Summary
Новая техника Реометрия сил зажим используется для изучения механических свойств образцов низким объемом гидрогеля на основе белков, привязал между двигателем катушка и датчик силы. Аналоговая система пропорционального интеграл производная (PID) позволяет «зажимной» силы опытных желаемого протокола.
Abstract
Здесь мы описываем метод Реометрия силы зажим для характеризовать биомеханические свойства гидрогели на основе белков. Этот метод использует систему (PID) аналоговый пропорциональный интеграл производная применять контролируемых силу протоколы на цилиндрических гидрогеля на основе белков образцы, которые привязаны между линейной-катушка мотор и преобразователь силы. Во время операции PID система регулирует расширение образца гидрогеля следовать предопределенных силу Протокола путем сведения к минимуму разницу между силами измеренных и заданное значение. Этот уникальный подход к гидрогели на основе белка позволяет привязывать образцов (< 5 мкл) чрезвычайно низким объемом гидрогеля с концентрациями различных белков. Под силу рампа протоколы, где приложенного напряжения увеличивается и уменьшается линейно со временем, эта система позволяет исследования эластичности и гистерезиса поведений, связанных с складные (ООН) белков и измерение стандартного эластичное и Вязкоупругие параметры. Под постоянной силы, где сила импульса имеет шаг образную форму, эластичные ответ, из-за изменений в силу, является отделенных от вязкоупругих ответ, который приходит из домена протеина разворачивается и складывая. Благодаря низким объемом выборки и универсальность в применении различных механические возмущения сил зажим Реометрия оптимизирована для исследования механических реакции белков под силу, с помощью массового подхода.
Introduction
Наряду с уникальными физическими свойствами, гидрогели на основе белков обещают революционные силы спектроскопии, позволяя измерения нескольких миллиардов молекул в одной «тянуть», таким образом позволяя исследование белков в переполненном средах, аналогичны тем, с которыми кожи и других тканей. Доменов протеина остаются сложенном внутри гидрогели, позволяя изучение их биомеханических ответ, чтобы заставить привязки партнеров и химических условий. Кроме того биомеханические ответ доменов протеина внутри гидрогели напоминает ответ, видели с методами спектроскопии одной молекулы силой. Например химическое denaturants и окисляющих агентов уменьшить стабильность сложенном состоянии, как в одного белка домена уровня1,2,3 , так и на макроскопическом уровне4,5 , 6 , 7. Аналогичным образом, osmolytes увеличить стабильность единого белки8,9, ведущих к снижению Вязкоупругий отклик гидрогели, за то же силу условий7,10.
Были осуществлены несколько подходов для синтеза белка на основе гидрогелей, либо с помощью физических взаимодействий11,12 или ковалентных сшивки4,13. Ковалентный реакции позволяют для фиксированных местах сшивки и эти гидрогели можно восстановить исходное состояние после удаления механическое или химическое возмущений. Успешный подход для ковалентной cross-linking опирается на формирование ковалентных углерод углеродных связей между аминокислотами подвергаются тирозина, используя Персульфат аммония (APS) в качестве окислителя и рутений (II) Соль как инициатор (рис. 1)14. Под воздействием белый свет решение концентрированных белков могут быть превращены в гидрогеля. Контролируя когда реакция начинается, белок APS смеси могут быть введены в любой форме литья, например политетрафторэтилена (PFTE) трубы (Рисунок 1B и 1 C), позволяя использовать объем чрезвычайно малые решения15. Кроме того использование белого света для инициирования реакции структурообразования приводит к ограниченным отбеливания флуоресцентных белков и позволяет разработку композитных гидрогели с флуоресцентные маркеры (рис. 1). Другие методы формирования на основе белков Гидрогель использовать сшивки, основанные на SpyTag-SpyCatcher Ковалентный взаимодействия16, Амин сшивки через глютаральдегид13или биотин стрептавидина взаимодействия17.
Динамический механический анализ (ДМА) методика в настоящее время широко используется для изучения на основе полимерных гидрогелей13,18. Хотя DMA может применять постоянной силой протоколы для биоматериалов, он требует модули Юнга над 10 кПа и большой образец объемы более чем 200 мкл19. Из-за этих ограничений гидрогели белка, как правило, слишком мягкий расследовать эту технику. Как инженерии полипротеины труднее синтезировать чем полимеров, так как они требуют живой системы для производства, такие большие объемы являются неэффективными, в лучшие4,15. Кроме того большинство биологических тканей мягче, чем 10 кПа. Для биологических проб, особенно в изучении эластичность мышц20,21были разработаны несколько подходов. Эти методы могут также работать под обратной связи для применения постоянной силой но оптимизированы для образцов с малого диаметра (в диапазоне микрон) подвергается силы за очень короткое время (обычно менее 1 s).
Белка на основе гидрогелей были успешно учился с модифицированных Реометрия методов. Например приведение Гидрогель в форме кольца позволяет использовать объемные Реометрия измерить изменения в опытных силу как функция расширения4,22. Другие подходы для Изучение реологических свойств гидрогели на основе белков используйте Реометрия контролируемого напряжения сдвига. Эти методы можно также достичь объема низких образца и терпеть мягкие материалы. Однако эти методы отсутствие способность имитировать потянув силы что причиной белка разворачивается в естественных условиях, и Юнга рассчитывается на основе сложных теорий, которые требуют различные предположения и исправления23.
Недавно мы сообщили новый подход, который использует небольшой объем белков, полимеризуется внутри трубок с диаметром < 1 мм. Наша первая реализация этого метода работает в режиме длина зажим, где гель был продлен после желаемого протокола15. В этом методе белки опыт непрерывного изменения в расширение и силы в то время как домены разворачиваться, делая толкованием данных громоздким. Недавно мы сообщили новую технику Реометрия сил зажим, где петля обратной связи можно подвергать низким белком гидрогели для предопределенных силу протокола7 (Рисунок 2). Аналоговая система PID сравнивает сил измеряется датчик силы с точкой набор, отправленных с компьютера и корректирует гелевое наращивание, перемещая звуковой катушки для сведения к минимуму разницу между двумя входами. Этот «зажима» сил теперь позволяет для новых типов экспериментов для измерения биомеханики гидрогели белка.
В режиме силы рампа привязанный белка гидрогеля испытывает постоянное увеличение и уменьшение силы со временем. PID компенсирует любые деформации вязкоупругих, изменив расширение нелинейных способом, в зависимости от типа разработки белков и гидрогеля. Главное преимущество силы рамп является, что она позволяет количественного определения стандартных параметров, таких как Юнга и диссипация энергии, благодаря разворачивается и складывая доменов протеина.
В режиме постоянной силы приложенной силы изменений в шаг как моды. В этом режиме гель расширяет и упруго контрактов, когда силы увеличивается или уменьшается, соответственно, следуют деформации зависят от времени. Этот вязкоупругих деформации, происходящих в то время как гель опыт постоянной силой, напрямую связана с домена разворачивается/складывая. В упрощенном виде это расширение можно рассматривать как эквивалент нескольких миллиардов следы одной молекулы вместе в среднем и измерены все сразу. Постоянной силы протоколы могут использоваться для изучения ползучести и релаксации гидрогели белка как функции времени и сил. Как функция силой, гидрогели на основе BSA белка мы недавно показали, что существует линейная зависимость между эластичное и вязкоупругих расширение и отдачи с прикладной штамм7.
Здесь мы подробно операции сил зажим Реометр с использованием композитного гели, сделанные из смеси белков Л (8 доменов24, изображается как L8) и белок L-eGFP конструкцию (L-eGFP), что делает общую гидрогеля, флуоресцентные и легко продемонстрировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. реагенты приготовления раствора
- Приготовляют раствор начиная белка путем растворения и разбавления протеина интереса к желаемой концентрации, используя буфер Tris [трис (гидроксиметил) aminomethane 20 мм и 150 мм NaCl, рН 7,4].
Примечание: Маленький концентрацию белка для которых сшивки приводит к гидрогели зависит от используемых белка и обычно > 1 мм. - Подготовьте запасы Персульфат аммония (APS) (1 М) и хлорид tris(bipyridine)ruthenium(II) ([Ru(bpy)3]2 +) (6.67 мм) решения путем растворения APS и [Ru(bpy)3]2 + порошков в трис-буфере.
2. белка на основе гидрогеля синтез
- Исправьте иглой 23 G на 1 мл шприц с нажатой поршень.
- Вырежьте 10 см из политетрафторэтилена (ПТФЭ) трубка (с внутренним диаметром 0,022 в и наружный диаметр 0,044 в) с помощью лезвия бритвы. Прикрепите игл и шприцев в один конец трубки PTFE.
- Вставьте второй конец трубки в растворе силана и заполнить трубы путем втягивания поршень шприца. Оставьте трубки для ~ 30 мин.
- Удаление решения силана и сухой трубку с сжатым воздухом.
Примечание: Убедитесь, что все решения силана высушивается и что без остатков остается в трубе. - Mix решение белка с APS и [Ru (bpy) 3]2 + в 1,5 мл трубки с использованием коэффициента постоянный объем [например, 15:1:1 или 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Вихрь фотоактивного решения до тех пор, пока он полностью смешивается.
- Центрифуга смеси на максимальной скорости (например, 14.000 x g) чтобы удалить любые пузыри из решения.
- Вставьте фотоактивного смесь открытый конец обрабатываемой штуцер и рисовать решение в трубу, втягивая поршень шприца.
- Поместите загруженные трубка ~ 10 см от 100 Вт ртутная лампа для предотвращения отопления и держать его там до 30 мин при комнатной температуре (рис. 1B).
Примечание: В некоторых случаях, время экспозиции к свету может быть как низко как 30 s. короче время гелеобразования используются здесь для флуоресцентных гели, для ограничения Фотообесцвечивание. - Снять трубку от иглы и сократить края трубки в конце гидрогеля с лезвием бритвы.
- Используйте притупляются 24 G иглы для выдавливания Гидрогель в раствор трис (рис. 1 c).
Примечание: Затупленными иглами используются для избежания любой вырезами или повреждения гидрогеля образца. - Осмотрите гели для каких-либо дефектов, которые могли бы форму во время экструзии или вследствие пузыри и отбросить гели с дефектами.
3. белка на основе гидрогеля привязанность и силы зажим Реометр Set-up
- Запустите программу управления инструментом. Включите мотор катушка. Задайте положение катушки значение к концу диапазона (например, 7,5 мм).
Примечание: Позиции катушка рекомендуется к концу максимальный диапазон движения, максимально возможное расширение гидрогеля. - Сместить крючки в z-направлении и выровнять их на повороте в x-направлении, (который тянет координат; см. рис. 2B). Запишите значения микрометра винтов для x-направлении.
- Нарезать нити одинаковой длины 2 стерильная швами (2-3 см; см. рис. 3а и B).
- Галстук свободные двойной зашитый узел в каждый из нитей и место 2 петли на крючке соединен датчик силы (рис. 3 c и 3D).
- Заполняют буфер Tris экспериментальной камеры и передачи гидрогеля образца в заполненных камеру с помощью медицинский пинцет.
- Поместите звуковой катушки и силу датчик крючки близко к поверхности раствора и совместите зацепы во всех направлениях, с использованием x/y/z-позиционирование манипуляторов.
- Использование медицинские пинцеты, повесить обе стороны образца белка гидрогеля на крючки, подключенных к голосу катушки и заставить датчик (рис. 3 c).
- Затянуть 1 шовные петлю вокруг гидрогеля образца на крючке катушки голоса путем проведения обоих концах петли швов с медицинской помощью пинцета и потянув их одновременно (рис. 3D).
- Повторите шаг 3,8 для цикла соединен датчик силы (рис. 3D).
Примечание: Избегайте экстремальных ужесточения швы для предотвращения любых структурных повреждений и поперечной резки гидрогеля образца. - Затяните шовные петли на виражах каждого крюк, чтобы не допустить любого проскальзывания; Используйте эти изгибы как ссылка указывает найти нулевой разделение между крючки на шаге 3.2. Вырежьте избыточное длин швов, используя ножницы медицинские (рис. 3D).
- Перемещение вложенного гидрогеля с использованием z-манипуляторов вдоль z-оси к экспериментальной камеры погрузиться Гидрогель в экспериментальной решения.
- Выровняйте образец Гидрогель в y-z с помощью манипуляторов, таким образом, что гель находится не под какого-либо стресса.
- Zero датчик силы и отделить два крючка с помощью x-микрометр этапы до тех пор, пока гель начинает испытывать силы. Когда это произойдет, слегка повернуть винт микрометра в x-направлении.
- Записать позицию обеих манипуляторов для двигателя катушки голоса и датчик и использовать разницу между этими значениями и те измеряется в шаге 3.2 вычислить точное разделение между привязывая крючки в начале эксперимента.
- Установите диапазон для кривой слабину ~1.5 - 2 мм и измерить гель слабину (рис. 4A).
Примечание: Для каждого измерения слабину, старайтесь начала режима слабину вблизи первоначальной голос катушки позиции, позволяющие оптимальное количество точек данных в соответствии с 2 режимами (рис. 4A). Длина гель может определяться с разрешением мкм, с помощью разделения между пересечения между 2 режимами в слабину и крючки кривой (см. также шаг 5.1). Как датчик силы может дрейф со временем из-за различий в экспериментальных условиях, частью слабину кривой, где гель находится не под силу доклады на этом возможного дрейфа. Программа, контролируя инструмент автоматически компенсирует эту разницу при отправке команды set точка PID петлю (рис. 4A врезные).
4. на основе белков характеристика гидрогеля с использованием контролируемых силой-рампа и постоянной силы измерения
-
Сил рампа эксперименты
- Выполнить цикл силы рампа, увеличивая силу на уровень требуемой нагрузки (например, 0,01 mN/s), ввод начальной и окончательной силы и продолжительность протокола как перелистывание «V». Затем удерживая геля на 0 mN (или низкой силы) для > 200 s позволить доменов протеина сворачивают и упругость Гель для восстановления.
- Сохраните трассировку.
-
Константа силы эксперименты
- Выполните постоянной силы Протокол путем применения силы с низкой (например, 0,1 млн) для 30 s и затем увеличивают силу к постоянной силой (например, 1 mN) за определенное количество времени (например, 120 s), а затем закалка силы обратно к тому же низкий значение (например, 0,1 МН) > 300 сек позволить доменов протеина сворачивают и упругость Гель для восстановления.
- После первого импульса, настроить параметры PID, чтобы максимизировать время ответа обратной связи цикла (см. Рисунок 2D).
Примечание: Для жесткой гели и небольшие изменения в силу, время отклика цикла ограничен электроники датчик силы и время отклика катушки и могут быть как низки как 5 мс7. Для мягкого гели и большие изменения в силе время отклика это продиктовано эластичность гидрогели (Рисунок 2D). - Сохраните трассировку.
5. анализ данных
- Используя измеренные разделение между крючки и рассчитанные катушки позицию, когда гель начинает испытывать силы (Δx в вставить Рисунок 4A ), вычислить гель длина L с помощью уравнения:
L = L0 + ∆x
Здесь L0 это разделение между крючки, измеренная от позиции микрометра винты до эксперимента (шаг 3.14).
Примечание: Для гелей с низким содержанием белка концентрациях, которые не приводят к полной сшивки, измеренной длины будет меняться от трассировки для трассировки. Кроме того более длительных периодов времени, белков внутри гидрогели могут возникнуть последствия старения25, которые приводят к общей удлинение геля. - Нормализовать измеренных расширение длина гель для получения штамма.
- Нормализовать измерений силы для поперечной площади поверхности, используя внутренний диаметр трубы, используемые для полимеризации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1A показана схема фотоактивного реакции, используется для синтеза гидрогеля8 Л/Л-EGP. Рисунок 1B показывает смесь Гидрогель в штуцер до и после photoactivation. Рисунок 1 c представляет экструдированные гидрогеля8 L-eGFP-L внутри трис решения. Гидрогель образец имеет не структурных дефектов, таких как вырезами. Гидрогели с ясно видимые повреждения должны быть отброшены.
Оказание собравшихся и разнесенные виды сил зажим Реометр представлены в рисунке 2A и 2B. Рисунок 2 c показана схема Реометр сил зажим, где гидрогеля образец привязал между крючки подключены к линейным звуковой катушки и датчик силы и погружается в буферном растворе. Аналоговой системы PID регулирует расширение гидрогеля, контролируя линейный звуковой катушки позиции следовать точку набор силы. 2D рисунок показывает настройки PID с использованием различных шагом для составной выгоды.
Рисунок 3 показывает типичный процесс образца гидрогеля. После привязывая гидрогеля между унифицированных крючки, петли швов затянуты вокруг гидрогеля рядом изгибы предотвратить соскальзывание образца и позволить для точного определения длины гидрогеля.
Сил рампа измерение и анализ гидрогели на основе белков:
Представитель измерения силы рампа протокола указаны в рисунке 4A - 4 C. Каждая новая тяга начинается с слабину измерения, как показано на рисунке 4A. Затем силы кривая получается путем применения Перевернутый протокол «V», как нагрузка увеличивается и уменьшается линейно со временем. Потом, гидрогеля проводится в силу 0 mN для 200 s, чтобы позволить доменов протеина внутри образца гидрогеля сворачивают (рис. 4B). Во время стресса PID система изменяет расширение гидрогеля, представленной позиции катушки следовать точке набор предопределенных силы. Для каждой кривой слабину мы вписываемся 2 линии (рис. 4 c). Синяя линия используется для режима первый когда гидрогеля откатов и оранжевая линия используется для режима когда гидрогеля становится слабину. Пересечение между двумя линиями используется для вычисления длины истинный гель с разрешением микрометра (рис. 4A). Потом расширение гидрогеля образца вычисляется путем вычитания первоначальный катушки позицию из трассировки положение катушки (рис. 4 d). 4F рисунок представляет кривую напряжение деформация. Напряжение рассчитывается путем деления усилие, площадь поперечного сечения образца гидрогеля и деформации рассчитывается путем деления расширение (Рисунок 4E), длина истинный гель, рассчитано исходя из слабину кривой как представленные в Рисунок 4A .
Константа сила измерение и анализ гидрогели на основе белков:
Представитель измерения постоянной силы протокола указаны в Рисунок 5A - 5 D. Постоянная сила 0,1 МН применяется к выборке Гидрогель для 30 s, силы затем меняется на 1 mN для 120 s и, наконец, сил является закаленном обратно до 0,1 млн 300 s чтобы позволить доменов протеина для сворачивают (Рисунок 5A). В течение первых 30 s при низкой силе, нет никаких заметных изменений в гелевое наращивание. При увеличении силы до 1 млн, гидрогеля показывает быстро эластичного расширения. После этого первоначального расширения гидрогеля продолжает расширение с течением времени, сохраняя при этом силы константа (1 мин). Потом сил закаленном обратно в начальное значение низкий (0,1 млн) и гидрогелевые восстанавливает ее первоначальной длины (Рисунок 5B). Расширение образца гидрогеля (рис. 5 c) и силы используются для вычисления штамм (вверху) и стресса (внизу) таким же образом, как и рамп измерения силы (рис. 5 d).
Рисунок 1: L-eGFP/(L)8-на основе синтеза гидрогеля. (A) Эта группа показывает схема синтеза L-eGFP/(L)8 белка гидрогеля с использованием photoactivated реакции. Белок смешивается с APS и [Ru(bpy)3]2 + и подвержены белый свет, который способствует формированию ковалентных связей между смежными тирозин аминокислоты (вставка). (B) Эта панель показывает L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +-, и APS-смесь загружается в штуцер с иглой 23 G перед воздействием белый свет (вверху) и после (внизу). (C) Эта панель показывает экструдированного L-eGFP/(L)8-на основе гидрогеля в растворе трис. Врезные показывает увеличенное изображение L-eGFP/(L)8-на основе гидрогеля. Диаметр распределения — 552 ± 8 мкм, по согласованию с внутренний диаметр PFTE трубы, используемые в процессе полимеризации (558 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: сила зажим Реометр дизайн и установка. (A) оказание Реометр гидрогеля собраны силы зажим. Врезные показывает образец гидрогеля на основе белок придает голос катушки и силу датчик крючки в камере решения. (B) оказание взорвался мнению силы зажим гидрогеля Реометр: (- c) x-y-z манипуляторов для корректировки звуковой катушки крюк позиции, мотор (d) линейный звуковой катушки, датчик (e) сил, (f) сил держатель датчика, (g) решения палаты, и (h - i) x-y манипуляторов для регулировки позиции датчика силы. (C) схема настройки Реометр гидрогеля сил зажим. Схема показывает образец белка на основе гидрогеля, придает датчик силы и катушка крючки с помощью медицинской швы. Аналоговая система PID изменяется длина гидрогеля, регулируя положение катушка следовать точку набор силы. (D) PID системы реагирования с использованием разных значений интеграл прибыль, (я) для достижения сил установить точку (пунктирная линия). Цветные следы представляют измерения силы (внизу) и напряжение (вверху), полученных от PID системы реагирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: L-eGFP/(L)8-на основе гидрогеля вложение процесса. (A) крупным планом посмотреть шовные петли, связаны с свободно двойной зашитый узел используется для придаем крючки гидрогеля образца. (B) два шва петли размещаются на крючок датчик силы, используется в приложении на основе белков гидрогеля. (C) L-eGFP/(L)8-пример на основе гидрогеля висит между крючки (указано стрелкой). (D) шов петли на стороне звуковой катушки (слева) и датчик силы крюк (справа) закручены вокруг гидрогеля образцов на изгиб каждой крюк, чтобы предотвратить соскальзывание во время измерения образца. Потом избыток Швы удаляются с помощью ножницы медицинские (обозначается красными стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель сил рампа измерения и данных анализа кривых для L-eGFP/(L)8-на основе гидрогеля образца. (A) типичный слабину измерения кривой (красный) используется для определения нулевой силой датчик силы и истинной длины гидрогеля. Два линейных кривых (синий и оранжевый линии) используются для обоих режимов: во-первых, когда гель находится под силу (синяя линия) и второй, когда гель становится слабину (плато - оранжевая линия). Пересечение между двумя линиями используется для вычисления длины истинный гидрогеля на нулевой силой. Стрелка показывает направление движения. Врезные показывает расположение нулевой силы и коррекция длины гидрогеля. (B) представитель сил рампа кривая прикладываемое к образцу гидрогеля. (C) след, представляющий позицию движения катушки как функция времени. Катушка начинается от начальной позиции, определенный в протоколе на шаге 3.1 (7,5 мм). (D) представитель кривой расширения гидрогеля образца как функцию от времени. Расширение рассчитывается как смещение между позицией измеренной катушки и его первоначальное положение. (E) представитель штамм -против-кривой времени. Напряжение рассчитывается путем деления расширение по длине истинный гель, рассчитывается от слабину измерения. (F) кривая представитель напряжение деформация образца гидрогеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: постоянной силы измерение и анализ данных. (A) представитель след постоянной силы протокола применительно к гидрогеля. Гидрогель подвергается 0,1 МН 30 s, то сила увеличивается до 1 млн для 120 s и, наконец, силы является закаленном обратно в 0,1 МН для 300 s. (B) Эта панель показывает катушки позиции трассировки против времени, представляющих изменения в длину h ydrogel образец после силу Протокол. (C) Эта группа показывает гелевое наращивание, измеренная от перемещения звуковой катушки. (D) представитель фигура стресса (внизу) и штамм следы (вверху) после анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем силы зажим Реометрия техника расследовать биомеханических ответ гидрогели на основе белков низким объемом. Кроме того протокол предоставляется синтезировать образец гидрогеля форма цилиндрическая низким объемом протеина. Протокол также представил, который описывает, как связать различные типы гидрогели на основе белков с различными эластичности без причинения каких-либо механической деформации или повреждение гидрогеля на основе белков образцы или проскальзывания геля на крючки. Аналоговые системы PID, а также линейный звуковой катушки и датчик силы, позволяют приложению контролировать силу протоколов, таких как силы пандус и постоянной силой. Недавно этот метод был использован для изучения биомеханических реакцию различных сшитого концентрации BSA-основе гидрогелей в различных экспериментальных решения7.
Важным аспектом при разработке и работе с белком гидрогели является воспроизводимость результатов измерений. Если гели сформулированы с концентрацией слишком низкий белка или неполной сшивки, во время расширения7появится постоянный пластических деформаций. Эти пластических деформаций резко ограничит интерпретации данных, как эффекты вязкоупругих будет поступать из домена разворачивается и молекулярной перестройки внутри гель. Простой тест, чтобы увидеть, если есть полный сшивки является погрузиться Гидрогель в химических denaturants, например, 6 M Гуанидиновые хлорид1. В этом случае не должно быть каких-либо эффектов вязкоупругих в стресс -против-штамм кривых, как все домены, разложенная химически, и молекулы теперь ведут себя как простые полимеров4,7,26. Кроме того гель следует восстановить первоначальный эластичность при погружении обратно в первоначальный буфер7.
Если есть различия в измеренная реакция между трассировками, полученные с разными гелями, некоторые аспекты должны рассматриваться для устранения неполадок: агрегации белков в растворе, не равномерного смешивания белка с cross-linking химических веществ, наличие пузырьков, связывание белка на основе гидрогеля на PFTE трубу из-за неправильного silanization. Остатки силан на стенках трубы могут загрязнить гидрогеля и привести к структурных дефектов. Чтобы избежать этой ошибки, больше сжатого воздуха необходимо обеспечить полное удаление силана из трубки. Кроме того пузыри могут образовываться в ходе всасывания гидрогеля фотоактивного смесь в штуцер. Эти пузыри может привести к образца повреждения и влияют на биомеханических ответ гидрогеля. Чтобы предотвратить любые формирования пузыря, конец трубки ПТФЭ должны находиться внутри раствор смеси во время процесса загрузки и поршень шприца должна быть втянута медленно. Другой типичной ошибкой является чрезмерно затянув шовные петли вокруг гидрогеля образцы во время процесса вложений, которые могут привести к формированию паз и резки гидрогеля. Движущихся спектр звуковой катушки ограничивает максимальное расширение образца прилагаемой гидрогеля. Это ограничение должно быть принято во внимание при измерении гели, которые расширяют несколько сотен процентов их первоначальной длины. Например чтобы расширить Гидрогель для более чем 200%, требуется первоначальный длина меньше чем 4 мм.
Гидрогели на основе белков являются уникальный класс биоматериалов вследствие их биосовместимости и высокой растяжимостью, производные от белков, их главное здание подразделения и присущие складной перехода, что характерно для белков. Кроме того эти гидрогели имеют отличный потенциал для тканевой инженерии, систем доставки наркотиков и биологических чернил (bioink) для 3D печати27. Гидрогель Реометр сил зажим может использоваться для расследования большое количество белков. Кроме того силы зажим Реометр позволяет приложению постоянной силы протоколов на образцах низким объемом гидрогеля. Эти эксперименты позволяют разделение поведение эластичное и вязкоупругих и изучения складной механики (ООН) в рамках массового подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы признаем финансовую поддержку от исследования роста инициативы (награда № 101 X 340), Национальный научный фонд, приборостроение программы крупных исследований (Грант № PHY-1626450), более Милуоки фонд (Shaw Award) и Университет штата Висконсин системы (прикладные исследования гранта).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
