Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

Published: August 29, 2018 doi: 10.3791/58274
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioTime, Inc

Summary

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Abstract

אפיגנטיקה של התפתחות הרשתית הוא שדה מחקר למד היטב, אשר מבטיח מביא רמה חדשה של הבנה לגבי המנגנונים של מגוון מחלות ניוון רשתית האדם והצבע גישות טיפול חדשות. הארכיטקטורה הגרעין של רשתית העכבר מאורגן שני דפוסים שונים: הפוך קונבנציונאלי. דפוס קונבנציונלי הוא אוניברסלי שבו הטרוכרומטין הוא מקומי לפריפריה של הגרעין, בעוד euchromatin פעיל שוכנת על הפנים גרעיני. לעומת זאת, הפוך דפוס גרעיני הוא ייחודי רוד למבוגרים קולט אור התא האטום שבו הטרוכרומטין. רגישה למרכז הגרעין, euchromatin מתגורר באזורי הפריפריה גרעינית. מתילציה DNA נצפית בעיקר ב- chromocenters. מתילציה DNA הוא שינוי דינמי קוולנטיות על משקעי ציטוזין (5-methylcytosine, 5mC) של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזורים המקדם של גנים רבים. שלושה methyltransferases DNA (DNMT1, DNMT3A ו- DNMT3B) להשתתף מתילציה של הדנ א במהלך הפיתוח. גילוי 5mC עם טכניקות immunohistochemical הוא מאוד מאתגר, תורם השתנות בתוצאות, כמו כל DNA בסיסים כולל בסיסים 5mC ששינה ומוסתרים בתוך סליל הדנ א גדילי כפול. אולם, תיחום מפורט של התפלגות 5mC במהלך הפיתוח היא מאוד אינפורמטיבי. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי immunohistochemical חזקה של 5mC ושל עוד epigenetic DNA סמן 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), אשר colocalizes עם כרומטין 'פתח', transcriptionally פעיל בפיתוח, רשתית העכבר postmitotic.

Introduction

Epigenetic רגולציה של פיתוח, postmitotic הומאוסטזיס של רשתית העכבר הוא אזור מרתק של מחקר, אילו הבטחות להביא הבנה של מנגנונים ביולוגיים שליטה retinogenesis ותא גורל נחישות, תאים ייחודיים לסוג פונקציה מטבולית וכן תא פתולוגיות, מוות של תאים, התחדשות1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. כרומטין עובר שינויים דינמיים בשלבי פיתוח, כמו גם בתגובה אותות חיצוניים משתנה בין אם זה הלחץ, מטבולית או בתא המוות גירויים6,14,15, 16 , 17 , 18. ב העכבר גרעינים, כרומטין מחולק euchromatin פעיל והטרוכרומטין לא פעיל6,19,20. בגרעין לאטמוספרה, euchromatin שוכן באזור הפנימי של הגרעין ואילו הטרוכרומטין קווים את הפריפריה הגרעין ואת גרעינון. דפוס זה נקרא קונבנציונאלי והוא מאוד כולו ב פרוקריוטים. לעומת זאת, רוד גרעינים בעלי חיים ליליים כגון עכבר או חולדה יש הפוך דפוס שבו הגרעין מאוכלס על ידי הטרוכרומטין במרכז מוקף euchromatin ויוצרים את המעטפת החיצונית ביותר6,18, 20. בלידה, רוד גרעינים יש אדריכלות גרעיני קונבנציונלי. היפוך של רוד הגרעינים מתרחשת במהלך הפיתוח על ידי שיפוץ לאדריכלות גרעיני קונבנציונלי. במהלך תהליך זה, הטרוכרומטין היקפיים מפריד בין הפריפריה גרעינית, chromocenters להינתך יחד לצורה chromocenter יחיד במרכז של גרעין6,18.

מתילציה DNA גנומי משתתפת שליטה מקומיים כרומטין קונפורמציה21. מתילציה DNA מתרחשת במיקום 5' של ציטוזין שאריות של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזור המקדם של גנים רבים העכבר הגנום22,23,24,25,26 כמו גם intergenic ואזורים אינטרון, הנושאות אלמנטים תקינה27. מתילציה של CpG איים ב21,הפרוקסימלית היזמים24 וחלבונים CpG ג'ין משפרי27,28 חשוב בוויסות המצב הדינאמי של כרומטין טרינארית, המכיל רבים גורמים התפתחותיים גנים/תמלול משחקת תפקיד חשוב בתחום הפיתוח, סרטן להזדקנות29,30,31,32,33,34 . דנ א שלושה methyltransferases (DNMTs) להשתתף מתילציה DNA במהלך פיתוח העכבר35. כל שלושת DNMTs באים לידי ביטוי במהלך פיתוח רשתית העכבר36 , שינויים הספציפיים רשתית ב Dnmt גנים השפעת התפתחות הרשתית2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) הוא מוצר חמצוני של demethylation 5-methylcytosine (5mC). השלושה עשר-11 טרנסלוקציה (ט) אנזימים להשתתף3938,37,demethylation 5mC. Hydroxymethyl-C השינוי מועשר בתמציות היזמים, וגופי ג'ין intergenic רצף גנומית בתוך ג'ין עשיר, אזורים באופן פעיל משועתקים27,40.

יש מגוון של גישות שתואר בקביעת דפוסי מתילציה DNA שינוי של תאים41,42,43,44,45,46, חלקם הפעלת לכימות שינויים כלליים של מתילציה DNA בעוד שאחרים התמקדות מדויק שינויים באזורים עשירים CpG בתוך היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים. שיטות זיהוי, כימות של 5hmC היו גם דווח על47, לרבות על ידי אימונוהיסטוכימיה13. Immunohistochemical טכניקות, אשר מאפשרים ניטור חזקים של שינויים 5mC ו- 5hmC הגרעינים של פיתוח תאים postmitotic, הם מאוד אינפורמטיבי עבור בהתוויית כרומטין dynamics בחיי עיר בתגובה לשינויים חיצוני או פנימי להשפיע על48,4913,4,תאים. עם זאת, גישה זו היא נוטה ממעיט מתילציה DNA ושינויים hydroxymethylation עקב קשיים טכניים, הקשורים בזיהוי שינויים ציטוזין בהכנות היסטולוגית. זה בגלל ה-DNA פולרי בסיסים, כולל 5mC ו- 5hmC-השתנה ציטוזין, מוסתרים בתוך המרכז של סליל ה-DNA גדילי כפול50, וזקוקים חשיפת פרצופו האמיתי. . זה מאתגר במיוחד קפוא ההכנות היסטולוגית, אשר עלול לאבד במהירות ארגון מקיף של הרקמה המקורית כאשר היחס הקשה מוחל.

הרשתית העכבר הוא מודל מצוינת לנתח את התרומה של מתילציה DNA התפתחות עצבית, הומאוסטזיס postmitotic. יש רק 6 סוגים של נוירונים (photoreceptors רוד, קונוס, אמקרין, תאים דו-קוטביים, אופקי וגנגליון), תא גליה אחד (מולר עכשיו, דונלד) וסוג אחד neuroepithelial תא סוג (אפיתל הפיגמנט ברשתית)51. סוגי תאים ברשתית דווחו יש דפוסים ברורים של ה-DNA מתילציה18,19, אשר לאחרונה נחקרה על בסיס יחיד רזולוציה1,5,9,12. לאחרונה דיווחנו ליישום אימונוהיסטוכימיה בהתוויית 5mC דפוס של הפצה בתוך גרעין של תאים ברשתית ושינויים הגרעינים של רשתית העכבר למבוגרים, איפה כל שלושת ה-DNA methyltransferases הוסרו על ידי מיקוד מותנה 7. לעומת מספר דוחות, בו הנוכחות של מתילציה DNA של תאים ברשתית יכולה להיחשב רק חיובי או שלילי האות hypermethylated תאי העובר אפופטוזיס, הגישה שלנו זמין גילוי כרומטין ספציפי סידור בתוך האטומים התא רשתית, אשר אנו, מספר קבוצות דיווח קודם5,6,7,18,19,36 , 52. כאן, אנו מתארים את הטכניקה immunohistochemical (IHC) של גילוי 5mC ו- 5hmC בסעיפים קפוא paraformaldehyde-קבוע היסטולוגית הפרטים כמו גם להדגים את הנתונים, אשר היינו יכולים להתרבות מהדוח המקורי שלנו7 .

Protocol

כל ההליכים עם עכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי החולים אוקלנד המכון לחקר בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה של הילדים, דבקה האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש חיות אופטלמולוגיות ועל חזון המחקר.

1. רקמות הכנה Immunostaining

  1. המתת חסד C57 BL/6J עכברים ביום עובריים (E) 16, יום לאחר הלידה (P) 0, P15 ו P90 על ידי פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים E16, P0).
  2. עכבר מיד enucleate העיניים ניקב עם המחט 29G 1/2 בצד הגבי של העין. תקופת דגירה של 5 דקות (דקות) ב 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) בבאגירה פוספט תמיסת מלח (1 x PBS) pH 8.0 בטמפרטורת החדר.
  3. כדי להפוך את העין כוסות מן P0, P15 P90, שווייץ קרנית, עדשה עם מספריים אופטלמולוגיות בסדר בעוד העיניים % 4 מחברים.
    הערה: לדלג על שלב זה עבור העיניים E16 עיניו הם קטנים מדי.
  4. לתקן את כוסות העין (P0, P15 P90), כל העיניים (E16) ב 4% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העין כוסות, עיניו כל פעמיים ב 1 מ"ל של PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. Cryoprotect העין כוסות, כל העיניים ב 1xPBS, pH 8.0 המכיל 10% סוכרוז למשך שעה. לשמור על 20% סוכרוז ב- PBS 1 x 1 שעה וירווה ואז ב- 30% סוכרוז ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C.
  6. למחרת, להטביע את הכוסות עיניים והעיניים כל אופטימלית טמפרטורה תרכובת חיתוך (אוקטובר), (500 µL) ב cryomolds snap-הקפאת באמבט קרח יבש/אתנול, לאחסן ב- 80 ° c
  7. להסיר את התבניות עם העין מוטבע כוסות ועיניים כל-80 ° C, מאפשרים equilibrate ל-20 ° C עבור שעה אחת לפני cryosectioning.
  8. לחתוך חתכי רוחב ברשתית (בעובי 12 מיקרומטר) במקביל לציר temporonasal דרך ראש עצב הראייה באמצעות cryostat ב-20 ° C.
  9. הר מקטעי רשתית על שקופיות מיקרוסקופ53 וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. Immunostaining עם נוגדנים 5-mC, 5-hmC

  1. להקיף את המקטעים ברשתית רכוב על שקופיות עם עט הידרופובי המכשול. העט הידרופובי המכשול מפחיתה את עוצמת הקול של נוגדן הנדרש כדי להכתים את הרקמה.
  2. לשטוף את המקטעים ברשתית פעם אחת עם 200 µL 1 x PBS למשך 10 דקות.
  3. Permeabilize הסעיפים ברשתית עם 200 µL של 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS (PBS-T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. Denature מקטעי רשתית למשך 30 דקות עם 200 µL של טריות חומצת מלח (HCl) N 2 ב 1 x PBS ב חממה 37 ° C.
    הערה: טיטור זהיר של HCl טיפול נחוץ כדי למטב את האות 5mC.
  5. תמיד כוללים ביולוגי משכפל (3-4) תוך אופטימיזציה 5mC אות54.
    הערה: עשינו אנטיגן אחזור ב- 4 נקודות זמן (15 דקות, 30 דקות, 1 h ו- 2 h), והוא נמצא 30 דקות הדגירה אופטימלי איתות 5mC. זמן הדגירה עם HCl השתנה המבנה של גרעינים שמוביל לחוסר יכולת לבצע לוקליזציה אות 5mC את הגרעין.
  6. לאחר דנטורציה, לנטרל סעיפים רשתית על-ידי הוספת µL 100 של 0.1 M טריס-HCl (pH 8.3) על הרשתית מקטעים עבור 10 דקות.
  7. דגירה בסעיפים 500 µL של חסימת פתרון (5% סרום preimmune עז רגילה ב- 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.
  8. לאחר חסימת, להוסיף אנטי-5mC; נוגדנים אנטי-5hmC מדולל שבערך בחסימה לפתרון הסעיפים ברשתית.
  9. דגירה רשתית מקטעים לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.
  10. כביסה היום הבא, מקטעי רשתית 3 פעמים (10-15 דקות כל פעם) עם 0.1% PBS-T ואז דגירה בחסימה פתרון עם נוגדנים משניים המתאים (אנטי-ארנב עז, עז העכבר אנטי אג, מדולל; 1:1000), המכיל דאפי (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) פתרון (1 µg/mL) בטמפרטורת החדר במשך 1 h בחסימה פתרון.
    הערה: למנוע ייבוש סעיפים בכל שלבי immunodetection.
  11. לשטוף את השקופיות בפעם השלישית עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-טי
  12. לאחר השטיפה האחרונה הר הסעיפים מימית הרכבה בינונית תחת coverslip, לאטום עם לק שקוף.

3. אימונוהיסטוכימיה קונאפוקלית

  1. אוריינט הסעיפים יש את הצד אפיתל הפיגמנט ברשתית של גביע אופטיים פונה תמיד דרך אחת (למשל, למעלה), עקביות.
  2. לבצע לכידת התמונה סעיפים immunostained רשתית-63 X (הגדלה של עדשת המטרה) עם 2 X או 3 X זום.
  3. ליצור מספר מקטעים אופטי של כל תמונה שנבחרה (z-ערימות) כל 3 ערוצים (אדום, ירוק וכחול, RGB) באמצעות 0.35 שלב מיקרומטר.
    הערה: ההגדלה הסופי של הדגימה דמיינו ב- 10-20 X (הגדלה של עדשת המטרה) תהיה 63 X, בהתאמה, כאשר בשילוב עם 10 (בדרך כלל בשימוש) X העדשה הפנימית.
    דמיינו מחסנית אופטית דחוס כדי לאתר את האות 5mC ו- 5hmC

Representative Results

כדי לקבוע את ההתפלגות של 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) במהלך התפתחות הרשתית, ברשתית postmitotic, אנו immunostained C57BL/6J העכבר ברשתית סעיף E16, P0, P15, P90 עם נוגדנים ספציפיים 5mC, 5hmC.

-E16 ההכתמה 5mC הייתה חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא בזמן צביעת חלש נצפתה ב גרעינים התא כולו (איור 1 א'). ההכתמה 5hmC היה מרותק גרעינים תא והיה נעדר מן chromocenters (איור 1b).

ברשתית P0, האות 5mC מקומי את chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (איור 2a, החצים, חץ). גם הבחנו מכתים חלש של 5mC בין chromocenters של גרעינים התא. האות 5hmC היה מאוד נוכח גרעינים תא חוץ chromocenters (איור 2b). . מצאנו שעוד גרעינים מוכתמים 5mC ו- 5hmC בשכבה הפנימית neuroblast (INBL) (c איור 2, קו מנוקד)

ברשתית P15, מצאנו מכתים חזק של 5mC ושל 5hmC השכבה החיצונית גרעינית (גרת), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), שכבת תאים גנגליון (שזכתה) (איור 3). גרת (רוד photoreceptors), האות 5mC היה נוכח chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (דמויות 3a-3 c, 3 g). האות 5hmC נמצאה גרעינים התא כולו למעט chromocenters (דמויות 3d-3f). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים על הרשתית P15 מציגה את התפלגות של תחומים heterochromatic רוד תא גרעינים דומה לזה נמצא עם האות נוגדן 5mC (דמויות 3 h ו- 3עכשיו).

ההכתמה 5mC להיכנס, שזכתה היה. חזק chromocenters של גרעינים תא, צביעת חלש נצפתה גם בתוך גרעין התא כולו (דמויות 3j-3 l ו- 3r-3t). בניגוד 5mC, האות 5hmC מקומי גרעינים התא כולו למעט chromocenters להיכנס, שזכתה (דמויות 3 מ'-3o ו 3 בגודל 3u-ואט). הבחנו חזקה 5hmC אות על הפריפריה של גרעין התא שזכתה.

ב- photoreceptors רוד למבוגרים, האות 5mC היה מוגבל chromocenter ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (דמויות 4a-4 c), ואילו 5hmc האות היה מרותק הפריפריה גרעינית (4 דמויות d-4f).

Figure 1
איור 1. לוקליזציה של 5-methylcytosine ו- 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר מתחלקים היום 16.
Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). -E16, 5mC אות היא מאוד חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא גם נוכח גרעינים התא כולו ברמה נמוכה יותר. 5hmC מכתים היה באופן בלעדי מוגבלת את גרעין התא. לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. נוגדן של 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר ביום כמחנכת 0.
Immunolabeling של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). ברשתית P0, 5mC ו 5hmC נוכחים השכבה החיצונית neuroblast (ONBL) והן השכבה הפנימית neuroblast (INBL). a) האות 5mC קיים בחריפות chromocenters (חץ) ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (חץ). צביעת חלש של 5mC הוא ציין גם בין chromocenters של גרעין התא. b) 5hmC מכתים מוחזק בתוך גרעין התא, אות חזק נצפית ב- INBL (קו מנוקד לוח ג'). לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה ברשתית העכבר ב 15 יום לאחר הלידה.
Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים anti-5mC ו- 5hmC (-g, j-y). בשכבה החיצונית גרעינית (גרת) (רוד photoreceptors), האות 5mC (א) בדרך כלל עולה בקנה אחד עם chromocenters של גרעינים תא (ראש חץ, b), אדום, רגישה גם לפריפריה גרעינית (חץ, b). פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. האות 5hmC (ירוק, d) מוגבל גרעינים התא כולו למעט chromocenters. לוח אלקטרוני (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצגת 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. לוח h ואני הם שידור תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של גרעינים קולט אור-כמחנכת היום 15 בסה כ מציג בחתך תחומים heterochromatic. ראש חץ שחור ב- h לוח מצביע על מוט יחיד קולט אור גרעין בלוח ט ראשי חץ אדום בחלונית שלב לתחומים heterochromatic בתוך מוט קולט אור גרעין בעוד חצים אדומים להצביע הטרוכרומטין בפריפריה גרעינית. להיכנס (j-q), שזכתה תא גרעינים (r-y), האות 5mC (אדום) הוא מקומי כדי chromocenters ההווה בפריפריה, צביעת חלש הוא זוהה גם בשאר חלקי האטום התא. לוח k (אדום) ואני (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתקופה של התמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק) בתוך גרעין התא להיכנס, שזכתה מוגבל גרעין התא כולו. שימו לב חזק 5hmC מכתים בפריפריה גרעיני תאי שזכתה. לוח p ו- x מייצגים 5mC הממוזג, 5hmC התמונה בעוד לוח q ו- y מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית תמונה p, x בהתאמה. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה של רוד קולט אור גרעינים של רשתית העכבר C57BL/6J ביום כמחנכת 90.
ההכתמה 5mC (אדום,) בחריפות נוכח chromocenter של גרעין התא, גם המתנה חלש באזורי הפריפריה גרעינית. פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק, d) באופן בלעדי מוגבל על e לוח הגרעין לפריפריה (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצג 5mC הממוזגים 5hmC תמונה תוך לוח h הוא הגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה שג גרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מתילציה DNA hydroxymethylation דינמי והפיך DNA השינויים אשר modulatethe מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים מתפתחת גם כמו תאים postmitotic בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי 5mC ו- 5hmC DNA השינויים בחיי עיר בטכניקת immunohistochemical (באמצעות נוגדנים anti-5mC ו- anti-5hmC) בסעיפים paraformaldehyde-קבוע קפוא של העכבר הרשתית, ולספק הנחיות ולשיפור המתקנות את התוצאות, במיוחד בעת השוואת מספר פרטים שונים. אנחנו קודם לכן השתמשו בשיטה זו על 5mC שינויים ברשתית עכבר עם הרשתית ספציפיים פילוח של Dnmt1, Dnmt3a , Dnmt3b DNA methyltransferase גנים, ודיווח דלדול (הצפויה) של סימני 5mC שלהם קרועות7 .

השלב הקריטי בזיהוי immunohistochemical 5mC הוא אופטימיזציה של טיפול סעיפים היסטולוגית עם HCl: פחות מ 15 דקות רעלני לא צפוי לייצר תוצאות לשחזור, ואילו טיפול מופרז עם HCl הורס את הגרעין ארכיטקטורה. מצאנו את התוצאה הטובה ביותר לאחר דגירה 30 דקות עם HCl. מומלץ תמיד להשתמש HCl טרי מדולל והפתרון PFA טרי 4% עבור קיבוע דנטורציה DNA רקמת רשתית.

כדי לפתור את התוצאות, אנו ממליצים לכלול שלושה או ארבעה ביולוגי משכפל תוך אופטימיזציה 5mC אות. בעוד כל אדם סט של נוגדן עשויה ליצור תוצאות שונות במקצת (אזורים heterochromatic בהיר יותר או פחות), אשר צפויה immunohistochemical בשיטה, 5mC, 5hmC הפצה גרעינית בתוך ערכת בודדים סעיפים צפוי להיות מאוד לשחזור, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.

טכניקה זו יש גם הגבלה בעקביות הבחנו השתנות בחלוקה 5mC ב גרעינים תא קולט אור בתוך אותו סעיף. . מצאנו כמה גרעינים הראה אות חזק 5mC תוך גרעין התא הסמוך הראה שום אות 5mC... זאת בשל הגבלה ב גם ההומניסטית והאוטונומית אנטיגן 5mC על ידי טיפול HCl בסעיפים קפוא.

המשמעות של טכניקה זו מאפשרת 5mC לוקליזציה ללא טיפול K DNase ו proteinase מובילים יותר לשימור chromocenters. טכניקה זו הוא צפוי לעבוד robustly על כל קטעי כל רקמות בעלי חוליות, 5mC נשיאה, סימני 5hmC, מעובד עם גישה דומה, לא רק העכבר הרשתית, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, Suppl . 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 138 עין פיגמנט האפיתל של העין רשתית תהליכים כימיים תהליכים ביוכימיים מתילציה DNA אנטומיה החישה התופעות והתהליכים תופעות כימיות 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine רשתית פיתוח אפיגנטיקה מתילציה DNA עכבר אימונוהיסטוכימיה כרומטין גרעין חומצה הידרוכלורית דנטורציה קולט אור
Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette,… More

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter