pCFD4-gRNA で 20% のグリセロールおよび将来使用するため-80 ° C のフリーザーのストアと変換のグリセロール ストックを確立します。
2. 設計と HDR ドナーを構築
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遺伝子ノックアウトのGal4とLexAシーケンスの HDR の二本鎖ドナー相同両腕に挟まれた転写活性化シーケンスを含む設計します。
- 使用 > 1.5 kb を離れ、サイト右側相同腕 gRNA ターゲット側面します。拡張ホモロジー腕は、修復プロセス10中に HDR の効率を高めます。
- PCR 増幅注入用に選択された親フライラインから抽出したゲノム DNA (gDNA) から相同性の腕 ((X 染色体) の例えば、nos Cas9 BL # 54591)。校正ホット スタート Taq DNA ポリメラーゼ酵素長い PCR の拡張機能の適切な使用 (材料の表を参照してください)。シーケンスを確認します。
- エンジニア リングの軌跡に gRNA の再ターゲットを避けるため、gRNA の認識部位が導入された外因性シーケンスによって破壊され、このような方法で代替ドナーをデザインします。
注: 推定のシス調節配列を変更することを避けるために、常に、コーディングのエクソン領域内 gRNA 認識サイトを選択します。 -
交換用カセットを生成する、一緒に 4 つのセグメントを結合する DNA の集合戦略を計画する: 5' と 3' の相同性腕、中間外因性転写活性化 dna 塩基配列と一直線に並べられたクローニング ベクター バックボーン (例えばpUC19 またはその他よく使用されるクローニング ベクトル)。DNA アセンブリの製造元のガイドラインに従う (材料の表を参照)、PCR の拡大や各セグメントの組立に適したプライマーを設計します。DdH2o. を 10 μ M 作業濃度プライマー 100 μ M にプライマーを再懸濁します。すべての PCR 反応に忠実度の高いポリメラーゼを使用します。次のプロトコルに従います。
- PCR 増幅Gal4またはLexA式カセット使用可能なベクトルから (例えば、nls-LexA:p65; 理想的なGal4/LexA/QF2発現プラスミドを検出して Addgene など一般的なリソースから取得できる) を使用して、プライマーは、表 1 bに記載されています。
- 編集ゲノム遺伝子キメラ mRNA を表現し、このような方法でカセットをデザイン転写活性化 DNA シーケンスの表現に置き換えられるエクソンのオリジナル転写と転写後の規制がすべてを保持するための遺伝子の転写活性化.任意の選択的スプライシングの信号を保持するターゲットのエクソンの 5' と 3' 端を保持します。
- 5' をエキソンとキメラ蛋白質への翻訳を防止する転写活性化シーケンスを符号化残留間 T2A 割自己ペプチッド シーケンスを組み込みます。外因性転写活性化シーケンス (図 5) 後翻訳終止コドンを追加します。
- PCR 増幅注入用に選択された親フライラインから抽出したゲノム DNA (gDNA) から相同性の腕 ((X 染色体) の例えば、nos Cas9 BL # 54591)、プライマーを使用して表 1 bに記載されています。忠実度の高いポリメラーゼを使用して、システムを次のように使用してすべての PCR の反作用のため: 5 μ L 反応バッファー、10 mM の dNTPs の 0.5 μ、10 μ M の 1.25 の μ L x 5 の前方のプライマー、10 μ M の 1.25 の μ L 逆プライマー、0.25 μ L の忠実度の高い DNA ポリメラーゼ DNA テンプレートの 0.5 μ L、16.25 μ ddH2o.
- PUC19 などクローニング ベクトルを線形補間を使用します。ドナー ベクトルの数が今あります。次のウェブサイト http://flycrispr.molbio.wisc.edu での包括的なリストを参照してください。
- 1% アガロースゲルで PCR の製品を実行します。望ましくない無指定バンド (もしあれば) から目的のバンドの明確な分離を確保するのに十分な時間のための電気泳動を行います。予想される DNA 断片をゲル浄化します。分光光度計を使用して各浄化された DNA のフラグメントの濃度を測定します。
- 製造元の指示に従って DNA アセンブリ反応を設定します。ステップ 3 から線形補間クローニング ベクトルとターゲット フラグメントをミックスし、ステップ次の反応で 4: 線形の 1 μ L は ddH の 20 μ L に最終的な反作用ボリュームをもたらすクローニング ベクトル (50 ng/μ L)、各ターゲット フラグメントの 2-3 倍の過剰、DNA アセンブリのマスターの組合せ、× 2 の 10 μ L
2o. 加温 50 ° C で 1 時間反応混合物 - 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB/アンプ ・寒天プレート上にプレートを有能な細菌にアセンブリ製品の 2 μ L に変換します。また、青/白のスクリーニング用プレートに X ギャル + IPTG を追加します。
- 一晩培養プレートから 3-4 白コロニーをピックアップ、3 mL の 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB にコロニーを接種してシェーカーで一晩 37 ° C で成長します。次の製造元プラスミド ミニ準備キットを使用して一晩培養細菌から抽出プラスミドのマニュアル (材料の表を参照してください)。
- 画面 PCR または制限の消化力の肯定的なコロニー。
- シーケンスでは、最終的なプラスミッドの HDR ドナー領域を確認します。今後接種-80 ° C で 20% のグリセロールの正しいクローンを変換する細菌の在庫を保存します。
- PCR 増幅Gal4またはLexA式カセット使用可能なベクトルから (例えば、nls-LexA:p65; 理想的なGal4/LexA/QF2発現プラスミドを検出して Addgene など一般的なリソースから取得できる) を使用して、プライマーは、表 1 bに記載されています。
3. 胚の注入、ハエの遺伝学およびゲノム編集のためのスクリーニング
- 準備高純度エンドトキシン フリー gRNA 発現ベクターとプラスミド maxiprep を使用して HDR ドナー プラスミド キット (材料の表を参照してください)。
- 共同6番 Cas9胚の生殖細胞に gRNA 発現プラスミド (100 ng/μ L) と代替ドナー (500 ng/μ L) を注入します。注: 注入の業者が、同様の研究室でこの手順を実行することができます。
-
遺伝学とスクリーニング (図 2および図 3) を飛ぶ。
- 大人に注入された胚を開発、各単一の G クロス0はバランサーはえへ飛ぶ。対象となる対立遺伝子を含む染色体の適切なバランサーを選択します。
- 麻酔 F1 各 G0 から子孫 CO2パッドの上を渡るし、顕微鏡下で 10-20 男性をランダムに選択します。個別に渡ったバランサー女性図 3に示すように。
- 各クロスから単一の F1 父を拾うに F2 幼虫ハッチと、単一フライ ゲノム DNA の準備のプロトコルを使用して gDNA を抽出します。
- GDNA 抽出バッファーを準備: 10 mM Tris Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM の NaCl、常温で保存します。プロティナーゼ K 原液 20 mg/mL を準備し、冷凍庫で保存します。
- 各フライを 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。-80 ° C のフリーザーで腐ってしまう。
- プロティナーゼ K の 200 μ G/ml の最終濃度 gDNA 抽出バッファーの新鮮な作業量を準備します。
注: この手順には、古いバッファーを使わない。 - 液体を塗布することがなくバッファーをつぶしの 50 μ L を含むピペット チップで 10-15 s の各フライをスキッシュします。チューブに残りのバッファーを省略し、よく混ぜます。37 ° c 20-30 分間インキュベートします。
- プロテイナーゼ K を不活性化に 1-2 分間、95 ° C の熱ブロックのチューブを入れてください。
- 10,000 x gで 5 分間回しなさい。さらに PCR 分析のための 4 ° C で準備を格納します。
- ネガティブ コントロールとして機能するために、 nos Cas9フライから gDNA を準備するのに同じ方法を使用します。正しい「端を」HDR (図 2図 5) を使用して識別するために 3 ステップ PCR によって基づくスクリーンを実行テンプレート5として各 F1 男性の gDNA。次の PCR 反応系における DNA の準備の 1 μ L を使用: 染付、各のプライマー (10 μ M)、DNA テンプレートの 1 μ L と ddH2o. 7 μ の 1 μ L の PCR マスター ミックス × 2 の 10 μ L
- 図 5 aに示すように、挿入または交換の存在をプライマー fwd1 と画面に rev1 を使用して PCR を実行します。挿入や交換が 3' 領域を確認する fwd2、rev2 のプライマーを用いた PCR を実行します。「終了の」HDR (表 1) を確認する M13F と rev3 のプライマーを用いて PCR を行います。
- 確認終了アウト HDR とフライラインを維持し、F2 世代からバランスの取れた株式を確立します。他の染色体に変異を認めない意図を削除するもう一度バランサー ハエ outcross します。
-
長い PCR の増幅するため確立された株から高品質 gDNA を準備 (> 800-1,000 nt) 忠実度の高い Taq ポリメラーゼと完全にシーケンスを増幅を確認設計されたゲノム領域から得た amplicons。また、原油 gDNA エキス説明使用以前短い増幅する (< 800 nt)、編集されたゲノムをシーケンス検証する PCR の製品を重複します。次のプロトコルを使用して良質ショウジョウバエのゲノム DNA を準備します。
- 1.5 mL 遠心チューブに 25 大人のハエについて入れ、少なくとも 1 時間は-80 ° C または-20 ° C のフリーザーで凍結します。
- 溶液の 250 μ L を追加 (pH 9.0 トリス塩酸 0.1 M、0.1 M、EDTA SDS 1%)。
- マイクロ遠心チューブ用の均質化の乳棒を使用してハエを均質化し、氷のチューブを置きます。
- 70 の ° c で 30 分間インキュベートします。
- 35 μ L KOAc (5 M) の手ふれとよく混ぜて、追加が、ボルテックスにかけないでください。
- 氷上で 30 分間インキュベートします。
- 12,000 × gで 15 分で回転します。
- 1 mL ピペットで慎重に戻って任意の沈殿物を残して、新しい管に明確な上澄みだけを転送または中間期します。
- 上清にイソプロパノールの 150 μ L を追加します。逆解析による優しく混ぜます。
- 10,000 x gで 5 分で回転します。
- 慎重に上澄みを除去し、管にペレットを残します。
- ペレットを 1 mL 70 %etoh。
- 12,000 × gで 5 分で回転します。
- 上澄みを除去します。空気は、15 〜 20 分のペレットを乾燥させます。以上、ペレットを乾燥しないでください。
- DdH2o. の 100 μ L でペレットを溶解します。
- ハイファイ長い増幅に適した DNA ポリメラーゼを使用 (> 800 bp) 完全な編集領域を増幅します。理想的には、ゲノム領域を増幅する挿入されたカセットの外側 2 つのプライマーを取る。ゲルは、PCR の製品を浄化してシーケンスが複数重複するプライマーと製品を確認、前述したようです。
-
設計されたフライラインの解剖組織/胚から正しい時空間の表現パターンを検証します。
- ハイブリッド mRNA 製品 (表 1) の発現を確認する総 RNA からの RT-PCR 法を実行します。
- 式を検証する幼虫組織/胚の関心の mRNA 製品の場で交配を実行します。
- スクリーンは、シーケンス確認終了アウト線の間で正確な組織特異的時空間発現パターン クロスの編集済みの行がそれぞれにシャワーGFP とシャワー- RFP (のバイナリ式ドライバーの取得LexAドライバー) 線 (ブルーミントンのストック センターから利用可能)、 LexAまたはGal4蛍光顕微鏡下で胚、幼生及び成体組織におけるレポーター遺伝子発現を駆動を観察。
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Representative Results
このプロトコルは、ターゲット バイナリ式レポーター システム特定のbnlセル5を表現するための生成に使用された正常に。Cis-複雑な時空間bnl式を制御する規制要素 (クレス) が特徴付けされていません。したがって、内因性bnl規制シーケンスの制御の下での時空間表現を成し遂げるためには、 bnlのだけ最初のコーディング エクソンは細菌LexAトランスのシーケンスに置き換えられますように設計されました。ショウジョウバエの最適な表現を提供するために知られている改良されたnls LexA::p65カセットが選ばれました。
交換戦略目的、キメラを生成するnls-LexA:p65-bnl mRNA 転写と転写後の内因性制御の下で。このキメラ mRNA にそのままbnl 5' UTR、5' 端と 3' 終わりエクソンをコーディング編集bnlの一部が含まれている (最初エクソン)、完全な下流bnlイントロンとエクソン。交換のエキソンの選択的スプライシングbnl RNA 特定を維持するために取り替えられたコーディング エクソンの小さな 5' と 3' 端が保持されました。しかし、キメラ Bnl タンパク質の合成を防止する nls-LexAを融合: p65、残留 5' bnlコーディング領域との ATG 間組み込まれた自己切断のペプチッド シーケンス T2A nls-LexA:p65。また、翻訳終止コドンは後に追加された、 nls-LexA:p65 、切り捨てられた Bnl タンパク質5 (図 4および図 5 a) の共同翻訳を避けるため。
これらのすべての機能を含む代替ドナーが使用された、 T2A- を持っていたnls-LexA:p65シーケンス 2 kb 5' - と 1.8 kb 3' - 相同性の腕。相同性を長い腕が効率的な HDR と修理のサイトで大きい DNA のフラグメントの挿入のために使用された (T2A-nls-LexA:p65 1.8 kb) (図 5 a)。
2 つの gRNAs は、 bnlの最初のコーディングのエクソンのほとんどを削除する定義された位置で Dsb を作成に使われました。1.3 (PAM シーケンス下線付き) に記載されているすべての条件に一致する 2 つの gRNAs は次のとおりです。
gRNA1: TGTATCTGCGATGCCCCTCATGG
gRNA2: ATCCTTCAGATATTGCGGGATGG
外因性T2A- によって代替ドナーで両方の gRNA 認識部位は崩壊したnls-LexA:p65シーケンスは、エンジニア リングの軌跡に gRNAs の再ターゲットを避けるために最も簡単な方法です。交換用ドナー (イタリック体の gRNA 認識部位を破壊する外因性のシーケンス) で中断 gRNA 認識シーケンスは次のとおりです。
gRNA1: TGTATCTGCG-GGCTCCGGCGAAGGAC.
gRNA2:.AAAAACTCGTTTAGACGGGATGG
交換用ドナーと共に、これらの gRNAs を含む pCFD4 gRNA 式ベクトルだった co nos Cas9胚の生殖細胞に注入しました。ここで説明したプロトコルが続いた後、目的の交換 (図 5 bC) の画面に。注入された G0 動物の約 67% が肥沃。肥沃な G0s の 56% が HDR 正の子孫をもたらしたの創設者。F1 の子孫がチェックの間で成功した HDR の約 23% が陽性し、肯定的な HDR の 73% が「終了・ アウト」(表 2)。最初のコーディング以来bnlのエクソン「爆睡」、すべてのヘッダー行が見つかりましたホモする致死と株式を分散維持されました。
細胞のキメラLexA bnl mRNA の世代は、RT-PCR 解析 (図 5) によって認可されました。得られたbnl-LexA線したかどうかを確認する「終了-アウト」HDR 各行はシャワー mCherryCAAX遺伝子組換えハエ5、および記者の表現パターンに交配された内因性bnl表現パターンで表現、子孫胚および幼生を調べた。42 のうち 46 行は、以前に報告されたbnlパターン5 (図 6) と一貫性のある正確な時空間表現を示した。4 行はいずれかの弱いまたは非固有の表現パターンを示した。我々 は、これらの行に徹底したシーケンス解析とを確認する必要があります我々 の変異を蓄積した予測します。一緒にこれらの結果は、エクソンの HDR を介した交換戦略が遺伝子の目標とされたバイナリ表現システムを生成する雇われる可能性があります正常に確認します。このツールは、記者やbnl遺伝子の時空間パターンの異所性の遺伝子を表現する正常に使用できます。
図 1: バイナリ転写システム目標とされた遺伝子の表現のためのスキーム。Cisの制御の下で表されるトランス (GAL4またはLexA)-遺伝子の調節配列 (クレス) ドライブの特定のトランスクリプション結合部位 ( Gal4のUASの下流に配置されますエフェクター遺伝子またはLexAのLexAop )。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集バイナリ転写システムを生成するためのワークフローの概要。各ステップに必要なおおよその時間が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: スクリーニングと遺伝子ゲノム編集フライ ラインを確立するためのスキーム クロス CRISPR のイラスト。交配、R は 3rdの染色体上にある編集された対立遺伝子を表しています。MKRS(Tp (3; 3) ミセス M (3) 76A [1] 嘉 [1] ry [2] Sb [1])、3rd染色体マーカー;TM6B(Antp [胡] e [1] (3LR) TM6B の Tb[1]) は 3rd染色体バランサー。F2 か F3 世代ハエと PCR の製品を決定するシーケンスから抽出したゲノム DNA からの興味のターゲット領域の増幅 PCR によるゲノム編集のはえの在庫が確認されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: DNA アセンブリによって取り替えカセットの生成します。Pcr と別の PCR の製品のアセンブリを描いた図 (a、b、および c) を (d) DNA のアセンブリ メソッドを使用してドナー ベクトル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: エクソン置換の CRISPR/Cas9 を介したbnl LexAの世代。(A) bnl軌跡エクソン置換の HDR を介した CRISPR/Cas9 の戦略を描いた図。ボックス - エクソン;ライン ・ イントロン;交換用ドナー (pDonor-bnl:LexA) と HDR の 2 つの可能な結果を示した。PDonor-bnl:LexAは、次の機能を持っていた: (1)T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) シーケンスは長い間相同性腕 (破線)、残留の N 端末bnlエクソンと、の (2) の T2A 自己切断のペプチド 2 kb、1.8 kb が並ぶnls-LexA:p65、(3) 翻訳終止コドン (赤 *) 後、 nls-LexA:p65シーケンス。HDR 製品保持bnlと LexAの転写と転写後のコントロール: p65 タンパク質は内因性の Bnl 小さな黒い矢印に示す相対結合部位 (では同じパターンで生産見込み。スケール) の 3 段階の審査や RT-PCR 法検証用 PCR プライマー (表 1)。(B) Agarose のゲルの写真 3 ステップ PCR のスクリーニングの結果を示す。4 成功終了アウト HDR 行の genomic DNA からの増幅 PCR の製品が表示されます。負の制御、 nosのゲノム DNA-Cas9 はくさい。肯定的な制御、pDonor -bnl:LexAプラスミド;M、マーカー (SL2K DNA の梯子)。(C)終了の行の M13F と rev3 のプライマーを使用して予想される PCR の製品を示すスクリーニング ゲルの例M8 と M9 6、2 端の行;B と同じ正と負のコントロールM、マーカー (くちばし 1 kb の DNA の梯子)。(D) bnl LexAとnos Cas9コントロールからの総 RNA を RT-PCR 法によって解析が飛ぶ。前方のプライマーはLexA特定領域にバインド、下流bnlエクソン領域に逆プライマーを結合~ 440 bp (塩基) 増幅帯域 (*) は、 bnl LexAの RT-PCR から検出された mRNA ではなく RNA 制御から。M、100 bp マーカー (NEB)。デュらの数字 2、S1 から適応。20175。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 種々 の組織における組織特異的な条件付きのbnl LexA式の検証。グリーンで示したセルを表現するbtlと異なる幼虫体内 (赤) (A-D) bnl式。(A、A')ウィング ディスクbnlソース先に成長の気嚢原基 (ASP)。(B、C)bnl TR5 横結合 (TC) (B) と TR2 背枝 (DB) (C) の表現。性器のディスク (D) bnl式。(E J)胚気管分岐 (グリーン) パターニング; 中に動的bnl式 (赤)小さな矢印、10 の段階で気管プラコードを取り巻く 5 つのbnlソース。遺伝子型: A 〜 J;btl-Gal4 UAS-CD8GFP/+;bnl-LexA シャワー-CherryCAAX/+。(K L")低酸素-は、 bnl LexA翅原基に発現を誘導し、TR2 気管節 (TC、DB、背トランク DT) を関連付けられています。遺伝子型: bnl-LexA シャワー -CherryCAAX/+。(前のヴィヴォから K) コントロール ディスク CoCl2臓器を培養しました。(L「) 翼ディスク (L, L') と気管 (DT は、(L ' ')) CoCl2が付いている器官培養前のヴィヴォから誘発低酸素症。低酸素による星、異所性の表現。スケール バー = 30 μ m;50 μ m (K L")。デュら図 3から適応。20175。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| A. gRNA のクローニングとシーケンス | |
| bnl lexA gRNA fwd |
TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| bnl lexA gRNA rev |
ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG CGACGTTAAATTGAAAATAGGTCで |
| T3 プライマー シーケンスの使用 | CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3' |
| 注意: 下線のヌクレオチドは、U6 プロモーターまたは pCFD4 ベクトルに gRNA コアにアニール、小文字の g/c 追加されました U6 プロモーター依存型転写を支援するために | |
| B. HDR ドナー建設 | |
| bnl N F_pUC19 | AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac |
| bnl lexA N R |
tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccggaGCCCGCAGATACAAGGCCC C |
| lexA F |
CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGCCCtATGCCACCCAA GAAGAAGC |
| lexA-R | CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC |
| Fwd の bnl lexA-C | TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC |
| bnl C R_pUC19 | GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg |
| 注: ギブソン アセンブリ、下線のヌクレオチドの pUC19 ベクトルと資本の重複のヌクレオチドが T2A ペプチド添加をオーバー ハングするシーケンス。 | |
| C. HDR スクリーニングとシーケンス | |
| bnl lexA scr fwd1 | GTGGCGCACGCCCAATAAAC |
| bnl lexA scr rev1 | GATCCCAGCCAATCTCCGTTG |
| bnl lexA scr fwd2 | CAACGGAGATTGGCTGGGATC |
| bnl lexA scr rev2 | CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC |
| チェック終了の rev3 | GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC |
| bnl lexA seq fwd3 | CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG |
| 注: これらのプライマー PCR スクリーニングと投入順序付けのために使用された、プライマー結合部位のおおよその位置は、fwd1 2 と rev1 3 として図 5 a に表示されます。 | |
| D. RT-PCR 解析 | |
| RT f | GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG |
| RT r | CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG |
テーブル 1: この研究でプライマーを使用します。(A) gRNA 発現ベクターにクローニングとシーケンス用プライマー。HDR ドナー テンプレートのクローニングのためのプライマーを (B)。(C) スクリーニングと HDR 製品の配列のプライマー。(D) プライマー RT-PCR キメラLexA bnl mRNA 製品の検証に使用します。
| 遺伝子型 | HDR 伝送率 (# HDR 降伏 G0/# 肥沃な G0) | # HDR プラス F1/# 合計 F1 チェック (%) | #「終了-アウト」HDR/# 合計 HDR (%) |
| bnl LexA | 56 (15/27) | 23 (60/259) | 73 (46/60) |
表 2: CRISPR/Cas9 を介した HDR の効率です。HDR の伝送速度は、HDR 降伏 G0/# 合計肥沃な G0 の数として計算されます。成功した HDR % は、HDR プラス F1/# 上映総 F1 の数として計算されます。「終了-アウト」% は、「終了-アウト」HDR/# 合計肯定的な HDR の数として計算されます。
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Discussion
伝統的に、ショウジョウバエエンハンサー トラップは、2 つの異なるメソッドによって生成されました。いずれかのドライバーのランダム挿入が含まれています (例えば。、 Gal4) 転位によってゲノムのシーケンス (e.g。、P 要素の転位)1 。また、ゲノム3,11の異所性サイトに統合される、プラスミドの構成体で推定エンハンサー/プロモーター領域の転写制御の下でドライバーのシーケンスを配置できます。これらのメソッドはショウジョウバエのGal4とLexAエンハンサー トラップの大きなプールを生成、いくつかの制限がある.ゲノムの P 要素仲介されたランダムな挿入が重要なcisの規制活動を妨害・規制シーケンス。ゲノムのランダムの転位によるトランス式は複数の隣接遺伝子のパターンを報告ことがあります。その一方で、遺伝子のシス調節配列の知識はエンハンサー トラップ プラスミドの構造体の必要です。またクローンおよびプラスミド構築でテストがシーケンスの長さに制限があります。分離してだけ内因性ゲノム文脈の部分的な DNA の断片をクローニングは完全な遺伝子発現パターンを再現可能性がありますはできません。例えば、エンハンサー トラップbnl遺伝子控えて Gal4 要素の P 要素の挿入によって生成されたbnl Gal4 (NP2211) 線は完全5 胚の遺伝子発現パターンを再現してないです。.したがって、このようなコンテキスト、転用技術 (アシスト ホモロジー CRISPR ノックで)、ハックなどで、別のLexAまたは Q システムに変換する既存の Gal4 ライン ドライバー ライン12をベースことができます非常には役に立ちません。これらの制限を克服するために、ここでは、我々 はゲノム編集によるバイナリ表現システムを生成するための効率的かつ代替方法を説明します。この方法では遺伝子の最初のコーディングのエクソンは、トランスとスワップ (eg。、 LexAまたはGal4) 転写ドライバーの式が専ら遺伝子発現の時空間パターンを模倣するようにシーケンス。戦略とここで説明されているプロトコルは、 bnl式の最適化された、メソッドも他の遺伝子を簡単に適用できます。
この実験的戦略で最も重要なステップは、ターゲット遺伝子領域内で挿入部位を決定します。提案法は、転写bnl遺伝子5の転写後の規制だけでなく、すべての元を保持する設計されました。したがって、我々 はbnl遺伝子の最初のコーディングのエクソンのほとんどを削除してLexAカセットで置き換える計画。交換が編集した対立遺伝子がハイブリッドLexA-bnlを表現するように計画された内因性転写翻訳から mRNA イントロンのすべての領域を維持しながらbnlのサイトを開始。しかし、mRNA は農産物だけLexA蛋白質、しかしない Bnl に設計されたハイブリッド。我々 は戦略がbnl LexAを正常に生成した示した/シャワー-ベースの転写システムとシステムが動的、時空間のbnlの発現パターン (図 5)5 を正確に報告できます。.目標とされた遺伝子が生存に不可欠である場合、このプロセスの制限事項はショウジョウバエ線でホモ接合体致死です。さらに、デュアル gRNA 戦略の使用は、オフのターゲットを編集のチャンスを高めるかもしれない。これらの問題を避けるために、代替戦略を用いることができます。LexAまたはGal4カセットこの戦略で置き換えられた遺伝子とLexA/Gal4カセットとのままコーディング エクソンの開始の自己切断のペプチッド シーケンスを配置ことができます。 T2A の ATG 開始地点右を配置ことができます。ターゲット遺伝子。この戦略は、transctivator と機能性遺伝子産物に変換することができますキメラ mRNA を生産する予定です。このようなデザインをホモ接合体致死の可能性を低減する可能性があります。この戦略では、単一の gRNA ゲノム編集十分です。ただし、 Gal4/LexAドライバーによって駆動される組換え蛋白質の変形の発現遺伝子の 2 つのコピーが存在 (例えば、 bnl LexA シャワーBnl の式を駆動: GFP 融合、または Bnl タンパク質。削除) では、変異体タンパク質の機能の情報は提供しません。
ゲノム編集方法の制限は、ターゲット設定とを同時に単一の遺伝子の編集の骨の折れるプロセスです。しかし、シンプルさと CRISPR/Cas9 を介したゲノムの編集法の有効性をもたらしました標的ゲノム ノック-/ノック アウトとを設定する任意の標準研究室で簡単に利用することができます交換技術。最後の数年でショウジョウバエ研究者は基本的な生物学的プロセス7,13 理解に不可欠な遺伝子のツールセットを展開に用いることができるゲノム編集の便利なツールキットを開発しました。.ゲノム編集と選考プロセスは、ここで説明した、比較的高速な任意他相同組換えベースの交換と比較して約 2 ヶ月かかります。成功して効率的なゲノム編集結果、技術的に重要ないくつかの手順を実行することが重要です: 1) 最大の逼迫と潜在的なオフのターゲット; なしアクティビティによって各 gRNA を選択2) HDR ドナーには ~1.5 kb ホモロジー腕 gRNA サイトをターゲットの側面が含まれます。長いホモロジー腕 (1.8-2 kb) を大規模な外因性 DNA 断片; 挿入する必要がある場合 HDR の効率を上げるため3) HDR ドナーはエンジニア リングの軌跡; に gRNA の再ターゲットを避けるために gRNA 認識サイトの無料設計されています・ 4) 確実な手の込んだ計画し 3 ステップ PCR ベースのスクリーニングと遺伝子交雑のタイミングの調整は、「終了-アウト」ヘッダー行を選択します。
異なり、ランダムな転位またはクローン エンハンサー構造、戦略と我々 はここで説明されているプロトコルにより、世代の排他的にターゲットの遺伝子特異的転写、バイナリ システム。以来、ドライバーの式には、ネイティブ遺伝子エクソンが置き換えられます、ドライバーの遺伝子発現、汎用されておりすべての発育、代謝、生理条件5の下での遺伝子発現パターンを模倣する予定です。遺伝子/細胞特異的発現は、さまざまな細胞や発生生物学メソッドで使用されるすべてのバイナリ ドライバー行の最も望ましい条件です。例えば、転写ドライバーによってレポーター遺伝子の遺伝子発現ターゲット遺伝子を発現する細胞の信頼性の高い系統解析が容易になります。ライブ イメージングと時空間表現、移行、および開発の間に細胞の再編成の追跡ができます。組織形態形成、 Gal4またはLexAの過剰発現/ヒトを駆動中に細胞・分子のイベントを調査するには、さまざまな遺伝子や RNAi による遺伝子ノックダウン細胞の特定のセットには不可欠です。非常に特定のターゲットを絞った式システムを提供、公平な分析と結果の解釈。したがって、CRISPR/Cas9 に基づく遺伝子エクソンと転写活性化シーケンスとその交換の対象化は非常に特定のターゲット遺伝子発現系を生成するためのより良い代替手段を提供しています。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
CRISPR 戦略に関する議論、博士・ f ・ ポート、博士・ k ・ オコナー-ジャイルズと博士 s. 風水に感謝します。博士結核コーンバーグと試薬; ブルーミントン ストック センターUMD イメージングの中核施設。NIH の資金調達: R00HL114867 と R35GM124878 の sr。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10% SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
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