Summary
Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.
Abstract
Aquí, describimos un método de espectrométricas de fuerza-abrazadera para caracterizar las propiedades biomecánicas de Hidrogeles basados en proteínas. Este método utiliza un análogo proporcional-integral-derivado (PID) sistema para aplicar protocolos de fuerza controlada en muestras cilíndricas hidrogel basado en proteína, que están ancladas entre un motor de bobina de voz lineal y un transductor de fuerza. Durante la operación, el sistema PID ajusta la extensión de la muestra de hidrogel para seguir un protocolo predefinido fuerza reduciendo al mínimo la diferencia entre las fuerzas medidas y punto. Este enfoque único de Hidrogeles basados en proteínas permite el tethering de hidrogel de muy bajo volumen de muestras (< 5 μl) con concentraciones diferentes de proteínas. Bajo protocolos de la rampa de la fuerza, donde la tensión aplicada aumenta y disminuye linealmente con el tiempo, el sistema permite el estudio de las elasticidad e histéresis comportamientos asociados con el (des) plegamiento de las proteínas y la medida del elástico estándar y parámetros de la viscoelástica. Bajo fuerza constante, donde el pulso de fuerza tiene una forma escalonada, la respuesta elástica, debido al cambio en la fuerza, está desconectada de la respuesta viscoelástica, que proviene del dominio de la proteína despliegue y refolding. Debido a su bajo volumen de muestra y versatilidad en la aplicación de varias perturbaciones mecánicas, fuerza-abrazadera espectrométricas está optimizado para investigar la respuesta mecánica de proteínas bajo fuerza usando un acercamiento a granel.
Introduction
Además de tener características físicas únicas, Hidrogeles basados en proteína mantenga la promesa de revolucionar la espectroscopia de fuerza por lo que permite la medición de varios mil millones moléculas en un 'jale', permitiendo el estudio de proteínas en ambientes de hacinamiento, similares a los encontrados en la piel y otros tejidos. Dominios de la proteína siendo doblados dentro de hidrogeles, que permite el estudio de la respuesta biomecánica a la fuerza, enlace de socios y condiciones químicas. Además, la respuesta biomecánica de los dominios de la proteína dentro de los hidrogeles se asemeja a la respuesta considerada técnicas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula. Por ejemplo, desnaturalizantes químicos y agentes oxidantes disminuyen la estabilidad del estado doblado, a la única proteína dominio nivel1,2,3 y en el nivel macroscópico4,5 , 6 , 7. Asimismo, osmolitos aumentan la estabilidad de las proteínas solo8,9, llevando a una disminución de la respuesta viscoelástica de hidrogeles, para la misma fuerza condiciones7,10.
Varios acercamientos se han aplicado para sintetizar Hidrogeles basados en proteínas, ya sea mediante interacciones físicas11,12 o covalentes entrecruzamiento4,13. Reacciones covalentes permiten lugares fijos del cross-linking y estos hidrogeles pueden recuperar el estado inicial a un retiro de las perturbaciones mecánicas o químicas. Un método exitoso para reticulación covalente se basa en formar enlaces covalentes carbono-carbono entre aminoácidos tirosina expuestas con persulfato de amonio (APS) como un oxidante y una sal de rutenio (II) como un iniciador (figura 1)14. Con la exposición a luz blanca, una solución de proteínas concentradas puede transformarse en un hidrogel. Mediante el control cuando la reacción se inicia, la mezcla de proteína-APS se puede inyectar en cualquier forma de fundición, como el politetrafluoroetileno (PTFE) tubos (figura 1B y 1C), permitiendo el uso de una solución extremadamente pequeño volumen15. Además, el uso de luz blanca para desencadenar la reacción de entrecruzamiento produce un blanqueamiento limitada de proteínas fluorescentes y permite la formulación de compuestos hidrogeles con marcadores fluorescentes (figura 1). Otros métodos de formación del hidrogel basado en proteína utilizan Cross-linking basada en la interacción covalente de SpyCatcher SpyTag16, Amina Cross-linking via glutaraldehído13o biotina-estreptavidina interacciones17.
Análisis mecánico dinámico (DMA) es actualmente una técnica ampliamente utilizada para estudios basados en polímeros hidrogeles13,18. Mientras que el DMA puede aplicar protocolos de fuerza constante con biomateriales, requiere módulos de Young sobre 10 kPa, muestra grandes volúmenes y de más de 200 μL19. Debido a estas limitaciones, hidrogeles de proteína generalmente son demasiado blandos ser investigados por esta técnica. Como ingeniería poliproteínas son más difíciles de sintetizar que polímeros, puesto que necesitan un sistema de vida para producir, tales altos volúmenes son ineficientes, en el mejor de4,15. Además, la mayoría de los tejidos biológica es más suave que 10 kPa. Varios métodos fueron desarrollados para muestras biológicas, especialmente en el estudio del músculo elasticidad20,21. Estas técnicas también puede funcionar bajo regeneración al aplicar una fuerza constante pero se optimizan para las muestras con diámetros pequeños (en el rango de micrones) expuestos a la fuerza de muy corto tiempo (normalmente menos de 1 s).
Los hidrogeles basados en proteína con éxito fueron estudiados con técnicas espectrométricas modificado. Por ejemplo, el hidrogel del bastidor en forma de anillo permite el uso de extensional espectrométricas para medir el cambio en la fuerza de la experiencia en función de la extensión4,22. Otros enfoques para el estudio de las propiedades reológicas de Hidrogeles basados en proteína utilizan espectrométricas controlados de tensión de esquileo. Estas técnicas también pueden alcanzar volumen de muestra bajo y tolerar materiales blandos. Sin embargo, estos métodos falta la capacidad para imitar la tracción fuerza causa la proteína despliegue en vivo, y módulo de Young se calcula en base a teorías complejas que requieren varios supuestos y correcciones23.
Nos han informado recientemente de un nuevo enfoque que utiliza una pequeña cantidad de proteínas, polimerizada dentro de tubos con diámetros < 1 mm. Nuestra primera aplicación de esta técnica fue funcionando en modo de pinza de longitud, donde se extendió el gel siguiendo el protocolo deseado15. En este método, las proteínas experimentan un cambio continuo en la extensión y fuerza mientras que revelan los dominios, haciendo complicado la interpretación de los datos. Recientemente, nos hemos informado de una nueva técnica fuerza abrazadera espectrométricas, donde un lazo de regeneración puede exponer hidrogeles de proteína de bajo volumen a una fuerza predefinida protocolo7 (figura 2). Un sistema PID analógico compara la fuerza medida por el sensor de fuerza con el set point en el ordenador y la extensión de gel ajusta moviendo la bobina para reducir al mínimo la diferencia entre las dos entradas. Esta sujeción de la fuerza permite nuevos tipos de experimentos para medir la biomecánica de hidrogeles de proteína.
En el modo de rampa de la fuerza, un hidrogel de proteína atada experimenta un constante aumento y disminución de la fuerza con el tiempo. El PID compensa las deformaciones viscoelásticas cambiando la extensión de una manera no lineal, dependiendo del tipo de formulación de proteína y de hidrogel. La principal ventaja de la rampa de la fuerza es la que permite la cuantificación de parámetros estándar, como módulo de Young y disipación de energía, debido a un unfolding y refolding de dominios de la proteína.
En el modo de fuerza constante, la fuerza aplicada cambia de manera escalonada. En este modo, el gel se extiende y contratos elásticamente cuando la fuerza es aumentar o disminuir, respectivamente, seguido de una deformación dependiente del tiempo. Esta deformación viscoelástica, llevando a cabo mientras el gel experimenta una fuerza constante está directamente relacionada con dominio desplegado/refolding. De forma simplificada, esta extensión puede verse como el equivalente de varios rastros de sola molécula millones como promedio y mide a la vez. Protocolos de constante de fuerza pueden utilizarse para estudiar la fluencia y relajación de hidrogeles de proteína en función de la fuerza y el tiempo. En función de la fuerza, para hidrogeles de proteína BSA, hemos demostrado recientemente que existe una dependencia lineal entre la extensión elástica y viscoelástica y retroceso con la tensión aplicada7.
Aquí detallamos el funcionamiento de un reómetro de fuerza-abrazadera utilizando geles compuestos de una mezcla de proteína L (8 dominios24, representado como L8) y una construcción de la proteína L-eGFP (L-eGFP), que hace el general hidrogel fluorescente y fáciles de demostrar.
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Protocol
1. reactivos solución preparación
- Preparar una solución de proteína a partir de disolución/dilución de la proteína de interés para la concentración deseada, usando un tampón de Tris [20 mM tris (hidroximetil) aminometano y 150 mM NaCl, pH 7.4].
Nota: La concentración de proteína más pequeña para que conduce Cross-linking de los hidrogeles depende de la proteína utilizada y suele ser > 1 mM. - Preparar acciones de persulfato de amonio (APS) (1 M) y cloruro de tris(bipyridine)ruthenium(II) ([bpy3]2 +) soluciones (6,67 mM) disolviendo APS y [bpy3]2 + polvos en el tampón de Tris.
2. a base de proteínas síntesis de hidrogel
- Fijar una aguja de 23 G en una jeringa de 1 mL con un émbolo presionado.
- Cortar un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) de 10 cm (con un diámetro interno de 0.022 en y un diámetro exterior de 0.044 en) usando una cuchilla de afeitar. Coloque la aguja y la jeringa en un extremo del tubo PTFE.
- Inserte el segundo extremo del tubo en una solución de silano y llenar el tubo por retraer el émbolo de la jeringa. Dejar el tubo durante 30 minutos.
- Retirar la solución de silano y seque el tubo con aire comprimido.
Nota: Asegúrese de que todos los de la solución de silano se seca y ningún residuo en el tubo. - Mezclar la solución de proteína con APS y [Ru (bpy) 3]2 + en un tubo de 1,5 mL usando una proporción de volumen constante [p. ej., 15:1:1 o 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Vórtice la solución fotoactivas hasta que se mezcle completamente.
- Centrifugar la mezcla a velocidad máxima (p. ej., 14.000 x g) para quitar las burbujas de la solución.
- Inserte el extremo abierto del tubo PTFE tratado en la mezcla fotoactivas y dibujan la solución en el tubo por retraer el émbolo de la jeringa.
- Coloque el tubo cargado ~ 10 cm de distancia una lámpara de mercurio de 100 W para evitar calentamiento y mantenerlo allí hasta 30 min a temperatura ambiente (figura 1B).
Nota: En algunos casos, el tiempo de exposición a la luz puede ser tan bajo como 30 s. tiempos más cortos de congelación se utilizan aquí para geles fluorescentes, para limitar el fotoblanqueo. - Retire el tubo de la aguja y corte los bordes del tubo cerca de los extremos de hidrogel con una cuchilla de afeitar.
- Utilice una aguja 24 G romas para sacar el hidrogel en la solución de Tris (figura 1).
Nota: Se usan agujas romas para evitar cualquier muescas o daño a la muestra de hidrogel. - Inspeccione visualmente los geles defectuosos que pueden formar durante la extrusión o debido a las burbujas y deseche los geles con defectos.
3. proteína a base de hidrogel accesorio y fuerza-abrazadera reómetro configuración
- Inicie el programa de control del instrumento. Encienda el motor de bobina de voz. Ajuste la posición de la bobina en un valor hacia el final de la gama (p. ej., 7,5 mm).
Nota: Se recomienda la posición de la bobina de voz que hacia el final del rango de movimiento máximo, para maximizar la posible extensión de la hidrogel. - Desplazar los ganchos en el z-dirección y alinearlos en la curva en x-dirección (que es la coordenada tracción; ve figura 2B). Registrar los valores de las tuercas de medición para la x-dirección.
- 2 Suturas estériles cortar hebras de igual longitud (2-3 cm; Ver Figura 3A y B).
- Ate un nudo suelto doble en cada uno de los hilos y colocar los 2 bucles en el gancho conectado al sensor de fuerza (figura 3 y 3D).
- Llene la cámara experimental con tampón Tris y transferir la muestra de hidrogel en la cámara de llenado utilizando pinzas médicas.
- Coloque la bobina de voz y fuerza ganchos sensor cerca de la superficie de la solución y alinee los ganchos en todas las direcciones usando el x/y/z-posicionamiento manipuladores.
- Uso de pinzas médicas, ambos lados de la muestra de proteína hidrogel en los ganchos conectados a la voz de la bobina y sensor (figura 3) la fuerza de la caída.
- Ajuste 1 lazo de sutura alrededor de la muestra de hidrogel en el gancho de la bobina de voz sosteniendo ambos extremos del lazo de sutura con las pinzas médicas y tirando de ellos simultáneamente (figura 3D).
- Repita el paso 3.8 para el bucle conectado al sensor de fuerza (figura 3D).
Nota: Evitar un endurecimiento extremo de las suturas para evitar cualquier daño estructural y corte transversal de la muestra de hidrogel. - Apretar los lazos de la sutura de las curvas de cada gancho para evitar cualquier desliz; uso puntos de estas curvas como referencia para encontrar el cero de separación entre los ganchos en el paso 3.2. Corte la longitud excesiva de las suturas con tijeras médicas (figura 3D).
- Mover el hidrogel adjunto usando z-manipuladores a lo largo de z-eje hacia la cámara experimental para sumergir el hidrogel en la solución experimental.
- Alinee la muestra de hidrogel en y-z con los manipuladores que el gel no está bajo presión.
- Cero el sensor de fuerza y separar los dos ganchos usando el x-micrómetro etapas hasta que el gel comience a fuerza de experiencia. Una vez que esto sucede, gire ligeramente hacia atrás el tornillo micrométrico en x-dirección.
- Registrar la posición de ambos manipuladores para el sensor y el motor de bobina de voz y utilizar la diferencia entre estos valores y los medidos en el paso 3.2 para calcular la separación exacta entre los ganchos tethering al inicio del experimento.
- Establecer el intervalo de la curva de parafina a ~1.5 - 2 mm y medir la holgura de gel (Figura 4A).
Nota: Para cada medida de la holgura, intente mantener el inicio del régimen de parafina junto a la posición de la bobina de voz inicial, permitiendo un número óptimo de puntos de datos para los 2 regímenes (Figura 4A). La longitud del gel puede ser determinada con una resolución de micras utilizando la separación entre los ganchos y la intersección entre los 2 regímenes de la holgura de la curva (véase también paso 5.1). Como el sensor de fuerza podría derivar con el tiempo debido a las variaciones en las condiciones experimentales, la parte de la curva de holgura que el gel no es bajo fuerza informes sobre esta posible deriva. El programa controla el instrumento compensa automáticamente esta diferencia al enviar el comando de punto de ajuste para el lazo de PID (recuadro de laFigura 4A ).
4. basados en proteína hidrogel caracterización mediante rampa de fuerza controlados y las medidas de fuerza constante
-
Experimentos de fuerza-rampa
- Para realizar un ciclo de fuerza-rampa incrementando la fuerza en la velocidad de carga deseada (p. ej., manganeso 0.01/s), entrada de las fuerzas de partida y finales y la duración del Protocolo como una "V" volteada. Mantenga el gel en 0 mN (o fuerza de baja) para s > 200 permitir que los dominios de la proteína para replegar y la elasticidad del gel para recuperar.
- Guardar el rastro.
-
Experimentos de fuerza constante
- Realizar un protocolo de fuerza constante aplicando una fuerza de baja (por ejemplo, 0.1 mN) para 30 s y entonces aumentar la fuerza a una fuerza constante (por ejemplo, 1 mN) para una cantidad definida de tiempo (por ejemplo, 120 s), seguido de Temple bajo la fuerza a la misma valor (por ejemplo, 0.1 mN) > 300 s permitir que los dominios de la proteína para replegar y la elasticidad del gel para recuperar.
- Tras el primer pulso, ajustar los parámetros del PID para maximizar el tiempo de respuesta de la retroalimentación del lazo (ver Figura 2D).
Nota: Para geles rígidos y pequeños cambios en la fuerza, el tiempo de respuesta del lazo está limitado por la electrónica del sensor de fuerza y el tiempo de respuesta de la bobina y puede ser tan bajo como 5 ms7. Para geles más suaves y grandes cambios en la fuerza, el tiempo de respuesta es dictado por la elasticidad de los hidrogeles (Figura 2D). - Guardar el rastro.
5. Análisis de datos
- Utilizando la separación medida entre los ganchos y la posición de la bobina calculada, cuando el gel comienza a experimentar la fuerza (Δx en el prospecto Figura 4A ), calcular la longitud del gel L utilizando la ecuación:
L = L0 + ∆x
Aquí, L0 es la separación entre los ganchos, medido desde la posición de los tornillos del micrómetro antes del experimento (paso 3.14).
Nota: Para los geles con concentraciones bajas en proteína que no resultan en una reticulación completa, la longitud medida cambiará de rastro del rastro. También, durante largos períodos de tiempo, las proteínas dentro de los hidrogeles pueden sufrir envejecimiento efectos25, que dan lugar a un alargamiento general del gel. - Normalizar la extensión medida a la longitud del gel para obtener la cepa.
- Normalizar la fuerza medida de la superficie transversal utilizando el diámetro interno del tubo utilizado para la polimerización.
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Representative Results
Figura 1A se muestra el esquema de la reacción fotoactivos utilizada para sintetizar el hidrogel de8 L-EGP/L. Figura 1B muestra la mezcla de hidrogel en el tubo PTFE antes y después de la fotoactivación. Figura 1 presenta el extruido L-eGFP-L8 hidrogel dentro de una solución de Tris. La muestra de hidrogel tiene ningunos defectos estructurales tales como muescas. Hidrogeles con daño visible deben ser desechados.
La rendición de los reunidos y despiece del reómetro para pinza de fuerza se presentan en la figura 2A y 2B. Figura 2 muestra el esquema del reómetro pinza de fuerza, donde la muestra de hidrogel es atada entre los ganchos conectados a la bobina de voz lineal y el sensor de fuerza y sumergido en una solución tampón. El sistema analógico PID ajusta la extensión hidrogel controlando la posición de la bobina de voz lineal para seguir el punto de ajuste de fuerza. Figura 2D muestra la afinación del PID usando varios incrementos de la ganancia integral.
La figura 3 muestra un proceso típico accesorio de una muestra de hidrogel. Después de atar el hidrogel entre los ganchos alineados, los lazos de sutura están apretados alrededor de hidrogel cerca de las curvas para evitar que la muestra resbale y para permitir la determinación precisa de la longitud de hidrogel.
Fuerza-rampa medición y análisis de Hidrogeles basados en proteína:
Medidas representativas del protocolo vigor-rampa se muestran en la Figura 4A - 4C. Cada nueva extracción comienza con una medición de la holgura, como se muestra en la Figura 4A. Entonces, la curva de fuerza se obtiene mediante la aplicación de un protocolo de "V" invertido como la carga aumenta y disminuye linealmente con el tiempo. Después, el hidrogel se lleva a cabo en una fuerza mN 0 200 s, para permitir que los dominios de la proteína dentro de la muestra de hidrogel para doblar (Figura 4B). Durante el estrés, el sistema PID modifica la extensión de hidrogel representada por la posición de la bobina hacia el punto de ajuste de fuerza predefinido. Para cada curva flojo, encajamos 2 líneas (figura 4). La línea azul se utiliza para ajustar el régimen de primera cuando los retrocesos de hidrogel y la línea naranja se utiliza para ajustar el régimen cuando el hidrogel se vuelve flojo. La intersección entre las dos líneas se utiliza para calcular la longitud del gel verdadero con una resolución del micrómetro (Figura 4A). Después, la extensión de la muestra de hidrogel se calcula restando la posición inicial de la bobina del rastro de la posición de la bobina (figura 4). Figura 4F presenta la curva del stress-strain. La tensión se calcula dividiendo la fuerza aplicada por el área transversal de la muestra de hidrogel y la tensión se calcula dividiendo la extensión (figura 4E) por la longitud de cierto gel calculada a partir de la curva de parafina que se presenta en Figura 4A .
Constante de fuerza de medición y análisis de Hidrogeles basados en proteína:
Se muestran mediciones representativas de un protocolo de fuerza constante en figura 5A - 5D. Se aplica una fuerza constante de 0,1 mN a la muestra de hidrogel durante 30 s, la fuerza entonces se cambia a 1 mN para 120 s y, finalmente, la fuerza se apaga a 0.1 mN 300 s para permitir que los dominios de la proteína para doblar (figura 5A). Durante los primeros 30 s en bajo de la fuerza, no hay ningún cambio notable en la extensión de gel. Al aumentar la fuerza de 1 mN, el hidrogel muestra una extensión rápida elástica. Después de esta extensión inicial, el hidrogel sigue ampliando con el tiempo, manteniendo la fuerza constante (1 mN). Después, la fuerza se apaga hacia el bajo valor inicial (0.1 mN) y el hidrogel recupera su longitud inicial (figura 5B). La extensión de la muestra de hidrogel (figura 5) y la fuerza se utilizan para calcular la tensión (superior) y el estrés (parte inferior) en una manera similar como en las medidas de la rampa de fuerza (figura 5).
Figura 1: L-eGFP/(L)8-base de hidrogel síntesis. (A) este panel muestra los esquemas de un L-eGFP/(L)8 hidrogel la síntesis de proteínas mediante una reacción fotoactiva. La proteína se mezcla con APS y [bpy3]2 + y expuesta a la luz blanca, que promueve la formación de enlaces covalentes entre aminoácidos adyacentes de la tirosina (recuadro). (B) Este panel muestra un L-eGFP/(L)8-, [bpy3]2 +-, y cargado de APS-mezcla en un tubo PTFE con una aguja de 23 G antes de la exposición a la luz blanca (arriba) y después (abajo). (C) Este panel muestra una extrusión de L-eGFP/(L)8-base de hidrogel en una solución de Tris. El recuadro muestra una imagen magnificada de un L-eGFP/(L)8-base de hidrogel. La distribución diamétrica es 552 ± 8 μm, de acuerdo con el diámetro interior del tubo de PTFE durante la polimerización (558 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pinza de fuerza reómetro diseño y configuración. (A) representación del reómetro para hidrogel pinza de fuerza armada. Se muestra en el recuadro una muestra de hidrogel basado en proteína unida a la voz de la bobina y fuerza sensor ganchos dentro del compartimiento de la solución. (B) representación de la vista del reómetro de hidrogel pinza de fuerza: (a - c) los manipuladores dez x-y- para ajustar la bobina de voz gancho posición, (d) la bobina lineal motor, transductor (e) la fuerza, (f) la fuerza soporte de transductor, cámara (g) la solución, y (h - i) el x- manipuladoresy para ajustar la posición del transductor de fuerza. (C) esquema de la configuración de reómetro de hidrogel pinza de fuerza. El esquema muestra un hidrogel basado en proteína conectado a un sensor de fuerza y bobina de voz de ganchos usando suturas médicas. El sistema PID analógico cambia la longitud de hidrogel ajustando la posición de la bobina de voz para seguir el punto de ajuste de fuerza. Respuesta del sistema (D) PID usando diferentes valores de la ganancia integral () para alcanzar la fuerza establece punto (línea discontinua). Los rastros de color representan la fuerza medida (parte inferior) y tensión (superior) deriva de la respuesta del sistema PID. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: L-eGFP/(L)8-basado en el proceso de fijación de hidrogel. Ve el primer plano (A) de un lazo de sutura, atado con un nudo flojo doble utilizado para fijar la muestra de hidrogel a los ganchos. (B) los dos bucles de sutura se colocan en el gancho de sensor de fuerza utilizado en el accesorio de hidrogel basado en proteína. (C) un L-eGFP/(L)8-hidrogel basado en muestra se cuelga entre los ganchos (indicados por las flechas). (D) lazos de la sutura en el lado de la bobina de voz (izquierda) y el gancho del sensor de fuerza (derecha) estén bien apretados alrededor de la muestra de hidrogel en la curva de cada gancho para evitar que la muestra se deslice durante la medición. Después, las suturas exceso se recortan con tijeras médicas (indicados por las flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante fuerza-rampa medida y datos de análisis curvas para un L-eGFP/(L)8-base de muestra de hidrogel. (A) curva de medición flojo típico (rojo) para determinar la fuerza de cero del sensor de fuerza y la longitud verdadera del hidrogel. Dos curvas lineales (el azul y las líneas naranja) se utilizan para ambos regímenes: primero, cuando el gel esté en vigor (línea azul) y segundo, cuando el gel se convierte en slack (línea de la meseta - naranja). La intersección entre las dos líneas se utiliza para calcular la longitud verdadera del hidrogel en cero de la fuerza. La flecha indica la dirección del movimiento. El recuadro muestra la ubicación de la fuerza de cero y la corrección de la longitud de hidrogel. (B) curva de fuerza representativa-rampa aplicada a la muestra de hidrogel. (C) traza que representa el movimiento de posición de la bobina en función del tiempo. La bobina se inicia desde la posición inicial definida en el protocolo en el paso 3.1 (7,5 mm). (D) curva representativa de la extensión de la muestra de hidrogel en función del tiempo. La extensión se calcula como el desplazamiento entre la posición de la bobina medida y su posición inicial. (E) representante cepa -contra-curva de tiempo. La tensión se calcula dividiendo la extensión por la longitud de cierto gel calculada a partir de la medición de la holgura. (F) curva tensión-deformación representativas de una muestra de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: fuerza de constante medición y análisis de datos. (A) representante rastro del Protocolo de la fuerza constante aplicado a un hidrogel. El hidrogel está expuesta a 0,1 mN por 30 s, entonces la fuerza se incrementa a 1 mN para 120 s y, finalmente, la fuerza se apaga a 0.1 mN para 300 s. (B) este panel muestra una bobina posición traza versus el tiempo que representa el cambio en la longitud de la h muestra de ydrogel siguiendo el protocolo de la fuerza. (C) este panel muestra la extensión de gel medida por el desplazamiento de la bobina de voz. (D) figura representativa de estrés (parte inferior) y rastros de la cepa (arriba) después del análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos una técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera para investigar la respuesta biomecánica de Hidrogeles basados en proteína de bajo volumen. Además, se proporciona un protocolo para sintetizar una muestra de hidrogel de proteína de bajo volumen cilíndrico uniforme. También se presenta un protocolo que describe cómo hacer diferentes tipos de Hidrogeles basados en proteína con diferentes elasticidades sin causar daño a las muestras de hidrogel basado en proteína o deslizamiento del gel ni deformación mecánica en los ganchos. El sistema PID analógico, junto con la bobina de voz lineal y el sensor de fuerza, permiten la aplicación de protocolos de fuerza controlado como rampa de fuerza y fuerza constante. Recientemente, esta técnica se ha utilizado para estudiar la respuesta biomecánica de diferentes concentraciones reticuladas de Hidrogeles basados en BSA en diferentes soluciones experimental7.
Un aspecto importante al formular y trabajar con hidrogeles de proteína es la reproducibilidad de las mediciones. Si geles se formulan con una concentración demasiado baja en proteínas o Cross-linking incompletos, deformaciones plásticas permanentes que aparece durante la extensión7. Estas deformaciones plásticas limitaría drásticamente la interpretación de datos, como los efectos viscoelásticos provendría el desarrollo del dominio y el cambio molecular en el gel. Una prueba fácil para ver si hay completa Cross-linking es sumergir el hidrogel en químicos desnaturalizantes, como el cloruro de guanidinio 6 M1. En este caso, no debe haber ningún efecto viscoelástico en el estrés -versus-tensión curvas, ya que todos los dominios desdoblados químicamente, las moléculas se comportan ahora como simples polímeros4,7,26. Además, el gel debe recuperar su elasticidad inicial cuando inmerso en el buffer inicial7.
Si hay variaciones en la respuesta medida entre rastros obtenidos con distintos geles, varios aspectos deben considerarse para la solución de problemas: la agregación de la proteína en solución, una mezcla no homogénea de la proteína con el cross-linking productos químicos, la presencia de burbujas, el atascamiento del hidrogel basados en proteína en el tubo de PTFE debido a incorrecta silanización. Residuos de silano en las paredes del tubo pueden contaminar el hidrogel y conducir a defectos estructurales. Para evitar este error, más aire es necesario para asegurar un retiro total del silano del tubo. Además, pueden formar burbujas durante la succión de la mezcla fotoactivas de hidrogel en el tubo PTFE. Estas burbujas pueden conducir a daño de la muestra y afectan la respuesta biomecánica de la hidrogel. Para evitar cualquier formación de burbujas, el extremo del tubo PTFE debe ser dentro de la mezcla de la solución durante el proceso de carga y el émbolo de la jeringa debe estar retraído lentamente. Otro error típico es un apriete excesivo de los bucles de sutura alrededor de las muestras de hidrogel durante el proceso de apego, que puede conducir a la formación de una muesca y el corte del hidrogel. La gama de móvil de la bobina de voz limita la extensión máxima de la muestra adjunta del hidrogel. Esta limitación ha de tenerse en cuenta al medir los geles que se extienden varios cientos por ciento de su longitud inicial. Por ejemplo, para prolongar un hidrogel para más de 200%, se requiere una longitud inicial de menos de 4 mm.
Hidrogeles basados en proteínas son una clase única de biomateriales debido a su biocompatibilidad y alta elasticidad derivado de las proteínas, sus unidades de edificio principal y la transición plegable inherente que es característico de las proteínas. Además, estos hidrogeles tienen un excelente potencial para la ingeniería de tejidos, sistemas de entrega de fármacos y biológica tinta (bioink) para impresión 3D27. El Reómetro de hidrogel de fuerza de sujeción puede utilizarse para investigar una gran variedad de proteínas. Además, el Reómetro de fuerza-abrazadera permite a la aplicación de protocolos de fuerza constante en las muestras de hidrogel de bajo volumen. Estos experimentos permiten la disociación de los comportamientos elástico y viscoelástica y estudian mecánica plegable (ONU) en forma de bulto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo financiero de la iniciativa de crecimiento investigación (premio no. 101 X 340), National Science Foundation, programa de instrumentación de investigación principales (Grant no. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Premio de Shaw) y sistema de la Universidad de Wisconsin (beca de investigación aplicada).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
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