Summary
このレポートの目的は、エピジェネティックな遺伝子マーカーの堅牢な免疫組織化学的検出のためのプロトコルを記述するためです、5-メチルシトシン (5mC) および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の開発と後マウス網膜。
Abstract
網膜の開発のエピジェネティクス研究は、人間の網膜変性疾患の様々 なメカニズムについての理解の新しいレベルをもたらす、新しい処置のアプローチを特定することを約束よく研究分野です。マウス網膜の核のアーキテクチャは 2 つの異なるパターンで組織される: 従来と逆。従来のパターンはユニバーサル アクティブ ユークロマチンは核の内部に存在するとき、核の周囲に異質染色質はローカライズです。対照的に、反転の核パターンは大人棒光受容体細胞核原子力センターに局在する異質染色質、核の周辺部に存在するエピジェネティックに固有です。DNA のメチル化は、chromocenters で主に観察されます。DNA のメチル化は、多くの遺伝子のプロモーター領域で濃縮され CpG ジヌクレオチドのチトジンの残余 (5-メチルシトシン, 5mC) の動的共有結合修飾です。3 DNA メチル基転移酵素 (DNMT1、DNMT3A と DNMT3B) は、開発中に DNA のメチル化に参加します。免疫組織化学的手法で検出 5mC は、非常にチャレンジングな二本鎖 DNA の螺旋形内で非表示に変更 5mC 基地を含むすべての DNA 塩基として、結果の可変性への貢献です。ただし、開発中の 5mC 分布の詳細な描写は非常に有益ではありません。ここでは、5mC と別エピジェネティックな DNA マーカー 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の開発に「オープン」、転写活性状態のクロマチンと colocalizes が強力な免疫組織化学的検出のため再現性のある手法について述べると後マウス網膜。
Introduction
開発のエピジェネティック制御とマウス網膜の後の恒常性は、研究、retinogenesis と細胞の運命決定制御する生物学的メカニズムの新しい理解をもたらす約束する携帯型固有のエキサイティングな分野代謝機能と同様、細胞病理学、細胞死と再生1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13クロマチン開発だけでなく、変数の外部信号への応答のダイナミックな変化を経るは、ストレス、代謝や細胞死の刺激6,14,15, 。16,17,18. マウス核クロマチンがアクティブ ユークロマチンと非アクティブなヘテロクロマチン6,,1920に分割されています。間期核異質染色質線核周囲と核小体に対しユークロマチンは核の内部の地域で存在します。このパターンは従来と呼ばれる、真核生物で保存性が高い。対照的に、マウスやラットなど夜行性動物にロッド核が核がヘテロクロマチン ユークロマチン外側シェル6,18の形成に囲まれた中心部で占められているパターンを反転します。 20。出生時、ロッド核従来原子力建築があります。ロッド核の反転は、従来の核構造の改造によって開発中に発生します。この過程で、周辺ヘテロクロマチンを核の周辺部から分離、核6,18の形で、中心の単一の chromocenter に chromocenters が融合。
ゲノム DNA のメチル化は、ローカルのクロマチン構造21を制御するに参加しています。5' の位置に濃縮されている CpG ジヌクレオチドのチトジンの残余のマウスのゲノム22,23,24,25,26で多くの遺伝子のプロモーター領域 DNA のメチル化が発生します間だけでなく、規制要素27を運ぶイントロン領域。近位プロモーター21,24の CpG の島と遺伝子エンハンサー27,28の CpG 配列のメチル化は多くを含む二価のクロマチンの動態の調節に重要です発達の遺伝子/転写因子の開発、がん、老化29,30,31,32,33,34で重要な役割を果たして.3 DNA メチル基転移酵素 (種) は、マウス開発35中に DNA のメチル化に参加します。すべての 3 つの種はマウス網膜発生36とDnmt遺伝子影響を与える網膜開発2,7の網膜特異的変化の中に表されます。ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) は、5-メチルシトシン (5mC) メチルの酸化の製品です。3 10 11 転流 (テト) 酵素 5mC 脱メチル化37,38,39に参加します。ヒドロキシメチル C 変更は、プロモーター、遺伝子体間ゲノム遺伝子リッチと活発に転写される領域27,40内で濃縮されています。
様々 な細胞41,42,43,44,45,46で変化する DNA メチル化のパターンを決定するため記述されているアプローチは、それらのいくつかを有効にします。他のプロモーターやエンハンサー内の CpG の豊富な領域の正確な変化に焦点を当てながら DNA のメチル化のグローバルな変更を定量化します。検知・ 5hmC の定量化法のまた報告された47, 免疫組織化学13を含む.免疫組織化学的技術は、堅牢な開発の核における 5mC と 5hmC の変更の監視を有効にして後細胞がクロマチン動態その場の外部または内部の変化に対応した線で囲むため非常に有益セル4,13,48,49に影響を与えます。ただし、この方法は、DNA のメチル化と組織学的準備のシトシンの変更の検出に関連する技術的な問題のための hydroxymethylation 変化を過小評価しがちです。これは、非極性の DNA の基礎、5mC など 5hmC 変更シトシン、二本鎖 DNA ヘリックス50のセンター内で隠されているし、マスキングが必要があります。これは特に過酷な治療が適用されるときは、元の組織の有益な組織を失う可能性があります急速に冷凍の組織学的準備に挑戦。
マウス網膜は神経系の発達と後恒常性する DNA のメチル化の貢献を分析する優れたモデルです。6 種類のニューロンがのみ (桿体と錐体光受容細胞、アマクリン細胞、双極、水平および神経節の細胞)、タイプ 1 つのグリア細胞 (グリア ・ ミュラー)、1 つの上皮細胞内の細胞型 (網膜色素上皮)51。網膜細胞の種類は、DNA メチル化18,19, 最近単一ベース解像度1,5,9,12時勉強してきたの明確なパターンがあると報告されました。我々 は最近、網膜細胞とすべて 3 DNA メチル基転移酵素が条件付きターゲットによって削除された成体マウス網膜の核の変化の核内での分布の 5mC パターンを区切るために免疫組織化学アプリケーションを報告7. 検出特定クロマチンを有効に我々 のアプローチ、網膜細胞の DNA メチル化の有無は陽性としてだけ見なすことができるまたは病勢の負の信号細胞アポトーシスを受ける、レポートの数と比較して私たちといくつかのグループ報告し、前述の網膜細胞核内配置5,6,7,18,19,36,52ですここでは、私たちの元のレポート7 から再現することができました、のデータを示すと同様詳細冷凍パラホルムアルデヒド固定標本で 5mC と 5hmC を検出する免疫組織化学 (IHC) 手法について述べる。.
Protocol
子供の病院オークランド研究所動物ケア委員会によって承認され、の使用のためのビジョンと眼科 (ARVO) ステートメントで研究会に付着しプロトコルに従ってマウスとすべてのプロシージャを行った眼の動物の研究のビジョン。
1. 組織免疫染色に備えて
- 日 (E) 16、生後 (P) C57 BL/6 j マウスを安楽死させる 0、P15 と二酸化炭素 (CO2) 斬首 (E16 と P0 マウス) に続いて、P90。
- すぐに摘出マウスの目は目の背側 29 1/2 針で穴を開けます。4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 1 つの mL で 5 分 (分) リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS) pH 8.0 室温で孵化させなさい。
- P0、P15、P90 から目のカップに、角膜を分析し、上質眼科用ハサミでレンズの目が 4 %pfa。
注: スキップ E16 目目としてのこのステップが小さすぎます。 - 4% の目のカップ (P0、P15、P90) と全体の目 (E16) 修正 PFA 室温で 20 分間。1 mL の 1x PBS 室温で 10 分間に二度目のカップと全体の目を洗います。
- Cryoprotect 目カップし、全体 1xPBS、pH 8.0 含む 10% ショ糖 1 時間目します。20% のショ糖 1 × PBS で 1 時間を維持し、一晩 4 ° C で 1 × PBS で 30% ショ糖で飽和し、
- 次の日、目のカップや全体の目に最適な切削温度の化合物 (OCT) (500 μ L) cryomolds 埋め込む、スナップ-凍結ドライアイス/エタノールのお風呂で、-80 ° C で保存
- -80 ° C から埋め込まれた目のカップと全体の目で金型を削除、セクショニングの前に 1 時間-20 ° C に釣り合うように。
- -20 ° C でクライオスタットを用いた視神経乳頭を通じて temporonasal 軸に平行な網膜断面 (厚み 12 μ m) をカットします。
- 網膜のセクションを顕微鏡スライド53と-80 ° C でストアのマウントします。
2. 5 mC および 5 hmC の抗体で免疫染色
- 疎水性障壁のペンを使ってスライドに取付けた網膜のセクションを取り囲みます。疎水性障壁のペンには、組織を染色するために必要な抗体量が軽減されます。
- 10 分の 1 × PBS の 200 μ L で一度網膜のセクションを洗います。
- 0.1% の 200 μ L で網膜のセクションを permeabilize 1 × PBS (PBS-T) 室温で 10 分間でトリトン X-100。
- 37 ° C の定温器の 1x PBS で 2 N 塩酸 (HCl) をたて 200 μ L と 30 分のための網膜のセクションを変化させなさい。
注: 塩酸処理の注意の滴定は、5mC 信号を最適化するために必要です。 - 5mC 信号54を最適化しながら生物学的複製 (3-4) が常にあります。
注: 4 時点 (15 分、30 分、1 h、2 h) で抗原検索を行った、発見の 30 分インキュベーション 5mC 信号に最適です。HCl の長い孵化できない核に 5mC 信号をローカライズするに至る核の構造が低下します。 - 変性後、0.1 100 μ L を追加することによって網膜のセクションを中和する 10 分の網膜の部分に M トリス-HCl (pH 8.3)。
- 解決を妨げるの 500 μ L のセクションを孵化させなさい (0.1% の 5% 効果をもたなかったヤギ血清 1x PBS でトリトン X-100) 室温湿度の室内で 1 時間。
- ブロック後、追加対策-5mC;抗 5hmC 抗体は、網膜部分に解決を妨げるの 1: 500 希釈。
- 網膜のセクションが 4 ° c 湿度チャンバーで一晩インキュベートします。
- 次の日洗濯、網膜のセクション 3 度 (10-15 分毎回) 0.1% PBS T に対応する二次抗体の解決を妨げる、孵化させなさい、(ヤギ抗うさぎとヤギ抗マウス igg 抗体, 希釈; 1: 1000)、DAPI (4', 6-を含むdiamidino-2-phenylindole) ソリューション ソリューションをブロックで 1 時間室温 (1 μ g/mL)。
注: は、バイオアセッテイの段階ですべてのセクションの乾燥を避けるため。 - 1 ml の 0.1% の 3 つの時間スライドを洗う PBS.
- 最後の洗浄後、coverslip の下で水土台媒体セクションをマウントし、無色透明のマニキュアで封印します。
3. 共免疫組織化学
- 一貫性を保つのため (例えばを)、1 つの方法に常に直面している眼杯の網膜色素上皮側にセクションに合わせます。
- 3 X ズームまたは immunostained 網膜にあるセクションの 63 倍 (対物レンズの倍率) 2 X とイメージ キャプチャを実行します。
- 選択した各画像の複数の光学セクションを生成 (z-スタック) すべての 3 つのチャネル (赤、緑、青、RGB) に 0.35 μ m のステップを使用して。
注: 10 20 X で可視化試験片の最終倍率 (対物レンズの倍率) 63 X、それぞれされます、(通常使用する) 10 X 接眼レンズと組み合わせる。
5mC と 5hmC の信号を検索する圧縮された光学スタックを視覚化します。
Representative Results
後の網膜、網膜発生における 5-メチルシトシン (5mC)、(5hmC) の 5-ヒドロキシメチルシトシンの分布を決定する我々 immunostained c57bl/6 j マウス網膜セクション E16、P0、P15、P90 から特異抗体を 5mC と 5hmC に。
全体の細胞核 (図 1 a) で認められた弱い染色しながら E16 で 5mC 染色細胞核の chromocenters に強いあった。5hmC 染色は細胞核に限られ、欠席したから chromocenters (図 1 b)。
P0 網膜における 5mC 信号は細胞の核や核周囲 (図 2 a矢印、矢印) の chromocenters にローカライズされました。また、細胞核の chromocenters 間 5mC の弱い染色を見ました。5hmC 信号 chromocenters (図 2 b) を除いて細胞核に強く存在していた。5mC と内側神経層 (INBL) (図 2 c点線) の 5hmC より多くの核が染色がわかった
P15 網膜 5mC と核外層 (ONL)、内部の核層 (INL)、神経節細胞層 (GCL) (図 3) で 5hmC の強い染色を発見しました。ONL (杆) の 5mC の信号細胞核と核周辺 (図 3 a-3 c、3 g) の chromocenters に存在していた。5hmC 信号は、chromocenters (数字 3 d-3 f) を除く全細胞核で発見されました。P15 網膜、透過型電子顕微鏡 5mC 抗体信号 (図 3 hと3 i) と同様の棒細胞核ヘテロクロマチンのドメインの分布を示します。
INL と GCL の 5mC 染色は細胞核の chromocenters に強く、全体の細胞核 (数字 3j-3 lと3 r 3 t) でも観察された弱い染色します。5mC と対照をなして 5hmC 信号は INL と GCL (図 3 m 3oと3 u 3 w) で chromocenters を除いて全体の細胞核にローカライズされました。我々 は強力な観察 GCL 細胞核の周囲に 5hmC 信号。
大人の棒の光受容体の 5mC 信号は、5hmc 信号は核周辺 (図 4 d-4 階) に限られ、chromocenter および細胞核 (図 4 a-4 c) の核周囲に制限されました。
図 1。16 日 5-メチルシトシンとマウス網膜における 5-ヒドロキシメチルシトシンのローカリゼーション。
C57bl/6 j 網膜 5mC 抗体の免疫染色 (赤) と 5hmC (緑、b)。E16 では、5mC 信号は細胞核の chromocenters で非常に強いとはるかに低いレベルで全体の細胞核にも存在。5hmC 染色は細胞核にのみ限られていた。パネル c は、差し込み印刷の 5mC と 5hmC のイメージを表します。核は、DAPI (青、c) と counterstained です。インセットは、画像内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。5-メチルシトシンの 5-ヒドロキシメチルシトシン マウス網膜における生後 0 で染色。
C57bl/6 j 網膜 5mC 抗体との反応 (赤) と 5hmC (緑、b)。P0 網膜における 5mC と 5hmC、外側神経層 (ONBL) と内側の神経層 (INBL) の両方に存在。a) 5mC 信号が強く chromocenters (矢印) と核周辺の細胞核 (矢印)。5mC の弱い染色も細胞核の chromocenters の間に観察されます。b) 5hmC 染色は細胞核に限定されて、INBL (パネル c の点線) に強いシグナルが観察されます。パネル c は、差し込み印刷の 5mC と 5hmC のイメージを表します。核は、DAPI (青、c) と counterstained です。インセットは、画像内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。生後 15 日目のマウス網膜における 5-メチルシトシンと 5-ヒドロキシメチルシトシンの分布。
反 5mC と 5hmC 抗体 (g、j-y) を c57bl/6 j 網膜の免疫染色。外の核層 (ONL) (杆)、5mC 信号で (赤) 通常 (矢印 b) 細胞核の chromocenters と一致しても (矢印 b) 核周囲に局在します。パネル b (赤) と c (グレー) を表すイメージ内のアスタリスクで表示領域の拡大。5hmC 信号 (緑、d) は、chromocenters を除いて全体の細胞核に限定されます。パネル e (緑) と f (グレー) g を表す差し込み印刷の 5mC と 5hmC の画像イメージ d. パネル内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。核は、DAPI で counterstained です。H パネルは、ヘテロクロマチンのドメインの生後 15 示す分布を光受容体核の透過電子顕微鏡像。パネル h で黒い矢印が指す片ロッド視細胞の核パネル i. に拡大私は棒の光受容体の核内のヘテロクロマチンのドメインをポイント核周囲のヘテロクロマチンを赤い矢印でポイントし、パネルで赤矢印。INL (j q) と GCL 細胞核 (r y)、(赤) 5mC 信号は chromocenters の周囲に存在するローカライズし、弱い染色は細胞の核の残りの部分でまた検出されます。パネル k (赤) と私 (グレー) 画像 j にアスタリスクが付いた表示エリアの表示倍率を表しています。INL と GCL の細胞核の 5hmC 染色 (グリーン) は、細胞核に限定されます。強力な 5hmC の GCL 細胞の核周囲の汚損に注意してください。パネル p と x を表し差し込み印刷の 5mC と 5hmC の画像パネル q と y それぞれイメージ p と x にアスタリスクが付いた表示エリアの表示倍率。核は、DAPI で counterstained です。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。5-メチルシトシンと 5-ヒドロキシメチルシトシン ロッド視細胞の核の分布 c57bl/6 j マウス網膜生後 90 日目で。
5mC 染色 (赤、) が核の周囲の細胞核とも弱の現在の chromocenter で強く存在します。パネル b (赤) と c (グレー) を表すイメージ内のアスタリスクで表示領域の拡大。核周囲パネル e (緑) に専ら限られている 5hmC 染色 (緑、d) と f (グレー) 表す倍率 g を表す結合された 5mC と 5hmC パネル h 画像画像 d パネル内のアスタリスクが表示エリアの表示領域の拡大g. 核を DAPI (青) と counterstained がイメージにアスタリスクします。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
DNA メチル化と hydroxymethylation は、動的かつ可逆的 DNA 変更、後細胞と同様に、同様に開発の生物学的メカニズムの modulatethe 多様な範囲です。ここでは、マウス網膜のパラホルムアルデヒド固定凍結切片における免疫組織化学的手法 (抗 5mC, 抗 5hmC 抗体を使用) で 5mC と 5hmC DNA の変更その場で検出するため再現性のある手法について述べる提供改善し、いくつかの異なる標本を比較するときに特に、結果を標準化するためのガイドライン。我々 は以前網膜固有のターゲットでDnmt1、 Dnmt3aとDnmt3b DNA メチル基転移酵素遺伝子のマウス網膜における 5mC の変化を記述するこのメソッドを使用し、網膜7 の 5mC マークの (予想される) の枯渇を報告.
5mC 免疫組織化学的検出の重要なステップは、HCl で組織学的セクションの処理の最適化: HCl で過剰な治療は核破壊するのに対し、再現性のある結果に 15 分前処理は見込まれないよりも少ないアーキテクチャです。塩酸で 30 分インキュベート後最高の結果がわかった。DNA 変性および網膜組織固定用たて希釈 HCl、たて 4 %pfa ソリューションを常に使用するをお勧めします。
結果をトラブルシューティングするには、3 〜 4 5mC 信号を最適化しながら生物の複製を含めることお勧めします。個々 の設定中免疫組織化学染色が若干異なる結果を生成 (もっとまたはより少なく明るいヘテロクロマチン領域)、個々 のセット内で免疫組織化学的方法、5mC、5hmC 核分布の予想されます。セクションのプロトコルが続いている限り、非常に再現する予定です。
我々 は一貫して同じセクション内の光受容体細胞核の 5mC 分布の変動を観察するとこの手法も制限があります。隣接する細胞核は 5mC 信号を示した強い 5mC 信号を示したいくつかの核を発見しました。これは凍結切片における塩酸処理によるマスキング 5mC 抗原の検出の制限のためです。
この手法の重要性 chromocenters のより良い保全につながる DNase、プロテイナーゼ K 処理なし 5mC のローカライズが可能です。このテクニックは、脊椎動物の動物組織、運ぶ 5mC 5hmC マークから任意のセクションに確実に動作するように期待は、プロトコルが続く限りのマウス網膜だけでなく、同様の方法で処理します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品が支持された SBIR 補助金 (1R44EY027654 01A1)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| 29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
| Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
| PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
| Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
| 1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
| Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| 5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
| 5hmC | Active Motif | 39791 | |
| LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
| Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| Equipment | |||
| MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
| Confocal microscope | Zeiss |
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