Summary
描述了抗原脂质体纳米粒子的制备及其在体外和体内刺激 B 细胞活化的作用。一致和稳健的抗体反应导致了一个新的花生过敏模型的发展。抗原脂质体的生成协议可以扩展到不同的抗原和免疫模型。
Abstract
抗体反应为各种病原体提供了重要的保护性免疫力。仍然有很高的兴趣, 产生强大的疫苗接种抗体, 以及了解致病抗体反应如何发展在过敏和自身免疫疾病。生成强健的抗原特异抗体反应并不总是微不足道的。在小鼠模型中, 它通常需要用佐剂进行多轮免疫接种, 从而导致诱导抗体水平的变化很大。一个例子是在小鼠花生过敏模型, 其中更健壮和可重现的模型, 最小化鼠标数和使用佐剂将是有益的。这里介绍的是一个高度可重现的小鼠花生过敏性过敏症模型。这个新模型依赖两个关键因素: (1) 抗原特异性脾细胞过继转输从花生敏化小鼠转移到天真的受体小鼠, 使大量小鼠抗原特异记忆 B 和 T 细胞的数量正常化;(2) 随后以脂质体纳米颗粒显示主要花生过敏原 (Ara h 2) 的形式, 对受体小鼠进行了强多价抗原的增强。这个模型的主要优点是它的重现性, 最终降低了每项研究中使用的动物数量, 同时最大限度地减少了接受多重注射佐剂的动物数量。这些免疫原性脂质体的模块化组装提供了相对较容易适应其他过敏或自身免疫的模型, 涉及致病抗体。
Introduction
食物过敏影响了美国8% 的儿童, 并且在过去十年中增加了1的患病率。对花生过敏影响1% 儿童, 通常不超过2。虽然一些有前途的临床试验正在进行的治疗食物过敏, 包括口服免疫疗法 (OIT), 舌下免疫治疗 (狭缝) 和 epicutaneous 免疫治疗 (EPIT), 目前没有 FDA 批准的治疗策略对于脱敏花生过敏的个人3,4,5,6,7,8。因此, 过敏个体必须严格避免过敏原, 以避免过敏反应。许多问题仍然是关于敏感的途径和食物过敏发展的根本机制。
小鼠模型是研究过敏机制以及开发新的耐受性和脱敏疗法9,10,11,12的宝贵工具。这是特别正确的, 因为主要的花生过敏原 (艾拉 h 2;Ah2) 在人类也是主要的过敏原在几个描述的鼠标模型13,14。虽然小鼠花生过敏模型在研究敏感度和耐受性机制方面是非常宝贵的, 但缺点是它们可以是可变的, 需要使用佐剂。更有效的免疫原将是减少此类模型固有变异性的一种方法。由于 b 细胞是由多价抗原强烈激活, 显示过敏原的抗原脂质体是一个很好的选择, 因为他们有能力通过 b 细胞受体 (BCR) 激活 b 细胞, 同时也具有有效的属性通过非特异的抗原呈现细胞来启动 T 细胞室。
在这里, 我们描述了一个详细的协议共轭蛋白抗原脂质体纳米粒子使用一个简易的和模块化的策略。通过使用替代抗原, 抗 IgM Fab 片段, 我们证明了这种抗原脂质体在刺激 B 细胞活化中的作用。采用抗原脂质体显示 Ah2 抗原, 研制出一种新的小鼠赋敏模型。在这个模型中, 脾细胞从证实的花生过敏小鼠, 含有花生特异记忆 B 和 T 细胞, 被转移到天真的同类系小鼠。记忆抗体反应是通过注射脂质体与 Ah2 结合在受体小鼠中诱发的, 以诱导抗体对 Ah2。其次只有一个促进与可溶性 Ah2, Ah2-specific 抗体引起强烈的过敏反应, 当这些小鼠随后与 Ah2 挑战。由于过敏反应的小鼠反应以高度一致的方式, 并没有得到佐剂, 这种方法是一个可取的花生过敏模型, 结果表明, 它可能有效用在其他鼠标模型驱动的抗原导向过敏原和可能自身抗原。
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Protocol
将蛋白质与脂质结合在一起的一般方法主要基于早期的工作15。下面描述的所有动物程序都已通过北卡罗来纳大学教堂山机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。在花生过敏模型中使用的所有小鼠都是 BALB/cJ 女性从3周的年龄购买。阿尔伯塔大学动物护理和使用委员会 (ACUC) 已经批准了实验, 涉及使用小鼠脾进行体外分析, 从 C57Bl/6 小鼠至少6周的年龄。
1. 蛋白抗原与聚乙二醇脂的共轭
- 添加 3 g 交叉链接的葡聚糖凝胶珠与分馏范围的1,500–30,000 道尔顿 (Da) 到250毫升真空瓶。加入60毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 并不断搅拌与磁性搅拌棒。密封烧瓶并附着在真空中, 以在搅拌板上开始脱气, 至少1小时。
- 在一个1.0 厘米 x 30 厘米的玻璃色谱柱与周转瓶塞关闭, 添加 PBS 到列洗涤。打开周转塞子, 沥干柱子。洗涤后, 将脱毒气珠的泥浆添加到柱上。不断添加泥浆, 直到柱被包装到大约24厘米的珠子高度。
- 一旦列有一个 "头" 大约4–5厘米的 PBS 上方的填料珠子, 有以下步骤准备就绪。
- 通过测量一段足够长的管道来创建重力流虹吸, 使其到达列顶上方的架子上, 并创建一个在列底部附近掉落的循环, 并返回到列的顶部。在油管一端添加一个周转塞, 使油管的一侧打开。将开管末端放入500毫升的 PBS 瓶中, 放在柱子上方的架子上。
- 用周转瓶塞结束, 并附上10毫升注射器。打开油管线上的周转塞阀, 并通过管子抽出 PBS。一旦 PBS 达到三的方式通过油管, 快速取出注射器和增加周转塞到柱的顶部-液体应运行到列。
注: 该列顶部的 PBS 的 "头" 量应介于1到 3 cm 之间。清洗列的最小数量为3列卷。
- 根据其分子量 (MW) 确定链接到脂质的蛋白质 (摩尔) 量。
注: 山羊抗小鼠 IgM (自身为 IgG) 的 Fab 片段被用作 B 细胞多克隆刺激的通用替代抗原。因此, 山羊 IgG 的 Fab 片段有大约48道尔顿 (kDa) 的 MW, 并在商业上提供总数量1.3 毫克。因此, 要链接的蛋白质量是27.1 µmol。 - 确定感兴趣蛋白质的消光系数。如果未知, 使用分光光度计测量 280 nm 的蛋白质吸光度, 并将280值除以步骤1.4 中计算的摩尔数。
注: 山羊 IgG 在 280 nm 的消光效率为 64600 M-1。 - 为了确保去除微量含胺的缓冲液, 淡化在步骤1.1–1.3 中创建的柱上的蛋白质, 并将蛋白质组分收集到1.5 毫升微量离心管 (每馏分500µL)。
- 关闭连接到列顶部的周转塞阀, 然后移除列顶部。如果尚未打开, 请打开柱底部的周转塞阀, 等待 PBS 的 "头" 击中珠子顶部。
- 使用玻璃巴斯德移液器将感兴趣的蛋白质慢慢添加到珠子的顶部, 小心地将干扰降至最小的珠子顶部。
- 一旦蛋白溶液的 "头" 到达珠子的顶端,通过巴斯德移液器轻轻地添加1毫升 PBS。重复三次。添加 PBS 以创建 4–5 cm 的头部, 然后重复步骤1.3 以清洗该列。
注意: 如果确定不存在含有胺的缓冲区, 则可以跳过此步骤。
- 通过测量 A280 值和池的分数, 给出大约90% 的蛋白质回收率, 确定含有蛋白质的分数。
注意: 这通常稀释蛋白质 1.5-2 倍。在池化后确定蛋白质浓度。如有必要, 使用离心浓缩器将蛋白质浓缩在这个步骤中。 - 将异型交联剂的2.5 摩尔当量添加到蛋白质中。
- 首先, 重约5毫克的琥珀酰亚 3-(2-pyridyldithio) 丙酸 (SPDP, MW = 314 克/摩尔) 成微量离心管。要确定溶解 SPDP 的体积, 请将摩尔蛋白浓度乘以 250x, 生成100x 溶液, 在反应中给予2.5 摩尔过量。
注: 例如, 如果蛋白质浓度为50µM, 则需要 SPDP 12.5 mM 的溶液。对于5毫克的 SPDP, 这相当于1.27 毫升二甲基亚砜 (DMSO)。
- 首先, 重约5毫克的琥珀酰亚 3-(2-pyridyldithio) 丙酸 (SPDP, MW = 314 克/摩尔) 成微量离心管。要确定溶解 SPDP 的体积, 请将摩尔蛋白浓度乘以 250x, 生成100x 溶液, 在反应中给予2.5 摩尔过量。
- 将 SPDP 添加到感兴趣的蛋白质1:100 稀释。将反应在室温 (RT) 的振荡振动筛上放置约1小时。
- 要除去过量的 SPDP 并保护内源二硫键, 在随后的还原步骤中的蛋白质中, 平衡, 并洗涤在 pH 5.5 的 100 mM 醋酸钠 (显) 中1.1–1.3 步骤中创建的柱, 或创建一个相同的列, 仅用于此缓冲区。
- 在1小时孵育与 SPDP, 淡化的蛋白质在柱平衡100毫米显。以与步骤1.6 相同的方式执行此步骤, 除非使用 100 mM 显 (pH 5.5) 作为洗脱液。收集分数, 确定280, 并池的顶部分数。在 PBS 中清洗列。
- 在双蒸馏水中制备 2.5 M 的 DTT (MW = 154 克/摩尔) 溶液 (ddH2O)。将 25 mM DTT 添加到蛋白质的共用组分中5-10 分钟。
- 测量280的蛋白质, 并除以消光系数。另外, 确定343。根据蛋白质 (a280) 和链接器 (a343) 的摩尔浓度计算链接比率。
注: 如果使用下载分光光度计, 请关闭 A340 自动校准。A343测量值表示由 DTT 从 SPDP 交叉链接器中移除的吡啶 2-硫酮组 (消光系数 = 7550 M-1) 的吸光度。链接器的摩尔比率: 1.2–1.5 的蛋白质比通常达到当执行反应与2.5 摩尔过量的 SDPD 在广泛的蛋白质范围。 - 如上文所述, 在 PBS 中洗涤的列上运行共用分数。收集分数, 确定280和池顶部分数。通过 A280 后, 确定蛋白质的浓度。
- 制备 DSPE (2000)-马来酰亚胺 (12-二硬脂酸甘油酯-锡-glycero-3-phosphoethanolamine-n-甲氧基 (聚乙二醇)-2000)-马来酰亚胺。这将被添加到蛋白质在10:1 摩尔比率。准备100x 库存的 DSPE (2000)-马来酰亚胺, 以达到所需浓度。
- 例如, 如果在步骤1.14 后蛋白质浓度为10µM, 则准备 DSPE-PEG (2000)-马来酰亚胺 (10 mM) 的库存。仔细权衡 DSPE (2000)-马来酰亚胺 (MW = 3000 克/摩尔), 并添加适量的 DMSO。多轮温和的涡旋和 sonicating 可能使它完全溶解。
- 确定步骤1.14 中馏分的总体积, 并将溶液仔细转移到小 (10-25 mL) 圆底烧瓶 (RBF) 中。添加适量的 100x DSPE (2000)-马来酰亚胺对蛋白质, 以达到 1x, 10 倍摩尔过量, 最终浓度。轻轻旋流溶液, 确保 DMSO 完全分散。
- 在密封的 RBF 中, 在氮气下一夜之间运行反应。使用橡胶隔膜并放置在通风罩中。
- 用 20 G 针在连接到真空管末端的3毫升注射器上刺穿隔膜, 并打开真空, 以消除大气层。
- 用氮气代替大气层。填充一个气球附加到3毫升注射器切成一半与氮气和附加 20 G 针。用氮气刺穿隔膜以填充圆形底部烧瓶内的气氛。重复去除大气层, 再次更换氮气, 并将氮气气球留在一夜之间。
- 在一个1.0 厘米 x 50 厘米的玻璃色谱柱中, 准备一个单独的交联的葡聚糖凝胶珠柱, 其分馏范围为 4,000–150,000 Da (根据步骤 1.1-1.3)。
- 第二天, 从步骤1.17 中准备好的圆底烧瓶中取出蛋白质, 并在交叉链接的葡聚糖凝胶珠柱上运行 (按照步骤1.6 中使用的方法) (从步骤 1.18)。
注: 要加载到列的总金额应不超过2毫升。如果使用较大的反应, 则拆分为两个并在单独的列上运行或在较大直径的列上运行。- 收集分数, 确定280, 池顶部分数, 并确定蛋白质的浓度。脂质的存在不会影响测量结果。
- 将脂质挂钩蛋白的最终聚集组分储存在4摄氏度, 直至使用完毕。
2. 脂质体制备
- 称量油脂: DSPE (2000) (12-二硬脂酸甘油酯-锡-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[甲氧基 (聚乙二醇)-2000, MW = 2805.5 克/摩尔;胆固醇 (3 b-羟基-5-cholestene, 5-Cholesten-3 b ol), MW = 386.7 克/摩尔;和苏州杜邦 (12-二硬脂酸甘油酯-锡-glycero-3-卵磷脂), MW = 790.1 克/摩尔. 创建5毫克/毫升溶液的苏州杜邦, 4 毫克/毫升胆固醇溶液和2毫克/毫升溶液的 DSPE PEG (2000) 在氯仿。
- 确保脂质体的摩尔比率为: 57% 苏州杜邦、38% 胆固醇和 5% DSPE (2000), 如表 1所示。
注意: 控制脂质体上抗原的数量是很重要的, 通常范围从0.01–0.1%。在表 1中, 使用了与聚乙二醇脂相关联的山羊抗小鼠 IgM 片段的0.1%。考虑到在步骤1.15 中加入蛋白质的 DSPE PEG (2000)-马来酰亚胺的10倍摩尔过量, 以确保聚乙二醇脂的总用量不超过 5%, 这一点至关重要。 - 在创建用于挤出的脂质时, 考虑最终的脂量 (µmol)。参见表 1 , 以1.25 µM 总脂浓度为例, 计算产生脂质体的摩尔脂浓度。
- 一旦计算出每种油脂的正确用量, 就可以将所有的脂质组合成12毫升的硼硅玻璃试管。
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小心地吹掉氯仿。
- 使用油管和3毫升注射器用针, 准备在步骤 1.17.1, 小心地吹脱氯仿在管内氮气。用另一只手旋转管子时, 轻轻吹出溶液中的氮气流。小心, 尽量减少飞溅或导致液体运行的方式在管的一侧, 因为它可能是更困难的, 使这成为解决方案在下一步。
- 在每根管子中加入100µL 的 DMSO, 并 lyophilize 此溶液过夜。用非静态实验室擦拭, 用橡胶带固定, 并冻结-80 摄氏度, 覆盖管顶部。
3. 脂质体挤出
- 加入含有脂质链接蛋白的1毫升 PBS, 包含脂质的12毫升管。在超声水浴中油脂实验约三十年代至1分钟的解决方案。在每轮之间休息5分钟或更长时间, 重复3–4次。
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按照制造商的指示准备挤出机。
- 将过滤器支架添加到内部膜支架上, 在石蜡膜上放置几个滴 (每µL 10 个)。使用镊子, 抓住过滤器支持的边缘, 并蘸它在10µL 下降。
- 将过滤器放在 O 形圈内。对双方都这样做。使用镊子, 抓住0.8 µm 过滤器的边缘和蘸在10µL 下降和外套外的 O 型圈与 PBS。将0.8 µm 过滤器轻轻地放在 O 形圈上, 以便过滤器不会过度挂起内部膜支架。
- 将挤出机加热块放在热板上, 以预加热挤出机。将热板切换到低, 使挤出机加热块达到所需的温度。为了避免蛋白质聚集的潜在问题, 不要加热块超过37摄氏度。
- 将超声处理样品加载到挤出机中的一个挤出注射器中。将挤出机注射器放入挤出机的另一端。确保空注射器柱塞设置为零。当脂质通过聚碳酸酯0.8 µm 膜挤出时, 空注射器将填充。尽量避免通过膜来回传递气泡。
- 将完全组装好的挤出机放入加热块中。将充满油脂的注射器的柱塞轻轻推入空注射器。根据脂质的浓度, 这将是很难推动通过。重复20x。
- 从加热块中取出完全组装的挤出机。慢慢地从挤出机中取出填充的注射器, 一定要收集去除时可能漏掉的任何油脂。将脂质体放入干净的小瓶中。重复步骤3.4–3.6 使用聚碳酸酯0.2 µm 和0.1 µm 膜。
- 在 PBS 中创建一个 0.7 x 50 cm2交联琼脂糖珠柱, 其分离范围为 0.7-10 兆道尔顿 (MDa) 平衡。添加脂质体并在步骤1.6 中运行。含有脂质体的馏分在 250–400 nm 范围内会降低光的透射。
- 将脂质体储存在4摄氏度, 不要结冰。
4. 钙通量监测抗原脂质体对 B 细胞活化的作用
- 安乐死小鼠由二氧化碳 (CO2) 或异氟醚过量, 根据机构标准操作程序。宫颈脱位证实小鼠安乐死。
- 使用70% 乙醇消毒手术器械和小鼠胴体。使用10厘米长, 0.8 毫米尖端, 弧形虹膜钳, 以分离皮肤覆盖胸腔从肋骨笼。使用10厘米长, 直解剖剪刀做一个远端切口与双边切口。
- 使用弧形虹膜钳和解剖剪刀从腹腔提取脾脏。除去脾脏周围的脂肪组织, 然后将其放置在一个15毫升聚苯乙烯锥形管填充 RPMI1640 培养基包含1% 胎儿小牛血清 (FCS) 和青霉素-链霉素。
- 转移脾脏和媒体在一个40µm 细胞过滤器安装在一个50毫升锥形管。使用3毫升注射器柱塞的橡胶末端, 轻轻粉碎脾脏。用介质清洗40µm 细胞过滤器。重复这个过程, 直到只有脂肪组织留在40µm 细胞过滤器。用3-5 毫升的培养基冲洗筛, 以增加细胞恢复。
- 在室温下离心细胞匀浆 300 x g , 5 分钟。离心后, 丢弃上清液, 并将10毫升的1x 红细胞裂解缓冲液添加到颗粒中。移液器向上和向下, 在 rt 处保持最小值, 然后在 rt 中离心 300 x g 5 分钟。
- 丢弃上清和重悬红细胞耗尽脾细胞在10毫升的培养基。使用血细胞计数器或其他细胞计数设备确定总细胞数。如上文所述, 离心沉淀细胞。
注: Indo-1 加载脾细胞所需的理想最终浓度为 10–20 x 106细胞/毫升, 但可使用较低浓度的细胞。 - 在钙通量负载缓冲液中重悬脾细胞 15 x 106细胞/毫升 (RPMI1640 培养基含有 1% FCS, 10mM 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 1mM 氯化镁 (氯化镁2), 1mM 乙二醇-双 (β-氨基乙基醚)-n-, n-, n ', n-'-四乙酸酸 (EGTA), 和5% 青霉素-链霉素)。添加1.5 µM Indo-1 从1毫米 DMSO 库存溶液, 反转管几次混合。免受光线的保护, 在37摄氏度的水浴中孵育细胞30分钟。
- 30分钟孵育后, 加入5x 的钙通量加载缓冲液量。在室温下离心 300 x g , 7 分钟。
- 对于 B 细胞的门控, 染色细胞与1:200 反老鼠 CD5-PE 和反老鼠 1:200 B220-PE/Cy7 在0.5 毫升的加载缓冲器在4°c 20 分钟, 保护从光。
- 在钙助焊剂负载缓冲液中洗涤脾细胞, 在室温下离心 300 x g , 7 分钟. 在 10–20 x 106细胞/mL 的钙助焊剂运行缓冲液中重悬细胞 (汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 包含 1% FCS, 1 mm 氯化镁2和 1 mm氯化钙 (CaCl2))。储存在冰上, 保护免受光, 直到准备运行流式细胞仪。
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设置流式细胞术与未染色和单一染色控制的补偿。
- 运行染色的单元格以适当地设置门 (参见图 2A)。设置 Indo-1 (紫色)与Indo-1 (蓝色) 图解, 调整 Indo-1 通道中的电压, 将细胞染色置于45–60°的斜坡上, 以最大程度地提高信号: Indo-1 紫罗兰的噪声比: B 细胞刺激后的蓝色变化率。
注: 确保电压不太高, 这样很大比例的单元格 (> 5%) 就会出现在绘图顶部。 - 创建一个对角门, 封装的情节的左上部分 (紫罗兰+蓝), 这样, 没有刺激 < 10% 的细胞是在门, 这应该理想地增加到 > 75% 以下刺激。
- 运行染色的单元格以适当地设置门 (参见图 2A)。设置 Indo-1 (紫色)与Indo-1 (蓝色) 图解, 调整 Indo-1 通道中的电压, 将细胞染色置于45–60°的斜坡上, 以最大程度地提高信号: Indo-1 紫罗兰的噪声比: B 细胞刺激后的蓝色变化率。
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将0.5 毫升的细胞添加到一个封闭的5毫升圆底聚苯乙烯管 (荧光活化细胞分类 (流式) 管), 并在水浴中将细胞加热至37摄氏度。将流式管放入连接到再循环水浴的37摄氏度水套室中。
- 在流式细胞仪上的水套中运行管, 并启动采集, 不存储数据, 在大约5,000–10,000 事件/秒。一旦细胞稳定 (15–30 s), 启动数据采集和收集数据至少十年代建立背景。
- 在十年代马克, 迅速从流式细胞仪中取出管, 添加刺激 (5-50 毫米抗原脂质体在2–20毫升), 脉冲涡, 并返回流式细胞仪管。通过这段时间保持数据采集和存储, 并收集数据的最小。
- 在相应的分析软件的动力学功能下分析数据。
5. 花生提取物的制备
- 将花生粉混合在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与 1 M 氯化钠 (氯化钠) 的 1:5 (wt) 比值中, 提取花生蛋白。混合溶液在 2 h 在 RT 的磁力搅拌板, 同时保持在 pH 8.5。
- 3000 x g离心溶液, 45 分钟, 4 摄氏度。醒酒和过滤器-通过0.4 µm 过滤器依次消毒上清液, 后跟0.2 µm 过滤器。以牛血清白蛋白 (BSA) 为标准, 以二辛可宁酸 (BCA) 测定蛋白质浓度。
- 将50毫米 dithiothreitol (DTT) 的花生蛋白样本减少并变性在 pH 值为8.4 的含烷基硫酸锂的缓冲液中, 使还原剂的最大活性和热量在70摄氏度下达到10分钟。
- 在双三4–12% 预制聚丙烯酰胺凝胶上运行10µg 变性花生蛋白, 设计出最佳分离梯度凝胶, 分子量预染色标准。
- 染色与 disulfonated 三苯甲烷和脱色与 ddH2o. 识别已知的主要花生过敏原 1, 2 和3在提取制剂中的凝胶。艾拉 h 1 出现在 63 kDa, 艾拉 h 2 应显示为两个异构体在17和 19 kDa, 和艾拉 h 3 出现在 37 kDa (酸性亚基)。
6. 小鼠对花生的敏感度
- 在1毫升超纯水中重悬1毫克霍乱毒素。制备200µL 稀释花生提取物, 含有2毫克花生蛋白和10µg 霍乱毒素的 PBS。
- 通过口服灌胃到每个4–5周老 BalB/cJ 雌性鼠标, 管理200µL 含有霍乱毒素 (2 毫克花生蛋白和10µg 霍乱毒素) 的花生提取物。每周重复一次三周 (即,天0、7和 14)。
- 通过口服灌胃对每只老鼠在第四周 (即,日 21) 管理300µL 稀释花生提取物 (含5毫克花生蛋白和10µg 霍乱毒素)。
7. 用花生萃取物挑战老鼠
- 在28天, 准备花生提取物到1毫克/毫升在 PBS 的最终浓度。使用直肠温度计测量基线体温 (约37.5–38.5 °c)。通过腹腔 (ip) 注射, 管理200µL (200 µg) 花生提取物。
- 注射后用直肠温度计测量体温每15分钟1小时。体温的下降表明对花生过敏。
注意: 低体温症是小鼠过敏反应的标志。这一挑战将证明老鼠对花生过敏。通常情况下, 90% 的 Balb/cJ 小鼠接受敏化协议在挑战中发展过敏反应, 其特征是至少有一个1°c 温度下降。
8. 脾细胞对过敏小鼠的分离和领养转移
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将脾细胞与天真和花生过敏的小鼠隔离开来。
- 在30天, 安乐死两个天真和确认花生过敏小鼠通过管理3升/分钟 CO2在一个气体室。双侧开胸术确认小鼠安乐死。使用70% 乙醇消毒手术器械和小鼠胴体。使用镊子将覆盖胸腔的皮肤从肋骨的笼子中分离出来。使用直解剖剪刀做一个双侧切口打破左和右肋骨。
- 用镊子和解剖剪刀从腹腔提取脾脏。在放入聚苯乙烯15毫升锥形管之前除去脾脏周围的脂肪组织, 填充10毫升 RPMI 1640 中。
- 在无菌层流罩中, 将脾脏和培养基倒入35毫米聚苯乙烯培养皿中。在分离培养皿和培养基中保持天真和过敏脾细胞。使用灭菌钳和解剖剪刀将脾脏切成三块, 再返回培养皿。
- 使用两个玻璃显微镜幻灯片的粗糙, 磨砂边缘, 轻轻地匀质 (在 RPMI) 脾脏片段, 直到白色组织保持在幻灯片之间。在组之间更改幻灯片。
- 通过安装在50毫升锥形管上的70µm 细胞过滤器, 从培养皿中转移细胞匀浆。通过过滤器与1毫升注射器的柱塞传递剩余的脾脏片段。用5毫升的 RPMI 冲洗筛网, 使细胞恢复最大化。将滤液转移到聚苯乙烯15毫升锥形管和离心机 (450 x g, 10 分钟, RT)。
- 吸出上清液, 在2毫升红细胞裂解缓冲液中添加重悬细胞颗粒 (0.83% 氯化铵10毫米三缓冲液, pH 7.2)。在 rt 中混合和孵育最小值. 添加10毫升的 PBS-2%fbs 和离心机在 300 x g 7 分钟在 rt。
- 再用12毫升 PBS-2%fbs 洗涤细胞, 完全除去残留的氯化铵, 在 300 x g处离心7分钟. 在2毫升的 RPMI 1640 培养基中重新悬浮细胞颗粒。使用血细胞计数器或自动血液分析仪计数细胞。
- 使用 27 G, 5/8 英寸针1毫升胰岛素注射器, 静脉注射注射 15 x 106过敏或天真脾细胞提取如上所述 (在200µL)通过尾部静脉成天真 (unsensitized) 小鼠。
9. 用艾拉 h 2 抗原脂质体注射小鼠
- 在 2.5 mM 脂质中制备含有 0.1% Ah2 的 Ah2 脂质体。为了计算蛋白质浓度, Ah2 的消光系数为 1.5万 M-1。在无菌 PBS 中稀释脂质体至300µM。
- 后天转移 (31 天) 的过敏或天真的脾细胞, 静脉注射200µL 的 PBS 或 Ah2 抗原脂质体 (300 µM) 包含总共1.38 µg Ah2通过BALB/cJ 小鼠的尾部静脉在步骤中收到脾细胞8.2。
10. 用艾拉 h 2 对小鼠的刺激和挑战
- 注射后的两周 Ah2 脂质体, 在45天, 使用4毫米动物柳叶刀收集50–200µL 的血液从小鼠的颌下腺结。在没有肝素的血清分离管中收集血液;用离心 6000 x g分离血清15分钟. 使用收集的血清以后测量抗原特异抗体。
- 在46天, 注射脂质体的小鼠后两周 (步骤 9.2), 通过 ip 注射200µL PBS 或200µg 可溶性 Ah2 (纯化如前16所述) 促进小鼠。
- 在60天, 收集50-200 µL 的血液从小鼠的颌下腺结, 并处理血液如前所述。
- 在61天, 挑战每组小鼠的 ip 注射200µL 300 µg 可溶性 Ah2。测量体温与直肠探针每15分钟, 如第7节。
11. 通过 ELISA 定量测定艾拉 h 2 特异性 IgE 和 IgG1
- 将96孔酶联免疫吸附试验 (ELISA) 兼容板与100µL HSA-DNP (24-硝基苯基半抗原共轭到人血清白蛋白, 20 µg/毫升) 用于标准曲线或 Ah2 (5 µg/毫升), 用于在步骤10.1 和10.3 中收集的血清样本, 稀释在涂层缓冲液 (50 mM 碳酸盐-碳酸氢钠缓冲液, pH 9.6), 在4摄氏度过夜或37摄氏度 > 1 小时。
- 洗涤三次与200µL pbs t (pbs 0.05% Tween-20) 和块水井与200µL PBS t 包含 2% BSA 在37摄氏度为 > 2 h。
- 对于 Ah2-specific ige ELISA, 添加50µL ige-抗 DNP 标准 (2–0.002 µg/毫升, 准备从1:2 系列稀释) 或小鼠血清样品 (1:20 稀释) 和孵化过夜4摄氏度。对于 Ah2-specific IgG1 ELISA, 添加100µL 纯化 IgG1-anti-DNP 标准 (2–0.002 µg/毫升, 从1:2 系列稀释) 或小鼠血清样品 (1:500 稀释) 和孵育过夜在4摄氏度或 1 h 在37摄氏度。
- 用200µL 洗涤三次。对于 Ah2-specific ige ELISA, 添加100µL 绵羊抗小鼠 IgE (0.5 µg/毫升) 和孵育37摄氏度1小时。对于 Ah2-specific IgG1 ELISA, 添加100µL HRP 山羊抗鼠 IgG1 (稀释1:40,000 在 PBS-T-2%bsa)。在37摄氏度孵育1小时。
- 用200µL 洗涤三次。对于 Ah2-specific IgE ELISA, 添加100µL 生物素化-驴抗绵羊 IgG (0.5 µg/毫升), 孵育37摄氏度45分钟。对于 Ah2-specific IgG1 ELISA, 请跳到步骤11.7。
- 用200µL 洗涤三次。对于 Ah2-specific IgE ELISA, 添加100µL 中立充电亲和素-辣根过氧化物酶 (例如, NeutrAvidin-HRP, 0.3 µg/毫升) 和孵育37摄氏度30分钟。
- 添加100µL 33 ', 55 '-Tetramethylbenzidine (TMB) 基底, 孵育10-15 分钟, 或直到样品变成深蓝色, 然后添加100µL TMB 停止解决方案。读 450 nm 的盘子。
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Representative Results
与 DSPE (2000) 的兴趣蛋白的共轭可以通过运行减少显示与游离蛋白相比, 分子量的增加来证明。图 1A显示了抗鼠 IgM F (ab) 片段共轭 DSPE 的代表性凝胶, 它显示了变性蛋白的 kDa bandshift。请注意, 大约50% 的蛋白质似乎被修改, 这是预期的, 因为1:1 化学计量学是在单体碎片, 这是一个沉重的和轻链的一个。图 1B显示了 Ah2 共轭到 PEG-DSPE 的代表性凝胶。为了评估抗原脂质体刺激的 B 细胞钙通量, 有两件事情是至关重要的: (1) 仪器设置被调谐, 以查看在 Ca2 +绑定 (紫色) 和未绑定 (蓝色) 形式的 Indo-1 荧光比率的差异和 (2) 适当的门控策略用于评估 B 细胞活化。图 2A显示了基于流式细胞仪的钙通量测定的浇口方案。活淋巴细胞被门控在 ssc-a与fsc-a (左面板), 双峰在 FSC-w与SSC-w 图 (中间板), 和 B200+CD5- B 细胞从 CD5-PE vs B220-PE/Cy7 图 (右面板) 中选择。图 2B显示了 Indo-1 (紫罗兰) vs Indo-1 (蓝色) 荧光随时间的比值。注意, 在这些检测中, f (ab) 和 f (ab ')2的总蛋白浓度相同, 证明抗原脂质体在刺激 B 细胞活化方面具有优异的能力。在制备花生提取物后, 在 SDS 页凝胶上运行等分, 以确定提取物中的艾拉 h 1、2和3的相对数量。图 3显示了与纯化 Ah2 一起运行的花生萃取的代表性凝胶。图 4显示了整体养花生过敏小鼠模型的示意图, 包括对花生的初始敏化、对花生的挑战、脾细胞的分离和领养转移、脂质体注射、血液抽放以及 Ah2 的刺激, 以及挑战 Ah2。Ah2-specific IgE 和 IgG1 ELISAs 被运行以量化免疫球蛋白在血清中, 如图 5A和B所示。具有被赋予的敏感度的小鼠 Ah2 将有 Ah2-specific IgE 和 IgG1 在他们的血清。在 Ah2 挑战期间记录的体温如图 5C所示;过敏小鼠在挑战后体温降低, 而天真小鼠的体温保持一致。图 6显示了在挑战中与花生过敏小鼠相比的天真小鼠的照片。
图 1: 抗小鼠 IgM F (ab) 的代表性凝胶和 Ah2 共轭到 PEG DSPE.(a、 B)SDS 页分析 (A) 山羊抗鼠 IgM F (ab) 片段和 (B) Ah2 前后共轭到 PEG DSPE。山羊抗小鼠 IgM 和 Ah2 的分子量分别约为48和 18 kDa。经过修改后, 两种蛋白质的分子量 (约 2.5 kDa) 会明显地被观察到。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 代表性的浇口策略、钙通量结果和分析.(a) 通过以下门控策略分析细胞: 活淋巴细胞 (fsc-a vs. ssc a)、单细胞 (fsc与ssc-w) 和 B 细胞 (B220+CD5)。b细胞的 Indo-1/Ca2 +通量响应 (紫罗兰色与蓝色)。显示的是在相同的蛋白质浓度 (2.5 µg/毫升) 和缓冲刺激的细胞作为控制的抗 igm Fab 片段脂质体和抗 igm F (ab ')2的钙通量。请注意, 在10-22 秒之间是添加刺激, 因此, 在此期间没有获取数据。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 有代表性的凝胶显示花生提取物和 Ah2.花生提取物含有几种蛋白质, 包括过敏原 h 1、2、3和 6, 与 Ah2 出现的两种亚型相比。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 领养转移协议示意图.天真的 BALB/cJ 小鼠被花生提取物 (PN) 和霍乱毒素 (CT) 敏化, 随后对 PN 进行了挑战。脾细胞从确诊的过敏小鼠被隔离并转移到天真小鼠。小鼠后来被引上免疫原性艾拉 h 2 脂质体或 PBS, 然后与可溶性 Ah2。最后, 老鼠受到 Ah2 的挑战来监测过敏反应。45和60天收集的血液用于定量 Ah2-specific 免疫球蛋白。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 免疫原性艾拉 h 2 脂质体增强赋予记忆过敏反应.血清分离前 (45 天) 和后 (天 60) 促进与 PBS 或200µL 300 µM 免疫原性 Ah2 脂质体测量 Ah2-sepcific IgE (A) 和 IgG1 (B)。单个小鼠用指示中位数的线表示。在32天收到过敏脾细胞和 Ah2 脂质体的小鼠, Ah2-specific IgE 和 IgG1 的水平显著升高。Ah2challenge (C) 后记录体温, 在不同治疗组测量过敏反应。平均体温用 SEM 描述. 天真: pbs (天真的脾细胞和 pbs 质数), 过敏: pbs (确诊过敏脾细胞和 pbs 质数), 过敏: Ah2 (确认过敏脾细胞和 Ah2immunogenic 脂质体质数)。* p < 0.05, *** p < 0.01, *** p < 0.001, *** *** p < 0.0001 由不配对的2尾学生t测试确定。请注意, 这些结果代表两个独立实验。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6: Ah2 挑战期间观察到的过敏症状.天真的老鼠保持活跃, 脚上有粉红色的皮肤 (A, C)。过敏小鼠的活动减少, 经常驼背, 有吃力的呼吸和经验紫绀, 表明在他们的脚 (B, D) 深色的紫色肤色。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| M w | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| 苏州杜邦 | 胆固醇 | PEG-DSPE | 过量 PEG-DSPE | 一个IgM-PEG-DSPE | 总 | |
| 摩尔比率 | 57 | 38 | 3。9 | 1 | 0。1 | 100.00 |
| 质量 (毫克) | 0.56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| m摩尔 | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| 毫升 | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| 浓度 (毫克/毫升) | ||||||
| 苏州杜邦 | 5 | |||||
| 胆固醇 | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| 一个IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
表 1: 创建1.25 µM 总脂质体的计算.山羊抗鼠 IgM F (ab) 片段脂质体计算表实例。
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Discussion
这里概述的方法是一个通用的协议的蛋白质共轭的脂质, 使在脂质体纳米颗粒的蛋白质显示。对于非常大的多亚基蛋白质, 此协议可能有有限的效用。理想的方法是引入一个特定于站点的标签, 使之能够使用双正交化学连接策略。如果表达蛋白质制备, 这可以使用可用的特定于站点的策略17, 和广泛的功能组在聚乙二醇脂质的末端是商业可用的。因此, 本议定书的目的是将与天然来源分离的蛋白质连接起来, 并可供广泛的科学家使用, 而不一定熟悉化学和生化转变。
运行钙通量实验的一个关键方面应该强调的是, 细胞不应该被激活之前运行它们在流式细胞仪。如果没有严格使用无菌技术, 这将考虑到来自活化细胞的高背景信号 (Indo-1 荧光在紫色通道中向其发射倾斜)。同样, 在运行检测之前, 细胞应保持在冰上, 以避免 Indo-1 通道中的背景信号异常水平。同样重要的是, 要确保细胞在获取之前通过流式细胞术和在数据采集过程中在整个刺激中被加热。如果单元格在数据采集过程中不保持在37摄氏度, 则可以预期单元格不会最大程度地响应。由于抗原特异的 b 细胞存在于小鼠中的极小数量, 使用替代抗原来刺激小鼠的所有 B 细胞是理想的。尽管有许多转基因小鼠菌株可用于表达抗原特异的 B 细胞, 但这种技术的目的是使普通用户能够验证其使用野生型小鼠制作抗原脂质体的能力。为实现这一目标, 抗小鼠 IgM 的 Fab 片段与脂质相关, 并配制成抗原脂质体, 以多克隆方式交叉连接 B 细胞受体 (BCR)。值得注意的是, 它以前已经证明, 这种方法可以用来刺激人类 B 细胞10使用适当的抗人 IgM Fab 片段, 这是重要的, 因为它是不可能访问大量的抗原特异的人 B 细胞。在这些研究中, 抗原脂质体刺激 B 细胞活化的功效, 说明其增强了诱导钙通量的能力, 与同等数量的抗小鼠 IgM F (ab ') 2 片段相比。
抗原脂质体的使用使 BALB/cJ 小鼠对花生的敏感, 将脾细胞从过敏小鼠转化为天真小鼠, 用 Ah2 脂质体注射宿主小鼠, 并用 Ah2 挑战它们。该模型可重现小鼠组内抗体水平和过敏反应。在小鼠的花生特异性抗体的开发中, 记忆 B 和 T 细胞反应是非常重要的。此外, 最近的一项研究表明, 记忆 B 细胞在小鼠体内重新填充血浆细胞, 维持高抗原特异 IgE 水平;因此, 过敏原特定记忆 B 细胞是治疗干预的一个有吸引力的目标18。这里描述的模型现在允许一个机会直接瞄准 Ah2-specific 内存 B 细胞, 而不是一个免疫抑制方法使用硼替佐米耗尽整个血浆细胞曲目19。另一种对抗过敏的方法是诱导 T 细胞室中的耐受性。一种潜在的策略是在脂质体中封装公差诱导佐剂。以前, 封装雷帕霉素的纳米粒子被用来诱导 Tregs 和减少自身免疫疾病20。这种方法可用于开发耐受性治疗花生过敏症。总的来说, 通过共轭分子对表面的过敏原特异性脂质体的操作可以实现量身定制的免疫反应, 并且封装类似药物的分子能够将药物输送到过敏原特定的细胞。
这个小鼠花生过敏模型的一般局限性是,通过ip 注射对花生进行过敏和随后的花生挑战, 并不完全代表人类的花生过敏 (例如,人类有口服时的反应)。然而, 这种过敏模型是目前的标准在领域11,18,21, 并允许我们调查过敏性疾病的分子机制和开发新的治疗方法。与这些传统方法相比, 这种领养转移模型提供了三个主要优势。第一, 它使记忆 B 和 T 细胞特定的过敏原要更直接地研究。事实上, 证据现在强烈地把记忆 B 细胞作为长期过敏的主要来源18。其次, 由于相同数量的内存 B 和 T 细胞被植入到每个接收鼠标, 过敏反应是最小的变量。第三, 这个模型提供了一个机会, 研究过敏反应的单个过敏原, 这是有用的背景下, 测试新的免疫疗法。这个模型的一个有趣的应用是在一个人性化的小鼠模型中使用一般方法, 在免疫模型22中对过敏反应进行了研究。应用在收养转移模型的背景下, 人性化的小鼠模型可能是一种强大的方法来扩大和体内检测过敏患者的 B 和 T 细胞。
抗体病发病机制不仅发生在过敏模型, 而且在 B 细胞介导的自身免疫性疾病23。过继转输从小鼠体内转移致敏脾细胞的抗原最终将对降低使用的动物数量起到很大的作用, 最大限度地减少接受多重注射佐剂的动物数量, 提高多种疾病适应症中小鼠群的反应。一个例子是在实验性重症肌无力 (EAMG) 的自体免疫模型中, 易感小鼠株 (C57BL/6、SJL 和 AKR) 在佐剂中使用乙酰胆碱受体 (人权咨询理事会) 多次接种, 以发展致病自身抗体。这些自身抗体最终导致免疫病理功能存在于人类, 如肌肉疲劳/虚弱, 免疫球蛋白的沉积, 和肌肉连接的补充成分和在严重的情况下发病率/死亡24。在 EAMG, 疾病发病率在50–70% 之间有很大的差异, 因此要考虑到这种变异性, 大型动物群需要达到统计学意义25,26。这里描述的方法将最终减少使用的动物数量, 减少疾病发病率的变异性。如前所述, EAMG 是由多次注射与人权咨询理事会 + 佐剂 (完整弗氏的辅助和不完全弗氏的佐剂) 诱发的, 以触发自动抗体反应。这种方法可以减少接受多次注射佐剂的动物数量。最后, 由于多重免疫接种和增强的性质, 为预防和治疗治疗确定适当的治疗窗是比较困难的。这种方法将有助于同步抗体反应和疾病发病机制窗口, 使其更可预测和重现性。这种相同的逻辑可以应用于许多其他小鼠模型的抗体介导的自身免疫性疾病, 如类风湿关节炎27。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国防部 (W81XWH-16-1-0302 和 W81XWH-16-1-0303) 的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
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