Summary
설명 된 항 원 자주 나노 입자와 자극 B 세포 활성화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 그들의 사용의 준비가 이다. 일관 되 고 강력한 항 체 응답 새로운 땅콩 알레르기 모델의 개발을 주도. 항 원 리를 생성 하기 위한 프로토콜은 다른 항 원 및 예방 모델을 확장할 수 있습니다.
Abstract
항 체 응답은 다양 한 병원 체를 중요 한 보호 면역을 제공합니다. 뿐만 아니라, 어떻게 병원 성 항 체 응답에 알레르기 및 면역 질환 개발 이해 예방 접종에 대 한 강력한 항 체 생성에 높은 관심을 확인 하 고 남아 있습니다. 생성 하는 강력한 항 원 특정 항 체 응답은 아닙니다 사소한. 마우스 모델에서 그것은 종종 유발된 항 체의 수준에 변화의 큰 거래 하는 보조로 예방 접종의 여러 라운드를 필요 합니다. 한 예로 어디 더 강력 하 고 재현할 수 모델 마우스 숫자와 보조의 사용을 최소화 하는 도움이 될 것 이라고 하는 땅콩 알레르기의 마우스 모델에서 이다. 여기에 제시 된 땅콩 알레르기 알레르기의 높은 재현성 마우스 모델이입니다. 두 가지 주요 요인에 의존 하는이 새로운 모델: (1) 항 원 특정 splenocytes adoptively; 쥐의 많은 수에 걸쳐 항 원 특정 메모리 B 및 T 세포의 수를 정상화 순진한 받는 사람 마우스에 땅콩 응 마우스에서 전송 그리고 (2) 받는 사람 마우스 이후 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2)를 표시 하는 자주 나노 입자의 형태에 강한 multivalent immunogen로 밀어 주었다. 이 모델의 주요 장점은 보조의 여러 주사 받은 동물의 수를 최소화 하면서 각 연구에 사용 된 동물의 수를 낮추고 궁극적으로 그것의 재현성. 면역성이 리의 모듈 어셈블리 병원 성 항 체를 포함 하는 다른 알레르기 또는 면역 모델에 상대적으로 손쉬운 적응성을 제공 합니다.
Introduction
음식 알레르기, 미국에서 어린이의 8%와 지난 유행에서 증가 했다 10 년1. 땅콩에 알레르기 어린이의 1%에 영향을 하 고는 일반적으로 능가 해2. 비록 몇 가지 유망한 임상 시험 진행 구두 immunotherapy (OIT), 설 immunotherapy (슬릿), 및 epicutaneous immunotherapy (EPIT)를 포함 하 여 음식 알레르기의 치료에 대 한 현재 아무 치료 FDA 승인 전략은 땅콩 알레르기 성 개인3,,45,6,7,8믹싱되어에 대 한 따라서, 알레르기 성 개인 엄격 하 게 알레르기를 피하기 위해 알레르기를 방지 해야 합니다. 많은 질문 남아 민감성의 노선 및 음식 알레르기 개발의 메커니즘을 기본.
마우스 모델은 새로운 tolerogenic와 둔감 치료9,10,,1112개발 뿐만 아니라 알레르기의 기계 장치를 공부 하기 위한 유용한 도구입니다. 이것은 특히 사실 때문에 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2; Ah2) 간에 또한 몇몇에서 지배적인 알레르기 설명 마우스 모델13,14. 땅콩 알레르기의 마우스 모델 아니라, 관용의 메커니즘 연구에 귀중 한 동안, 결점은 그 변수 하 수 adjuvants의 사용을 필요로. 더 강력한 immunogens 같은 모델의 본질적인 가변성을 최소화 하기 위해 한 가지 방법은 것입니다. 표시는 알레르기 항 원 리는 또한 효율적으로의 속성을가지고 하는 동안 잠재적으로 B 세포 수용 체 (BCR)를 통해 B 세포를 활성화 하는 능력 때문에 좋은 옵션 때문에 B 세포는 강하게 multivalent 항 원에 의해 활성화 됩니다, 비 구체적으로 항 원 제시 하 여 채택 되 고를 통해 T 세포 격실을 못쓰게 셀.
여기, 우리 동산 손쉬운 및 모듈형 전략을 사용 하 여 자주 나노 입자에 항 원 단백질에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 시연 대리 항, 안티-IgM Fab 조각 사용 하 여, 얼마나 강력한 같은 항 원 리 자극 B 세포 활성화에 있을 수 있습니다. Ah2 항을 표시 하는 항 원 리 수 여 감도의 새로운 마우스 모델을 개발 하기 위해 사용 되었다. 이 모델에서 splenocytes에서 확인 된 땅콩 알레르기 생쥐, 땅콩 전용 메모리 B 및 T 세포를 포함 하는 순진한 congenic 쥐로 전송 됩니다. 메모리 항 체 응답 Ah2에 대하여 항 체를 유도 하기 위하여 받는 쥐로 Ah2 함께 활용 된 리의 주입에 의해 유발 됩니다. 녹는 Ah2 하나만 부스트를 이어서 Ah2 특정 항 체를 야기할 강한 과민 반응이이 마우스는 이후에 Ah2 도전 때. 이 방법은 바람직한 땅콩 알레르기 모델 이며 결과 유틸리티 다른 마우스 모델에서 지시 하는 항 원에 의해 구동 있을 수 있습니다 제안 마우스 알레르기 반응을 겪고 매우 균일 한 방식으로 반응 하 고는 보조를 받지 못한, 알레르기 그리고 아마도 autoantigens입니다.
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Protocol
지질 하 리에 단백질 결합의 일반적인 방법 이다 이전 작업15크게을 기반으로 합니다. 아래 설명 하는 모든 동물 절차 있다 채 플 힐 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 북캐롤라이나의 대학에 의해 승인 되었습니다. 땅콩 알레르기 모델에서 사용 하는 모든 마우스는 BALB/cJ 여성 나이의 3 주에에서 구입. 앨버타의 대학 동물 보호와 사용 위원회 (ACUC) 6 주 이상 C57Bl/6 쥐에서 vivo 전 분석에 대 한 마우스 spleens의 사용을 포함 하는 실험을 승인 했습니다.
1. PEGylated 지질을 항 원 단백질의 활용
- 250 mL 진공 플라스 크를 1500-30000 Daltons (Da)의 분류 범위 복사해올된 dextran 젤 구슬의 3 세대를 추가 합니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 60 mL을 추가 하 고 지속적으로 자기 볶음 바 저 어. 플라스 크를 밀봉 하 고 최소 1 시간 저 어 접시에 드 가스 처리를 시작 하는 진공을 연결 합니다.
- 마감 매출 마 개와 함께 1.0 cm x 30 cm 유리 착 색 인쇄기 열, PBS 씻어 열을 추가 합니다. 회전율 마 개를 열고 열을 배출. 열에 드 기름된 구슬의 슬러리를 추가 세척, 다음. 열은 약 24 cm의 비드 높이에 포장 될 때까지 지속적으로 슬러리를 추가 합니다.
- 열에는 '머리' 약 4-5 cm의 PBS의 위에 포장된 구슬, 다음 단계를 준비 해야 합니다.
- 1-2 피트 열의 상단 선반에 도달 하 고 아래쪽 열에 삭제 하 고 열의 상단에 반환 하는 루프를 만들 정도로 오래 튜빙의 조각을 측정 하 여 중력 흐름 사이 펀을 만듭니다. 튜빙의 한쪽을 떠나 튜브의 한쪽 끝에 이직 스 토퍼를 추가 합니다. PBS 및 열 위의 선반에 500 mL 병으로 오픈 튜브 끝을 놓습니다.
- 회전율 스 토퍼와 함께 끝을 10 mL 주사기를 연결 합니다. 배관 라인에 이직 스 토퍼 밸브 열고 튜브를 통해 PBS를 그립니다. PBS에는 튜브를 통해 방법의 3/4에 도달 했습니다, 일단 신속 하 게 주사기를 제거 하 고 열의 상단에 이직 스 토퍼 추가-액체는 열에 실행 되어야 합니다.
참고: 열 상단 왼쪽 PBS의 '머리'의 금액은 1, 3 cm 사이 이어야 한다. 씻어 열을 최소한 3 열 볼륨입니다.
- 그것의 분자량 (MW)에 따라 지질에 연결 될 단백질 (두더지)의 금액을 결정 합니다.
참고: 염소 반대로 마우스 IgM의 Fab 조각 (자체는 IgG)는 B 세포의 polyclonal 자극에 대 한 보편적인 대리 항으로 여기. 따라서, 염소 IgG의 Fab 조각 약 48 kiloDalton (kDa)의 MW는, 1.3 밀리 그램의 총 수량에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 연결 하는 단백질의 양은 27.1 µmol 이다. - 관심사의 단백질의 소멸 계수를 결정 합니다. 280에서 단백질 흡 광도 측정 하는 경우 알 수 없는, nm를 분 광 광도 계는 A280 두더지의 수에 의해 계산 단계 1.4에서에서 분할을 사용 하 여.
참고: 멸종 280에 IgG 염소의 팹의 계수 nm 64,600 M-1이다. - 그 추적을 보장 하기 위해 아민이 포함 된 양의 버퍼 제거, desalt 단계 1.1-1.3에서에서 만든 열에 단백질 및 단백질 분수 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (분수 당 ~ 500 µ L)으로 수집.
- 회전율 스 토퍼 밸브는 칼럼의 상단에 연결 된 고 열의 상단을 제거 합니다. 아니라면 이미, 열에의 하단에 회전율 마 개 밸브를 열고 열고 PBS의 '머리' 구슬의 상단을 안타 때까지 기다립니다.
- 천천히 추가 관심사의 단백질에는 유리를 사용 하 여 구슬의 상단에 파스퇴르 피 펫, 구슬의 상단에 방해를 최소화 하기 위해 주의 되 고.
- 일단 단백질 해결책의 '머리'에 구슬의 상단에 도달 했습니다, 추가 1 mL의 PBS 부드럽게 통해 파스퇴르 피 펫. 세 번 반복 합니다. PBS를 4-5 cm의 머리 만들고 반복 단계 1.3 씻어 열을 추가 합니다.
참고:이 단계 라면 없는 아민을 포함 하는 버퍼는 현재 특정 생략 될 수 있습니다.
- A280 값을 측정 하 여 단백질을 포함 하는 분수를 결정 하 고 분수는 단백질의 약 90% 복구를 주는 수영장.
참고:이 일반적으로 단백질 1.5 2 배를 dilutes. 풀링 후 단백질 농도 결정 합니다. 원심 집중 장치를 사용 하 여 필요한 경우이 단계에서 단백질을 집중 한다. - 2.5 어 금 니 동등 물 heterobifunctional crosslinker의 단백질을 추가 합니다.
- 첫째, 무게 약 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) 프로 피 온 산 (SPDP, MW = 314 g/mol) microcentrifuge 관으로. 해산 하는 SPDP, 분자량 단백질 농도가지고 고 250 x 2.5 어 금 니 과잉 반응에 줄 것 이다 100 x 솔루션을 생성 하기 위해 그것을 곱하면 볼륨을 결정 합니다.
참고: 예를 들어 경우 단백질 농도 50 µ M, 12.5 m m에 SPDP의 솔루션은 필요 합니다. SPDP의 5 mg,이 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.27 mL에 해당합니다.
- 첫째, 무게 약 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) 프로 피 온 산 (SPDP, MW = 314 g/mol) microcentrifuge 관으로. 해산 하는 SPDP, 분자량 단백질 농도가지고 고 250 x 2.5 어 금 니 과잉 반응에 줄 것 이다 100 x 솔루션을 생성 하기 위해 그것을 곱하면 볼륨을 결정 합니다.
- 1: 100 희석에 관심사의 단백질에 SPDP를 추가 합니다. 약 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 진동 통에 반응을 놓습니다.
- 초과 SPDP를 제거 하 고 생 이황화 bond(s) 후속 감소 단계에서 단백질에서 보호, equilibrate, 및에서 만든 열을 씻어 단계 1.1-1.3에서 100 mM 아세트산 나트륨 (NaOAc) pH 5.5에서 만들거나 사용을 위해서 동일한 열이 버퍼입니다.
- 후에 SPDP 가진 1 시간 외피, desalt 100mm NaOAc에에서 equilibrated 열에 단백질. 수행이 단계는 동일한 방식으로 단계 1.6 eluent는 100mm NaOAc (pH 5.5)을 사용 하 여 제외 하 고. 분수를 수집 하 고 결정 A280, 수영장 가기 분수. PBS에 열의를 씻으십시오.
- DTT의 2.5 M의 솔루션을 준비 (MW = 154 g/mol) 더블에 증류수 (ddH2O). 5-10 분에 대 한 단백질의 풀링된 분수를 25 mM DTT를 추가 합니다.
- 단백질의 A280 을 측정 하 고 소멸 계수 이것을 나누어. 또한, A343결정 합니다. 단백질 (280)와 링커 (343)의 몰에 따라 연결 비율을 계산 합니다.
Nanodrop 분 광 광도 계를 사용 하는 경우 참고: A340 자동 보정을 해제 합니다. A343 측정 피리 딘 2-thione 그룹의 흡 광도 나타냅니다 (소멸 계수 = 7550 M-1) 그는 DTT에 의해 SPDP cross-linker에서 제거. 링커의 어 금 니 비율: 단백질의 넓은 범위에 SDPD의 2.5 어 금 니 과잉을 가진 반응을 수행할 때 1.2-1.5의 단백질 비율은 일반적으로 가능. - 위에서 설명한 대로 PBS로 세척 열 풀링된 분수를 실행 합니다. 분수를 수집 하 고 결정 A280, 최고 분수 수영장. 분수를 풀링 후 A280에 의해 단백질의 농도 결정 합니다.
- DSPE 말뚝 준비 Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-(2000)-Maleimide. 이 10:1 어 금 니 비율에서 단백질에 추가 될 것입니다. 원하는 농도 달성 하기 위해 (2000)-Maleimide DSPE-말뚝의 100 배 재고를 준비 합니다.
- 예를 들어 단백질 농도 1.14 단계 후 10 µ M, (2000)-Maleimide 10 m m DSPE-말뚝의 재고를 준비. 신중 하 게 DSPE 말뚝 밖으로 무게, (2000)-Maleimide (MW 3000 g/mol =) DMSO의 적절 한 금액을 추가. Sonicating 부드러운 vortexing의 여러 라운드는 완전히 해산 그것을 얻을 수 있습니다.
- 단계 1.14에서에서 분수의 총 볼륨을 확인 하 고 둥근 바닥 플라스 크 (RBF) 작은 (10-25 mL)에 신중 하 게 솔루션을 전송. 100의 적절 한 금액을 추가 DSPE-말뚝 (2000)-Maleimide 단백질에 1 x 10 어 금 니 과잉, 최종 농도 달성 하기 위해 x. 부드럽게는 DMSO 완전히 분산 되도록 솔루션을 소용돌이 친다.
- 봉인 된 RBF에 반응 질소에서 하룻밤을 실행 합니다. 고무 격 막 사용 하 고 증기 두건에.
- 진공 청소기에 부착 된 튜브의 끝에 3 mL 주사기에 부착 된 20 G 바늘으로 심장 puncturing 의해 분위기를 제거 하 고 진공 3-5 s에 대 한 설정.
- 질소 분위기를 바꿉니다. 채우기는 풍선 질소로 반으로 잘라 3 mL 주사기에 부착 하 고 20 G 바늘을 연결 합니다. 찔린 질소와 둥근 바닥 플라스 크 내부의 분위기를 채우기 위해 심장 합니다. 분위기와 질소로 교체 한 번 더의 제거를 반복 하 고 두고 하룻밤 사이 연결 된 질소 풍선.
- (에 의하여 단계 1.1-1.3) 1.0 c m x 50 c m 유리 착 색 인쇄기 열에 4000-150000 Da의 분류 범위와 별도 교차 연결 된 dextran 젤 비드 열을 준비 합니다.
- 다음 날, 준비 단계 1.17 실행 (수행 단계 1.6에서에서 사용 되는 방법)에서 둥근 바닥 플라스 크에서 단백질 제거 (1.18 단계)에서 복사해올된 dextran 젤 비드 열.
참고: 열에 로드 총 금액 2 mL 더 이상 이어야 한다. 더 큰 반응을 사용 된 경우 두 개로 분할할 별도 열에 실행 하거나 큰 직경 열에서 실행.- 분수를 수집 하 고 A280, 수영장 가기 분수, 결정 단백질의 농도 결정 합니다. 지질의 존재는 측정에 영향을 미치지 않습니다.
- 사용할 준비까지 4 ° C에서 단백질 지질 연결의 최종 풀링된 분수를 저장 합니다.
2. liposome 준비
- 지질 개 무게: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; 콜레스테롤 (3b Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol) MW = 386.7 g/mol; 그리고 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. 만들기 DSPC, 콜레스테롤, 4 mg/mL 해결책 및 클로 프롬에 DSPE-PEG(2000)의 2 mg/mL 해결책의 5 mg/mL 해결책.
- 지질은 리에서의 어 금 니 비율 인지 확인: 57 %DSPC, 38% 콜레스테롤, 및 5 %DSPE-PEG(2000), 표 1에 표시.
참고: 그것은 일반적으로 0.01-0.1에서 범위 liposome에 항 원의 양을 제어 해야 %. 표 1, 염소 반대로 마우스 IgM 팹 조각 PEGylated 지질에 연결의 0.1%를 사용 합니다. (2000)-Maleimide 단계 PEGylated 지질의 총 금액 5%를 초과 하지 않습니다 1.15에서에서 단백질에 추가 된 DSPE 말뚝의 초과 10 모 랄의 고려해 야 할 중요 하다. - 돌출에 대 한 지질을 만들 때 최종 지질 금액을 (µmol)를 고려 하십시오. 1.25 µ M 총 지질 농도에 리의 창조에 대 한 어 금 니 지질 농도 계산의 예를 들어 표 1 을 참조 하십시오.
- 각 지질을 함께 추가할 수의 정확한 금액을 계산 하는 일단 모두 12 mL 붕 규 산 유리 시험관에 결합.
-
신중 하 게는 클로 프롬을 날 려.
- 바늘, 준비 단계 1.17.1, 신중 하 게 질소 튜브에 클로 프롬을 버릴 관과 3 mL 주사기를 사용 합니다. 다른 손으로 튜브를 회전 하는 동안 솔루션에 질소의 흐름을 가볍게 불어. 튀는 하거나 다음 단계에서 솔루션으로이를 더 어려울 수 있습니다 튜브의 측면을 방식으로 실행 하려면 액체를 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 각 관에 DMSO의 100 µ L을 추가 하 고이 솔루션을 하룻밤 사이 lyophilize. 고무 밴드와 함께 안전한 정적 실험실 삭제 기능으로 튜브의 상단을 커버 하 고 동결-80 ° c.
3. liposome 압출
- 지질을 포함 하는 12 mL 튜브에 지질 연결 단백질을 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 약 30에 대 한 솔루션을 sonicate 쥡니다 물 욕조에 1 분 s. 각 라운드 사이 5 분 이상 휴식 하 고 3-4 회 반복.
-
제조업체 지시에 따라는 압출 기를 준비 합니다.
- 내부 막 지원 필터 지원 추가, 파라핀 영화에 PBS의 몇 방울 (10 µ L 각)의 장소. 핀셋을 사용 하 여, 필터 지원의 가장자리를 잡아와 10 µ L 드롭에서 그것을 찍어.
- O-링 안에 있는 필터를 놓습니다. 이렇게 양쪽 모두에 대 한. 핀셋을 사용 하 여 가장자리에 0.8 µ m 필터를 잡아와 10 µ L 드롭에서 찍어와 PBS와 링의 외부 코트. 장소 0.8 µ m 필터 부드럽게 o-링에 필터 내부 막 지원 중단 이상 하지 않습니다.
- 압출 기 난방 블록을 미리 압출이 열 하는 뜨거운 접시에 놓습니다. 낮은에 핫 플레이트를 전환 하 고 원하는 온도 도달 압출 기 난방 블록을 허용 합니다. 단백질 집계의 잠재적인 문제를 방지 하려면 블록 과거 37 ° c.가 열 하지 마십시오
- 압출 기에 압출 주사기 중 하나로 sonicated 샘플을 로드 합니다. 압출 기의 다른 쪽 끝으로 압출 기 주사기를 놓습니다. 빈 주사기 플런저는 0으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 빈 주사기는 지질 폴 리 카보 네이트 0.8 µ m 막 통해 압출로 채울 것입니다. 앞뒤로 막 통해 거품을 전달 하지 않도록 하십시오.
- 완벽 하 게 조립된 압출 기 난방 블록에 놓습니다. 부드럽게 빈 주사기에 지질으로 채워진된 주사기의 플런저를 밀어. 지질 농도 따라이를 밀어 어려울 것 이다. 20 x를 반복 합니다.
- 열 블록에서 완벽 하 게 조립된 압출 기를 제거 합니다. 천천히 압출 기에서 채워진된 주사기를 제거, 제거 밖으로 누출 수 있습니다 어떤 지질을 수집 해야 합니다. 깨끗 한 유리병에 리를 놓습니다. 반복 단계 3.4-3.6을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 0.2 µ m와 0.1 µ m 세포 막.
- 메가 Daltons (MDa) PBS에 equilibrated 0.7-10의 분리 범위 0.7 x 50 cm2 복사해올된 agarose 구슬 열을 만듭니다. 에 리를 추가 하 고 단계 1.6에서 실행. 분수 포함 하 리 250-400 nm 범위에 빛의 전송을 감소 것입니다.
- 4 ° C에서 리를 저장 하 고 꼼짝 하지 마십시오.
4. 칼슘 유출 항 원 리에 의해 B 세포 활성화를 모니터링 하
- 기관 표준 운영 절차에 따라 이산화탄소 (CO2) 또는 isoflurane 과다, 마우스를 안락사. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐의 안락사를 확인 합니다.
- 수술 악기와 마우스 시체 70% 에탄올을 사용 하 여 소독. 사용 10 ㎝, 길이 0.8 m m 팁, 아이리스 포 셉 흉 흉 곽에서 다루는 피부를 분리 곡선. 10 cm 오랫동안, 바로 해 부가 위를 사용 하 여 양측 절 개를 가진 원심 절 개를 만들기 위해.
- 복 부 구멍에서 비장 추출 곡선된 아이리스 포 셉과 해가 위를 사용 합니다. 비장을 둘러싼 지방 조직을 제거 하 고 RPMI1640 중간 포함 1% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 그리고 페니실린-스 가득 15 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 배치.
- 전송 비장 및 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 미디어 50 mL 원뿔 튜브에 장착. 3 mL 주사기 플런저의 고무 끝을 사용 하 여, 부드럽게 비장 호감. 미디어와 40 µ m 셀 여과기를 세척. 지방 조직만 40 µ m 셀 스 트레이너에서 남아 때까지이 과정을 반복 합니다. 씻어 증가 세포 복구 미디어의 3-5 mL와 체.
- 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 셀 homogenate 원심 원심, 후는 상쾌한 삭제 하 고 펠 릿을 1 x RBC 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱, RT에 2-3 분 두고 실시간에 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심
- 삭제는 상쾌한 고 미디어 10 mL에 고갈 적혈구 splenocytes를 resuspend. 총 세포 수는 hemocytometer 또는 다른 셀 계산 장치를 사용 하 여 결정 합니다. 위에서 설명한 대로 셀을 원심 분리 하 여 작은.
참고: splenocytes의 이상적인 최종 농도 인도 1 로드에 필요한 10-20 mL/106 셀, x 이지만 셀의 낮은 농도 사용할 수 있습니다. - 15 x 106 셀/mL 로드 버퍼 (RPMI1640 매체 1 %FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1 m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 1 m m 에틸렌 글리콜-두번째 (를 포함 하는 칼슘 유출에에서 splenocytes resuspend Β-aminoethyl 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), 그리고 5% 페니실린-스). 1.5 µ M에 추가 인도-1 1 mM DMSO 재고 솔루션에서 반전 튜브를 섞어 여러 번. 빛에서 보호 하 고 30 분 동안 37 ° C 물 탕에서 세포를 품 어.
- 30 분 부 화에 따라 칼슘 유출 버퍼 로드의 금액 x 5에 추가 합니다. 실시간에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
- B 세포에 게이팅에 대 한 셀 1: 200 안티 마우스 CD5-PE와 반대로 마우스 1: 200 B220-PE/Cy7 4 ° c에서 20 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 버퍼를 로드의 0.5 mL에 얼룩.
- Splenocytes 칼슘 유출 로딩 버퍼 및 실시간 Resuspend 셀 (행 크의 균형 소금물 (HBSS) 1 %FCS, 1 mM MgCl2 와 1를 포함 하는 버퍼를 실행 하는 칼슘 유출에 106 셀/mL x 10-20에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기에서 세척 칼슘 염화 (CaCl2)). 교류 cytometer에서 실행할 준비가 될 때까지 빛에서 보호, 얼음에 저장 합니다.
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보상에 대 한 흠 없는 하나의 얼룩 컨트롤과 cytometry 설치.
- ( 그림 2A참조) 문을 적절 하 게 설정 하는 스테인드 셀을 실행 합니다. 인도-1 (바이올렛) 대 인도-1 (파란색) 음모를 설치의 45-60 ° 신호를 최대화 하기 위해 경사에 얼룩이 지는 세포를 인도-1 채널에서 전압 조정: 인도-1 바이올렛의 잡음 비율: 비율 B 세포 자극 다음에 블루 변경.
참고: 전압이 너무 높은 인지 확인 되도록 셀의 상당한 비율 (> 5%)는 플롯의 상단에 반대는. - 만들고 대각선 게이트는 플롯의 상단 왼쪽된 부분 (바이올렛+블루-)를 캡슐화 하는 자극 없이 < 셀의 10%가 이상적으로 증가 해야 게이트 > 자극에 따라 75%.
- ( 그림 2A참조) 문을 적절 하 게 설정 하는 스테인드 셀을 실행 합니다. 인도-1 (바이올렛) 대 인도-1 (파란색) 음모를 설치의 45-60 ° 신호를 최대화 하기 위해 경사에 얼룩이 지는 세포를 인도-1 채널에서 전압 조정: 인도-1 바이올렛의 잡음 비율: 비율 B 세포 자극 다음에 블루 변경.
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셀의 0.5 mL 하단 폴리스 티 렌 튜브 (형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브) 라운드 출장된 5 mL을 추가 하 고 따뜻한 물 욕조에 3-5 분 동안 37 ° C에 셀. 다시 순환 물 욕조에 연결 된 37 ° C water-jacketed 챔버에 FACS 튜브를 놓습니다.
- 튜브를 실행에 교류 cytometer에 water-jacket 및 약 5000-10000 이벤트/s에서 데이터를 저장 하지 않고 수집, 시작. 셀 (15-30 s) 안정, 일단 적어도 10에 대 한 데이터 수집 및 수집 데이터 시작 배경을 설정 하는 s.
- 10 s 마크에서 신속 하 게 교류 cytometer에서 튜브를 제거, 자극 (2-20 mL에 항 원 리 5-50 m m), 펄스 소용돌이, 더하고 교류 cytometer에 FACS 튜브를 반환. 데이터 수집 및 저장이이 시간을 통해 유지 하 고 3-5 분에 대 한 데이터를 수집.
- 활동 기능에서 적절 한 분석 소프트웨어에서 데이터를 분석 합니다.
5입니다. 땅콩 추출의 준비
- 1 M 염화 나트륨 (NaCl)를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1:5 (wt:vol) 비율에 땅콩 가루를 혼합 하 여 땅콩 단백질을 추출 합니다. PH 8.5에서 유지 하면서 2 h RT에 대 한 자기 저 어 접시에 솔루션을 믹스.
- 4 ° c.에 45 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기 솔루션 가만히 따르다 하 고 필터-소독 상쾌한 순차적으로 0.2 µ m 필터 다음 0.4 µ m 필터를 통해. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 표준으로 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.
- 감소 하 고 최대한 활동 원제와 10 분 동안 70 ° C에서 열 수 있는 8.4, pH에 리튬 라우릴 황산을 포함 하는 버퍼에 샘플 50 m m dithiothreitol (DTT)와 함께 땅콩 단백질의 변성.
- 분자량과 그라데이션 젤 미리 표준 스테인드 최적의 분리를 제공 하도록 설계 된 두번째-트리 스 4-12% precasted polyacrylamide 젤에 변성된 땅콩 단백질의 10 µ g를 실행 합니다.
- Disulfonated triphenylmethane와 젤을 얼룩이 고 ddH2O. 식별 주요 땅콩 알레르기 Ara h 1, 2, 3 추출 준비에 알려진 destain. Ara h 1 63 kDa에, Ara h 2 17 및 19 kDa에서 2 개의 isoforms로 나타납니다 나타나고 Ara h 3 37 kDa (산 성 소 단위)에서 나타납니다.
6입니다. 땅콩을 쥐의 민감성
- 1 mL 초순에 1mg 콜레라 독 소 resuspend 200 µ L 희석 땅콩 추출 포함 2 mg 땅콩 단백질 및 PBS에 10 µ g 콜레라 독 소를 준비 합니다.
- 콜레라 독 소 (2 mg 땅콩 단백질 및 10 µ g 콜레라 독 소)를 통해 구강 각 4-5 주 오래 된 BalB/cJ 여성 마우스를 포함 하는 땅콩 추출의 200 µ L를 관리 합니다. 3 주 (즉, 일 0, 7, 14)에 대 한에 일주일에 한 번 반복 합니다.
- 4 주 (즉, 주 21)에서 각 마우스를 300 µ L 희석 땅콩 추출 (5 mg 땅콩 단백질 및 10 µ g 콜레라 독 소 포함)을 통해 구강을 관리 합니다.
7. 도전 생쥐 땅콩 추출
- 28 일에 PBS에 1 mg/mL의 최종 농도에 땅콩 추출 준비. 직장 온도계 (약 37.5-38.5 ° C)를 사용 하 여 기준 체온을 측정 합니다. 땅콩 추출 통해 복 (i.p.) 주입의 200 µ L (200 µ g)를 관리 합니다.
- 측정 온도 직장 온도계로 1 시간에 15 분 마다 주입 후. 체온에 딥 땅콩에 알레르기를 나타냅니다.
참고: 저체온증 쥐에서 알레르기의 특징 이다. 이 문제는 마우스는 땅콩에 알레르기가 시연할 예정 이다. 일반적으로, 민감성 프로토콜을 받아야 Balb/cJ 쥐의 90% 동안 적어도 2-3 ° C 온도 저하에 의해 특징 도전 알레르기 반응을 개발.
8. 알레르기 마우스 및 입양 전송에서 Splenocytes의 격리
-
순진한 땅콩 알레르기 생쥐에서 splenocytes를 격리 합니다.
- 30 일에 가스 실에서 CO2 의 3 L/min을 투여 하 여 순 진하고 확정된 땅콩 알레르기 생쥐를 안락사. 양자 thoracotomy 여 쥐의 안락사를 확인 합니다. 수술 악기와 마우스 시체 70% 에탄올을 사용 하 여 소독. 집게를 사용 하 여 흉 곽에서 흉을 취재 하는 피부를 분리. 바로 해가 위를 사용 하 여 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈를 깨는 양자 절 개를 만들기 위해.
- 복 부 구멍에서 비장 추출를 집게와 해가 위를 사용 합니다. 10 mL RPMI 1640 매체 가득 폴리스 티 렌 15 mL 원뿔 튜브에 배치 하기 전에 비장을 둘러싼 지방 조직의 제거.
- 살 균 층 류 두건에 35mm 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 비장 및 미디어를 붓는 다. 순진한 및 알레르기 splenocytes 별도 접시에 미디어 셀 격리 하는 동안 계속. 소독된 집게와 해가 위를 사용 하 여를 세 조각으로 비장을 잘라 Petri 접시.
- 두 개의 유리 현미경 슬라이드의 거친, 두르고 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 균질 (RPMI)에 비장 조각 흰색 조직 슬라이드 사이 남아 때까지. 그룹 사이 슬라이드를 변경 합니다.
- 50 mL 원뿔 튜브에 장착 되어 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 배양 접시에서 셀 homogenate를 전송. 나머지 비장 파편을 1 mL 주사기에서 플런저와 여과기에 통과. 체 세포 복구를 최대화 하기 위해 RPMI의 5 mL로 씻어. 폴리스 티 렌 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 원심 분리기 (450 x g, 10 분, RT)에 여과 액을 전송.
- 상쾌한 발음을 2 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (0.83% 염화 암모늄 10 mM Tris 버퍼, pH 7.2)에서 resuspend 셀 펠 릿을 추가 합니다. 혼합 하 고 2-3 분 추가 10 ml PBS-2 %FBS 및 실시간에 7 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기의 RT에서 품 어
- 세포를 씻어 다시 RPMI 1640 매체의 2 ml에서 PBS-2 %FBS 완전히 제거 어떤 잔여 염화 염화 물, 실시간 다시 중단 셀에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심을 작은 공의 12 mL와 함께. Hemocytometer 또는 자동 혈액학 분석기를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 15 x 106 알레르기 또는 추출 (200 µ L)에서 위에서 설명한 대로 순 splenocytes 정 맥 주사 27 G, 1 mL 인슐린 주사기에 5/8 인치 바늘을 사용 하 여 통해 꼬리 순 (unsensitized) 쥐에 정 맥.
9. Ara h 2 항 원 리와 쥐의 주입
- 포함 된 2.5 m m 지질에서 0.1% Ah2 Ah2 리를 준비 합니다. 단백질 농도 계산, Ah2 소멸 계수 15000 M-1이다. 리 메 마른 PBS에서 300 µ m을 희석.
- 알레르기의 입양 전송 (31 일) 후에 1 일 또는 순 splenocytes 정 맥 주사 Ah2 통해 단계에는 splenocytes를 받은 BALB/cJ 쥐의 꼬리 정 맥의 1.38 µ g의 총 포함 된 PBS 또는 Ah2 항 원 리 (300 μ M)의 200 µ L 8.2입니다.
10. 부스트와 Ara h 2와 쥐의 도전
- 45, 당일 Ah2 리와 주입 후 2 주 4mm 동물 첨 두를 사용 하 여 마우스의 submandibular 교차로에서 50-200 µ L의 혈액을 수집. 헤 파 린; 없이 혈 청 분리기 관에서 혈액을 수집 별도 centrifuging 6000 x g 15 분 대에 의해 혈 청 측정 항 원 특정 항 체 나중에 수집 된 혈 청을 사용 합니다.
- 하루 46, 2 주 후 쥐 리 (단계 9.2) 주입에 PBS의 200 µ L 또는 녹는 Ah2 (앞에서 설명한16정화)의 200 µ g의 i.p. 주입 하 여 쥐를 향상.
- 60 일에는 마우스의 submandibular 교차로에서 50-200 µ L의 혈액을 수집 하 고 앞에서 설명한 혈액을 처리 합니다.
- 61 일에 도전 300 µ g의 200 µ L의 i.p. 주사와 쥐의 각 그룹 수용 성 Ah2. 7에서 15 분 마다 직장 프로브 체온을 측정 합니다.
11. Ara h 2 전용의 정량화 IgE 및 IgG1 ELISA에 의해
- 96-잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 코트-100 µ L 호환 판 HSA-DNP (2, 4-dinitrophenyl hapten 활용된 인 혈 청 알 부 민, 20 µ g/mL) 표준 곡선 또는 Ah2 (5 µ g/mL)에 희석 하는 혈 청 샘플 수집 단계 10.1와 10.3, 대 한 4 ° C 하룻밤 또는 37 ° C에서 코팅 버퍼 (50 m m 탄산-중 탄산염 버퍼, pH 9.6) > 1 h.
- 200 µ L로 세 번 세척 PBS-T (0.05%와 PBS 트윈-20) 200 µ L PBS T 포함 된 웰 스를 차단 하 고 37 ° C에서 2 %BSA > 2 h.
- Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 50 µ L IgE-안티-DNP 표준 (2-0.002 µ g/mL, 1:2 직렬 희석에서 준비) 또는 마우스 혈 청 샘플 (1시 20분 희석)와 4 ° c.에서 밤새 품 어 Ah2 특정 IgG1 ELISA, 100 µ L 정화 IgG1-안티-DNP 기준 추가 (2-0.002 µ g/mL, 1:2 직렬 희석에서 준비) 또는 혈 청 샘플 (1: 500 희석) 마우스와 4 ° C 또는 37 ° c.에서 1 h에서 밤새 품 어
- 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 100 µ L 양 반 마우스 IgE (0.5 µ g/mL)와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. Ah2 특정 IgG1 ELISA, 추가 100 µ L HRP 염소 반대로 마우스 IgG1 (희석 PBS-T-2 %BSA 1:40,000). 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 100 µ L biotinylated 당나귀 항 양 (0.5 µ g/mL) IgG 및 45 분 동안 37 ° C에서 품 어. Ah2 특정 IgG1 ELISA에 11.7 단계로 건너뜁니다.
- 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA를 위해 100 µ L 중립으로 위탁 avidin-양 고추냉이 과산화 효소 (예를 들어, NeutrAvidin-HRP, 0.3 µ g/mL)을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 100 µ L 3, 3', 5, Tetramethylbenzidine (TMB)-5' 기판, 10-15 분을 품 어 더하거나까지 샘플 차례 진한 파란색, 다음 100 µ L TMB 정지 솔루션을 추가 합니다. 450에 접시를 읽고 nm.
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Representative Results
DSPE-PEG(2000) 가진 관심사의 단백질의 활용을 줄이는 증가에서 보여주는 결합형된 단백질에 비해 분자량을 실행 하 여 설명할 수 있습니다. 그림 1A 반대로 마우스 IgM F(ab) 조각 활용의 대표적인 젤 못-DSPE, 변성된 단백질에 대 한 2-3 kDa bandshift를 보여주는 표시 됩니다. 단백질의 약 50%를 수정할 수는 1:1 산출할은 무 겁 고 가벼운 체인의 heterodimer Fab 조각에 달성 했다 그 예상은 나타나는 note. 그림 1B Ah2 활용의 대표적인 젤 못 DSPE 표시 됩니다. B 세포의 칼슘 플럭스를 평가 하기 위해 항 원 리에 의해 자극 두 가지 중요 한: (1) 악기 설정을 캘리포니아2 + 에서 인도-1 형광의 차이 (바이올렛) 바운드 및 언바운드 폼 (파란색)과 (2) 적절 한 참조를 조정 된다 게이팅 전략 B 세포 활성화를 평가 하는 데 사용 됩니다. 그림 2A 흐름 cytometry 기반 칼슘 유출 분석 결과 대 한 제어 구조를 보여 줍니다. 라이브 세포는 SSC-A 대 FSC-A (왼쪽된 패널)에 문이 있습니다, 남자는 음모 대 SSC W FSC W (중간 패널), 그리고 B200 밖으로 문이+CD5- B-세포 CD5-PE 대 B220-PE/Cy7 플롯 (오른쪽 창)에서 선택 됩니다. 그림 2B 는 인도-1 (바이올렛) vs 인도-1 (파란색) 형광 분석으로 시간이 지남에 비율을 보여 줍니다. 참고 이러한 분석 실험에서 F(ab) 및 F(ab')2 의 총 단백질 농도 같은, 자극 B 세포 활성화 항 원 리의 뛰어난 능력을 발휘 했다. 땅콩 추출 물 준비 후 Ara h 1, 2, 3 추출 물 내에서 상대 수량을 결정 하는 SDS 페이지 젤에는 약 수를 실행 합니다. 그림 3 은 땅콩 추출 정화 Ah2 함께 실행의 대표적인 젤을 보여준다. 그림 4 전체 입양 땅콩 알레르기 마우스 모델, 땅콩, 땅콩, splenocyte 격리 및 입양 전송, liposome 주사, 도전을 포함 한 초기 민감성의 회로도 보여준다 혈액 무승부 뒤 Ah2 부스트, 그리고 Ah2에 도전. 그림 5A 와 B에서 같이 Ah2-IgE 및 IgG1 ELISAs 혈 청 면역 글로불린을 계량을 실행 했다. Ah2와 증가 수 여 감도와 마우스의 혈 청에서 Ah2 특정 IgE 및 IgG1 해야한다. 그림 5C; 체온 Ah2 도전 하는 동안 기록 표시 됩니다. 알레르기 쥐 체온 순진한 생쥐에서 일관 된 동안 도전, 다음 체온 감소 했다. 도전 하는 동안 땅콩 알레르기 생쥐에 비해 순진한 쥐를 보여주는 사진 그림 6에 나와 있습니다.
그림 1: 못 DSPE를 반대로 마우스 IgM F(ab) 및 Ah2 활용의 대표적인 젤. (A, B) (A) 염소 반대로 마우스 IgM F(ab) 조각 및 (B) Ah2 못 DSPE를 활용 전후 SDS 페이지 분석. 염소 반대로 마우스 IgM과 Ah2 분자 무게 약 48 및 18 kDa의 각각 있다. 수정에 따라 약간 더 큰 분자량 (~2.5 kDa) 두 단백질에 대 한 명확 하 게 관찰 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전략, 칼슘 유출 결과 및 분석 게이팅 대표. (A) 세포는 다음과 같은 제어 전략을 통해 분석 되었다: 라이브 세포 (FSC-A 대 SSC-A), (FSC-W 대 SSC W), 단일 세포와 B 세포 (B220+CD5-). (B)는 인도-1/Ca2 + 플럭스 (보라색 과 파란색)의 응답 B 세포. 표시 된 컨트롤 버퍼 자극 세포 뿐만 아니라 안티-IgM Fab 조각 리와 같은 단백질 농도 (2.5 µ g/mL)에서 안티-IgM F(ab')2 칼슘 유출이 이다. 10 월 22 일 s 사이 자극 추가 되 고, 따라서 데이터가이 시간 동안에 취득 하는 경우 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 땅콩 추출 및 Ah2 보여주는 대표적인 젤. 땅콩 추출에는 여러 가지 단백질을, 1, 2, 3, 6, Ah2에 대 한 표시 되는 두 개의 isoforms에 비해 알레르기 Ara h를 포함 하 여 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 입양 전송 프로토콜의 도식. 순진한 BALB/cJ 쥐 땅콩 추출 (PN)와 콜레라 독 소 (CT), 민감하게 되었고 이후 pn 도전. Splenocytes 확인된 알레르기 생쥐에서 고립 되었고 순진한 쥐로 전송. 마우스 나중 면역성 Ara h 2 리 또는 PBS, 액 다음 녹는 Ah2 함께 없어졌다. 마지막으로, 쥐 Ah2와 알레르기 모니터링에 도전 했다. 45-60 일에 수집한 혈액 Ah2 특정 면역 글로불린을 계량에 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 면역성 Ara h 2 liposome 향상 수 여 메모리 알레르기 성 응답. 혈 청은 고립 된 사전 (45 일) 및 게시물 (60 일) 부스트와 PBS 면역성 Ah2 liposome 300 µ M의 200 µ L Ah2 sepcific IgE (A)를 측정 하 고 IgG1 (B). 개별 마우스 medians를 나타내는 선으로 표시 됩니다. 알레르기 splenocytes를 받은 고 했다 쥐 날 32 했다 Ah2 특정 IgE 및 IgG1 중 상당히 높은 수준의 Ah2 리 관리. 알레르기는 다른 치료 그룹에서 Ah2challenge 후 신체 온도 기록 하 여 측정 되었다 (C). 평균 신체 온도 SEM. 순 묘사: PBS (순 splenocytes 및 PBS 총리), 알레르기: PBS (확인된 알레르기 splenocytes 및 PBS 총리), 알레르기: Ah2 (알레르기 splenocytes 및 Ah2immunogenic liposome 총리 확인). * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * P < 0.0001 정한 짝이 없는 2 꼬리 학생 t-테스트. 참고 이러한 결과 두 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 과민 증상 관찰 Ah2 도전 중. 순진한 마우스 누르기 그리고 (A, C) 그들의 발에 분홍색 피부. 알레르기 마우스 활동 감소, 종종 hunched는 고 심한 흔적이 호흡을 (B, D) 그들의 발에 어두운 보라색 안 색으로 표시 하는 청색 증을 경험 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | 콜레스테롤 | 말뚝-DSPE | 초과 말뚝-DSPE | 는 IgM-말뚝-DSPE | 총 | |
| 어 금 니 비율 | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100.00 |
| 질량 (mg) | 0.56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| m mol | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| 하자마자 (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| 콜레스테롤 | 4 | |||||
| 말뚝-DSPE | 2 | |||||
| 는 IgM-말뚝-DSPE | 0.114 |
표 1: 1.25 µ M 총 지질 농도 liposome을 만들기 위한 계산. 염소 반대로 마우스 IgM F(ab) 조각 리에 대 한 계산 테이블의 예입니다.
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Discussion
여기에 설명 된 메서드는 자주 나노 입자에 단백질의 디스플레이 가능 하 게 지질에 단백질의 활용에 대 한 일반적인 프로토콜. 매우 큰 다중 소 단위 단백질을 위해이 프로토콜 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 이상적인 방법은 biorthogonal 화학 연결 전략을 사용할 수 있도록 특정 태그의 소개 것입니다. Recombinantly 단백질을 표현 하는 경우 PEGylated 지질 상업적으로 사용할 수 있는 끝에 사용할 수 있는 사이트 전략17, 그리고 다양 한 기능 그룹을 사용 하 여 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 자연적인 근원에서 고립 된 단백질의 연결에 맞도록 하 고 과학자 들은 반드시에 익숙하지 화학 및 생화학 변환의 넓은 범위에 액세스할 수 있습니다.
강조를 해야 칼슘 유출 실험 실행의 핵심 측면에서 세포는 cytometry에 그들을 실행 하기 전에 활성화 되어야 한다 이다. 메 마른 기술 엄격 하 게 사용 하지 않으면,이 활성화 된 세포 (인도-1 형광 보라색 채널에 그것의 방출에 대 한 괴상 한)에서 높은 배경 신호에 대 한 계정을 것입니다. 마찬가지로, 셀을 피하기 위해 인도 1 채널에서 배경 신호의 비정상적인 수준 분석 결과 실행 하기 전에 얼음에 보관 한다. 그것은 또한 셀 cytometry에 의해 및 데이터 수집 하는 동안 자극을 통해 전에 2-3 분 예 열은 보장 하는 것이 중요. 셀은 데이터 수집 중 37 ° C에서 유지 되지 않으면, 셀 극대 응답 하지 것입니다 기대 수 있습니다. B 세포 항 원 특정 매우 작은 숫자에 마우스에 존재 때문에, 대리 항을 사용 하 여 마우스에서 모든 B 세포를 자극 하는 이상적 이다. 비록 수많은 유전자 변형 마우스 종자는 익스프레스 항 원 특정 B-세포,이 기법의 목적은 평균 사용자가 야생-타입 마우스를 사용 하 여 항 원 리를 만들기 위해 그들의 능력을 확인할 수 있도록 사용할 수 있습니다. 이 목표를 달성 하기 위해 안티 마우스 IgM의 Fab 조각 지질에 연결 되었고 상호 링크 polyclonal 방식에서 B 세포 수용 체 (BCR) 항 원 리에 공식화. 그것은 그것은 이전 인간 B 세포10 의 중요 한 숫자에 액세스할 수는 없습니다 때문에 중요 하다 적절 한 안티 인간 IgM 팹 조각을 사용 하 여 자극을이 메서드를 사용할 수 있습니다 입증 되었다 항 원 특정 인간의 B-세포입니다. 이러한 연구에서 B 세포 활성화를 자극 하는 항 원 리의 힘은 칼슘 유출은 동등한 양의 반대로 마우스 IgM F(ab') 2 조각에 비해을 유도 하기 위해 그들의 향상 된 기능에 의해 그림 했다.
항 원 리의 사용은 땅콩을 BALB/cJ 쥐 sensitizing, splenocytes 알레르기 생쥐에서 순진한 쥐로, Ah2 리, 호스트 마우스 주입 및 Ah2로 그들에 도전 하는 방법의 개발을 활성화 하 고 있다. 항 체 수준 및 쥐의 그룹 내에서 과민 응답이이 모델에서 재현할 수 있습니다. 그것은 잘 설립 되었습니다 메모리 B 및 T 세포 응답은 생쥐에서 땅콩 특정 항 체의 개발에 중요 하. 또한, 최근 연구는 메모리 표시 된 B-세포 다시 높은 항 원 특정 IgE 수준;을 유지 하는 쥐에 있는 플라스마 세포 그러므로 알레르기 전용 메모리 B 세포 치료 개입18에 대 한 매력적인 대상 이다. 지금 여기에 설명 된 모델을 직접 대상 Ah2 특정 메모리 B 세포, bortezomib 고갈 전체 플라즈마 셀 레 퍼 토리19를 사용 하 여 면역 접근에 반대는 기회를 허용 합니다. 또 다른 방법은 알레르기를 방지 하는 T 세포 구획에 허용 오차를 유발 하는 것입니다. 한 잠재적인 전략에 liposome 내 관용 유도 adjuvants을 캡슐화 하는 것입니다. 이전, 나노 캡슐화 rapamycin Tregs 유도 및 자가 면역 질환20감소에 사용 되었다. 접근의이 유형에 땅콩 알레르기 치료에 tolerogenic 치료를 개발 하기 위해 채택 될 수 있습니다. 전반적으로, 표면에 분자 변화 하 여 알레르기 관련 liposome의 조작 맞춤형된 면역 반응과 알레르기-특정 셀에 약의 납품을 가능 하 게 마약 같은 분자를 캡슐화 합니다.
땅콩 알레르기의이 마우스 모델의 일반적인 한계는 콜레라 독 소와 땅콩에는 민감성 및 후속 땅콩 도전을 통해 i.p. 주입은 전적으로 인간 (예를 들어, 인간이 있는 땅콩 알레르기의 대표 구강 섭취 시 반응)입니다. 그러나,이 알레르기 모델 필드11,,1821, 현재 표준 이며 알레르기 질환의 분자 메커니즘을 조사 하 고 새로운 치료 접근을 개발 수 있습니다. 이러한 기존의 방법에 비해,이 입양 전송 모델 세 가지 주요 이점을 제공 합니다. 첫 번째 메모리 B 및 T-세포 더 직접 공부 알레르기에는 이다. 사실, 증거 지금 강하게 연루 메모리 B 세포 장기 알레르기18의 주요 근원으로. 둘째, 같은 수의 메모리 B 및 T-세포는 각 받는 사람 마우스에 이식, 때문에 알레르기 성 응답은 최소한 변수. 셋째,이 모델은 새로운 immunotherapies 테스트의 컨텍스트에서 유용한 개별 알레르기, 알레르기 성 응답을 공부 기회를 제공 한다. 이 모델의 한 흥미로운 응용 면역된 모델22에 공부 된 알레르기 성 응답 humanized 마우스 모델의 맥락에서 일반적인 접근을 사용 하는. 입양 전송 모델의 맥락에서 적용, 인간 답게 된 마우스 모델 강력한 수 하 확장 하 고 생체 내에서 의 B 및 T-세포 알레르기 환자에서 테스트.
항 체 질병 병 인 알레르기 모델에만 발생 하지 않습니다 하지만 또한에 B-세포 중재 면역 질환23. Adoptively 민감하게 splenocytes는 autoantigen 주어진 쥐에서 것 궁극적으로 사용 하는 동물의 수를 줄이면에 아주 유용할 보조의 여러 주사 받은 동물의 수를 최소화 및의 재현성을 증가 여러 질병 징후에 쥐의 동료 사이 응답. 한 예로 취약 마우스에 긴장 (C57BL/6, SJL, 및 AKR)는 접종 여러 번 아 세 틸 콜린 수용 체 (AChR) 병원 성 자가 개발 보조에 myasthenia gravis (EAMG)의 실험적인 면역 모델 될 것입니다. 이러한 자가 궁극적으로 인간 근육 피로/약점, 예금의 면역 글로불린, 보완 neuromuscular 접속점에와 심한 경우 병 적/죽음24immunopathological 기능으로 이어질. EAMG에서 질병 발생률 50-70%,이 가변성에 대 한 계정에 큰 동물 동료 하는 데 필요한 통계적 의미25,26에 도달 그래서 사이 넓게 변화 한다. 여기 설명 하는 방법을 궁극적으로 질병 발생률에 가변성을 감소 하 여 사용 하는 동물의 수를 줄일 것 이다. 앞서 언급 했 듯이, EAMG는 AChR + adjuvants (완전 한 Freund의 보조 제 및 불완전 한 Freund의 보조 제)와 여러 주사에 의해 유도 된 트리거 자동-항 체 반응. 이 메서드는 다중 수신 하는 동물의 수를 줄일 것 이라고 보조 제와 함께 주입. 마지막으로, 여러 예방접종 및 향상의 특성상, 그것은 상대적으로 예방 하 고 치료 트리 트 먼 트에 대 한 적절 한 치료 창 정의 어렵다. 이 방법은 항 체 반응과 질병 병 인 창, 보다 예측 만들기를 동기화 도움이 될 고 재현. 이 같은 논리는 항 체 중재 면역 질환, 류 마티스 관절염27등의 다른 많은 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국방부 (W81XWH-16-1-0302 및 W81XWH-16-1-0303)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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