Summary
Beskrivs är utarbetandet av antigena liposomalt nanopartiklar och deras användning i stimulerande B-cells aktivering in vitro- och in-vivo. Konsekvent och robust antikroppssvar ledde till utvecklingen av en ny jordnötsallergi modell. Protokollet för att generera antigena liposomer kan utvidgas till olika antigener och immunisering modeller.
Abstract
Antikroppssvar ge kritiska skyddande immunitet mot ett brett spektrum av patogener. Det finns fortfarande ett stort intresse i att generera robusta antikroppar för vaccination samt förstå hur patogena antikroppen Svaren utvecklar allergier och autoimmuna sjukdomar. Generera robusta antigen-specifika antikroppen svaren är inte alltid trivial. I musmodeller kräver det ofta flera rundor av vaccinationer med adjuvant som leder till en hel del variation i nivåerna av inducerade antikroppar. Ett exempel är i musmodeller av jordnötter allergier där mer stabila och reproducerbara modeller som minimerar mus nummer och användning av adjuvant skulle vara fördelaktigt. Presenteras här är en mycket reproducerbara musmodell av jordnötsallergi anafylaxi. Denna nya modell bygger på två viktiga faktorer: (1) antigen-specifika splenocytes överförs adoptively från en jordnöt-sensibiliserad mus till en naiv mottagarens mus, normalisera antalet antigen-specifika minne B - och T-celler över ett stort antal möss; och (2) mottagaren möss är därefter boostade med en stark multivalenta immunogen i form av liposomalt nanopartiklar visar det stor jordnöt allergenet (Ara h 2). Den stora fördelen med denna modell är dess reproducerbarhet, vilket i slutändan minskar antalet djur som användes i varje studie, samtidigt minimera antalet djur flera injektioner av adjuvans. Modulär montering av dessa immunogent liposomer ger relativt lättköpt anpassningsförmåga till andra allergiska eller autoimmuna modeller som innebär patogena antikroppar.
Introduction
Matallergi påverkar 8% av barnen i USA, och har ökat i prevalens under senaste decenniet1. Allergi mot jordnöt drabbar 1% av barn och är inte vanligtvis urvuxna2. Även om flera lovande kliniska prövningar pågår för behandling av födoämnesallergi, inklusive orala immunterapi (OIT), sublingual immunterapi (SLIT) och epikutan immunterapi (EPIT), finns det för närvarande ingen FDA-godkända behandlingsstrategier för okänsliggöra jordnöt-allergiska personer3,4,5,6,7,8. Allergiska personer måste därför strikt undvika allergener för att undvika anafylaxi. Många frågor återstår när det gäller rutter av sensibilisering och underliggande mekanismer av mat allergi utveckling.
Musmodeller är ett värdefullt verktyg för studerar mekanismer för allergi samt utveckla nya tolerogena och hyposensibilisering terapier9,10,11,12. Detta gäller särskilt eftersom det stor jordnöt allergenet (Ara h 2; Ah2) hos människa är också det dominerande allergenet i flera beskrivs mus modeller13,14. Medan musmodeller av jordnötsallergi är ovärderligt för att studera mekanismer av sensibilisering och tolerans, är en nackdel att de kan vara variabel och kräver användning av tillsatsmedel. Mer potent immunogens skulle vara ett sätt att minimera det inneboende variabilitet av sådana modeller. Eftersom B-celler aktiveras starkt av multivalenta antigener, är antigen liposomer visar allergen ett bra alternativ på grund av deras förmåga att potentiellt aktivera B-celler via B-cells receptor (BCR) medan också har egenskapen för effektivt grundning T-cell kupén genom tas upp icke-specifikt av antigen-presenterande celler.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för konjugera proteinantigener för liposomalt nanopartiklar med en lättköpt och modulär strategi. Använda en surrogat antigen, anti-IgM Fab-fragment, vi visar hur potent sådant antigen liposomer kan vara stimulerande B-cells aktivering. Antigena liposomer visar Ah2 antigen användes för att utveckla en ny musmodell av tillerkänner känslighet. I denna modell överförs splenocytes från verifierade jordnöt allergisk möss, som innehåller jordnötter-specifika minne B - och T-celler, till naiva congenic möss. Minne-antikroppssvar induceras av injektion av liposomer konjugerat med Ah2 in mottagarens möss, för att inducera antikroppar mot Ah2. Följt av endast en boost med lösliga Ah2, ger Ah2-specifika antikroppar upphov till en stark anafylaktisk reaktion när dessa möss utmanas därefter med Ah2. Möss som genomgår den allergiska reaktionen reagerar mycket enhetligt och inte har fått ett adjuvans, detta tillvägagångssätt är en önskvärd jordnötsallergi modell och resultaten tyder på att det kan ha nytta i andra musmodeller som drivs av antigener som riktas allergener och eventuellt autoantigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den allmänna metoden för koppling protein till lipid och införliva i liposomer bygger till stor del på tidigare arbete15. Alla djur förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av University of North Carolina at Chapel Hill institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Alla möss används i jordnötsallergi modellen är BALB/cJ honor köpta från vid 3 veckors ålder. University of Alberta djur vård och använda kommittén (ACUC) har godkänt experiment med användning av musen mjälte för ex vivo analys från C57Bl/6 möss under minst 6 veckor ålder.
1. konjugering av Protein Antigen till pegylerat Lipid
- Tillsätt 3 g av tvärbunden dextran gel pärlor med en fraktionering rad 1500 – 30 000 Dalton (Da) till en 250 mL kolv med vakuum. Tillsätt 60 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och kontinuerligt rör med magnetiska rör bar. Tillslut kolven och bifoga till ett vakuum att inleda avgasning på en uppståndelse tallrik för minst 1 h.
- I en 1,0 x 30 cm glas kromatografi kolumn med omsättning proppen stängd, lägga till PBS i kolumnen för att tvätta. Öppna omsättning proppen och Töm kolumnen. Efter tvättning, lägga till suspensionen av de gasade pärlor i kolumnen. Ständigt lägga till suspensionen tills kolumnen är packad till en pärla höjd ca 24 cm.
- När kolumnen har en 'huvud' på cirka 4 – 5 cm PBS ovan packade pärlor, har följande redo.
- Skapa en gravitation flöde sifon genom att mäta en bit slang tillräckligt länge för att nå en hylla 1 – 2 fot över toppen av kolonnen och skapa en loop som droppar nära botten av kolumnen och returnerar överst i kolumnen. Lägga till omsättning propp i ena änden av slangen, lämnar ena slangen öppnad. Placera i öppet rör slutet i en 500 mL flaska PBS och plats på hyllan ovanför kolumnen.
- Ta slutet med omsättning proppen och bifoga en 10 mL-spruta. Öppna omsättning propp ventilen på slangen linjen och rita PBS genom röret. När PBS har nått tre fjärdedelar av vägen genom slangen, snabbt ta bort sprutan och Lägg till omsättning proppen längst upp i kolumnen — vätska ska köras på kolumnen.
Obs: Mängden 'huvud' PBS kvar på toppen av kolonnen bör vara mellan 1 och 3 cm. Den minimala beloppet att tvätta kolonnen är 3 kolumn volymer.
- Bestämma mängden protein (födelsemärken) kopplas till lipid baserat på dess molekylvikt (MW).
Obs: Det Fab-fragmentet av geten antimus IgM (själv en IgG) används här som ett universal surrogat antigen för polyklonala stimulering av B-celler. Följaktligen, det Fab-fragmentet av Get IgG har en MW av cirka 48 kiloDalton (kDa) och är kommersiellt tillgängliga i en mängd av 1,3 mg totalt. Mängden protein kopplas alltså 27,1 µmol. - Bestämma extinktionskoefficient av proteinet av intresse. Om okänd, mäta protein absorbansen vid 280 nm med en spektrofotometer och klyftan A280 värdet av antalet mullvadar som beräknades i steg 1.4.
Obs: Utrotning co-effektiv Fab av Get IgG vid 280 nm är 64,600 M-1. - Att säkerställa att spåra mängder amine-innehållande buffert avlägsnas, avsalta proteinet på den kolumn som skapats i steg 1.1 – 1.3 och samla in protein fraktioner i 1,5 mL mikrocentrifugrör (~ 500 µL per fraktion).
- Stäng omsättning propp ventilen ansluten till toppen av kolonnen och ta bort toppen av kolonnen. Om inte redan öppna, öppna omsättning propp ventil längst ned i kolumnen och vänta tills det 'huvudet' PBS träffar toppen av pärlorna.
- Tillsätt långsamt i proteinet av intresse till toppen av pärlor med hjälp av ett glas Pasteur-pipett, vara noga med att minimera störning till toppen av pärlorna.
- När 'huvudet' av protein lösningen har nått toppen av pärlor, tillsätt 1 mL PBS försiktigt via en Pasteur-pipett. Upprepa tre gånger. Lägg till PBS för att skapa ett huvud av 4 – 5 cm och upprepa steg 1.3 att tvätta kolonnen.
Obs: Detta steg kan hoppas över om det är säkert att ingen amine-innehållande buffert är närvarande.
- Fastställa de fraktioner som innehåller protein genom att mäta A280 värden och pool de fraktioner som ger cirka 90% återvinning av protein.
Obs: Detta späder vanligtvis protein 1,5-2-luckan. Bestämma proteinkoncentration efter sammanslagning. Koncentrera sig proteinet i detta steg, vid behov med en centrifugering koncentrator. - Lägga till 2,5 molar motsvarighet till den heterobifunctional crosslinker proteinet.
- Först väger cirka 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP, MW = 314 g/mol) in i en mikrocentrifug rör. Att bestämma volymen för att upplösa SPDP, ta den molar proteinkoncentration och multiplicera det med 250 x att generera en 100 x-lösning som ger ett 2,5 molar överskott i reaktionen.
Obs: till exempel, om koncentrationen i protein 50 µM, en lösning av SPDP på 12,5 mM behövs. För 5 mg av SPDP motsvarar detta 1,27 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO).
- Först väger cirka 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP, MW = 314 g/mol) in i en mikrocentrifug rör. Att bestämma volymen för att upplösa SPDP, ta den molar proteinkoncentration och multiplicera det med 250 x att generera en 100 x-lösning som ger ett 2,5 molar överskott i reaktionen.
- Lägga till SPDP till proteinet av intresse vid en spädning 1: 100. Placera reaktionen på en oscillerande shaker vid rumstemperatur (RT) för ca 1 h.
- Ta bort överflödig SPDP och skydda den endogena disulfid bond(s), i proteinet i påföljande sänkning steg, jämvikt och tvätta den kolumn som skapats i steg 1.1 – 1.3 i 100 mM natriumacetat (NaOAc) vid pH 5,5 eller skapa en identisk kolumn enbart för användning i detta buffert.
- Efter 1 h inkubation med SPDP, avsalta proteinet på kolumnen jämviktas i 100 mM NaOAc. Utföra detta steg på ett identiskt sätt som steg 1,6 utom med 100 mM NaOAc (pH 5,5) som eluenten. Samla fraktionerna, fastställa den A280och pool övre fraktioner. Tvätta kolonnen i PBS.
- Bered en lösning av 2,5 M av DTT (MW = 154 g/mol) i dubbel destillerat vatten (ddH2O). Lägg till 25 mM DTT i de poolade fraktionerna av protein för 5-10 min.
- Mät den A280 av protein och dividera detta med extinktionskoefficient. Ta också reda på A343. Beräkna förhållandet länka baserat på molariteten av protein (en280) och länkare (en343).
Obs: Stäng av A340 auto-kalibreringen om använder en nanodrop spektrofotometer. A343 mätningen representerar gruppen pyridin 2-tion absorbans (extinktionskoefficient = 7550 M-1) som avlägsnas från den SPDP cross-linker av DTT. En molar förhållandet för linker: proteinkvot av 1,2 – 1,5 uppnås generellt när du utför reaktionen med en 2,5 molar överskott av SDPD på en rad olika proteiner. - Kör de poolade fraktionerna över kolumnen tvättas i PBS som beskrivs ovan. Samla fraktionerna, fastställa den A280och pool övre fraktioner. Bestämma koncentrationen av protein av A280 efter sammanslagning fraktioner.
- Förbereda DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Detta kommer att läggas till proteinet i förhållandet 10:1 molar. Förbereda ett 100 x lager av DSPE-PEG (2000)-Maleimide att uppnå önskad koncentration.
- Exempelvis om proteinet koncentrationen 10 µM efter steg 1.14, förbereda ett lager av DSPE-PEG (2000)-Maleimide på 10 mM. Noga väga sig DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) och Lägg till lämplig mängd DMSO. Flera rundor av mild vortexa och sonicating kan få det helt upplöst.
- Fastställ den totala volymen av fraktionerna från steg 1.14 och överför lösningen försiktigt till en liten (10-25 mL) rund botten kolven (RBF). Tillsätt lämplig mängd 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide till proteinet att uppnå en 1 x, 10-faldig molar överskott, slutliga koncentration. Snurra försiktigt lösningen för att säkerställa att DMSO är fullt utspridd.
- Kör reaktion över natten under kväve i en förseglad RBF. Använd en gummi septum och placera i dragskåp.
- Ta bort atmosfären genom att punktera septum med 20 G nål bifogas en 3 mL spruta slutet av slangen kopplad till ett vakuum, och slå på vakuum för 3 – 5 s.
- Ersätta atmosfären med kväve. Fyll en ballong fäst en 3 mL spruta halveras med kväve och bifoga en 20 G nål. Punktera septum för att fylla atmosfären inuti rund botten kolven med kväve. Upprepa borttagningen av atmosfären och utbyte med kväve gång och lämna kväve ballongen fäst över natten.
- Förbereda en separat tvärbunden dextran gel pärla kolumn med en fraktionering rad 4 000 – 150 000 Da i en 1,0 x 50 cm-kromatografi glaskolonn (enligt steg 1.1-1.3).
- Följande dag, ta bort proteinet från rund botten kolven upprättats i steg 1.17 och kör (följ den metod som används i steg 1,6) över kolumnen tvärbunden dextran gel pärla (från steg 1.18).
Obs: Det totala beloppet att lasta på kolumnen ska vara mer än 2 mL. Om en större reaktion användes, uppdelad i två och kör på separata kolumner eller kör på en större diameter.- Samla fraktioner, bestämma den A280, pool övre fraktioner, och bestämma koncentrationen av protein. Förekomsten av lipid påverkar inte mätningarna.
- Lagra de slutliga poolade fraktionerna av lipid-länkade protein vid 4 ° C tills klar för användning.
2. Liposom förberedelse
- Väg upp lipider: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol Kolesterol (3b-hydroxi-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol och DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin), MW = 790.1 g/mol. skapa en 5 mg/mL lösning av DSPC, 4 mg/mL lösning av kolesterol och 2 mg/mL lösning av DSPE-PEG(2000) i kloroform.
- Säkerställa att molar förhållandet av lipider i liposomer är: 57% DSPC, 38% kolesterol och 5% DSPE-PEG(2000), som representeras i tabell 1.
Obs: Det är viktigt att kontrollera mängden antigen på den Liposom, som vanligtvis sträcker sig från 0,01 – 0,1%. I tabell 1används 0,1% av geten antimus IgM Fab-fragment kopplade till pegylerat lipid. Det är viktigt att ta hänsyn till de 10-faldig molar överskott av DSPE-PEG (2000)-Maleimide som lades till proteinet i steg 1.15, att se till att den totala mängden pegylerat lipid inte överstiger 5%. - Överväga de slutliga lipid belopp (µmol) när du skapar lipider för extrudering. Se tabell 1 för ett exempel på beräkning av molar lipid koncentrationer för skapandet av liposomer vid en 1,25 µM totala lipid koncentration.
- När rätt mängd av varje lipid ska läggas ihop har beräknats, kombinera allt i en 12 mL borosilikatglas provröret.
-
Blås försiktigt bort kloroform.
- Använd slangen och en 3 mL spruta med nål, bereddes i steg 1.17.1, att försiktigt blåsa av kloroform i röret med kväve. Blås försiktigt en ström av kväve på lösningen samtidigt vrida röret med den andra handen. Var noga med att minimera stänk eller orsakar vätskan att köra långt upp på sidan av röret som det kan vara svårare att få detta till lösning i nästa steg.
- Tillsätt 100 µL av DMSO i varje rör och lyophilize denna lösning över natten. Täck toppen av röret med en icke-statisk laboratorium torka, säkert med en gummisnodd, och frysa-80 ° C.
3. Liposom extrudering
- Tillsätt 1 mL PBS som innehåller proteinet lipid-länkade till 12 mL röret som innehåller lipider. Sonikera lösningen för cirka 30 s till 1 min i ultraljudsbehandling vattenbad. Vila 5 min eller längre mellan varje omgång och upprepa 3 – 4 gånger.
-
Förbereda en extruder enligt anvisningar från tillverkaren.
- Lägg till filter stöd till det inre membran stödet, placera några droppar (10 µL varje) PBS på paraffin film. Med pincett, greppa kanten på filtret stöd och doppa den i 10 µL drop.
- Placera filtret släpper o-ringen. Gör detta för båda sidor. Med pincett, greppa en 0,8 µm filter på kanten och doppa i 10 µL drop och bestryka utsidan av o-ringen med PBS. Placera filtret 0,8 µm försiktigt på o-ringen så filtret stöder inte över hänga inre membran.
- Placera extruder värmeblocket på en värmeplatta till pre-Värm extruder. Växla värmeplattan på låg och låt extrudern värme block att nå önskad temperatur. För att undvika potentiella problem med protein aggregation, Värm inte blocket senaste 37 ° C.
- Läsa in sonicated provet i en av extruding sprutor placeras i extrudern. Placera extruder nålen i andra änden av extruder. Kontrollera att Tom sprutkolven sätts till noll. Den tomma sprutan kommer fylla eftersom lipid extruderas genom polykarbonat 0,8 µm membranet. Försök att undvika passerar bubblor och tillbaka genom membranet.
- Placera extrudern färdigmonterad i värmeblocket. Skjut försiktigt in kolven i den fyllda sprutan med lipider till den tomma sprutan. Beroende på lipid blir detta svårt att driva igenom. Upprepa 20 x.
- Ta bort färdigmonterad extrudern från värmeblocket. Långsamt bort den fyllda sprutan från extruder, se till att samla alla lipider som kan läcka ut när du tar bort. Placera liposomer i en ren flaska. Upprepa steg 3,4 – 3.6 använder polykarbonat 0,2 µm och 0.1 µm membran.
- Skapa en 0,7 x 50 cm2 tvärbunden agaros pärla kolumn med separation mellan 0,7-10 Mega Dalton (MDa) jämviktas i PBS. Lägg till liposomer och kör som i steg 1,6. Fraktioner som innehåller liposomer har minskat överföring av ljus i intervallet 250-400 nm.
- Lagra liposomer vid 4 ° C och får inte frysas.
4. kalcium Flux att övervaka B-cells aktivering av antigena liposomer
- Euthanize möss av koldioxid (CO2) eller isofluran överdosering, enligt institutionella standardrutiner. Bekräfta eutanasi av möss genom cervikal dislokation.
- Sterilisera Kirurgiska instrument och möss kadavret med 70% etanol. Använd 10 cm långa, 0,8 mm spets, böjd iris pincett för att separera huden som täcker brösthålan från bröstkorgen. Använd 10 cm långa, raka dissekera saxen för att göra en distala snitt med en bilaterala snitt.
- Använda böjda iris pincett och dissekera saxen för att extrahera mjälte från bukhålan. Ta bort fettvävnad kring mjälte och placera det i en 15 mL polystyren koniska rör fyllda med RPMI1640 medium innehållande 1% fetalt kalvserum (FCS) och penicillin-streptomycin.
- Överföring mjälte och media över en 40 µm cell SIL monterade på en 50 mL konisk tub. Försiktigt använda gummi slutet av en 3 mL sprutkolven, krossa mjälte. Tvätta 40 µm cell silen med media. Upprepa denna process tills bara fettvävnad finns kvar i 40 µm cell Silen. Skölj sikten med 3-5 mL av media att öka cellen.
- Centrifugera cell Homogenatet vid 300 x g i 5 min på RT. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL 1 x RBC lyseringsbuffert till pelleten. Pipettera upp och ner, låt verka i 2 – 3 min på RT och sedan Centrifugera 300 x g för 5 min på RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera röda blodkroppar utarmat splenocytes i 10 mL av media. Bestäm totala cell nummer med hjälp av en hemocytometer eller annan cell räknar enheten. Pellet cellerna genom centrifugering som beskrivs ovan.
Obs: Idealisk slutliga koncentration krävs för Indo-1 lastning splenocytes är 10 – 20 x 106 celler/mL, men en lägre koncentration av celler kan användas. - Återsuspendera splenocytes på 15 x 106 celler/mL i kalcium flux lastning buffert (RPMI1640 medium som innehåller 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 1 mM magnesiumklorid (MgCl2), 1 mM etylenglykol-bis ( Β-aminoethyl eter)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA) och 5% penicillin-streptomycin). Lägg till i 1,5 µM Indo-1 från 1 mM DMSO stamlösning, Invertera röret flera gånger för att blanda. Ljuskänsligt och inkubera cellerna vid 37 ° C vattenbad under 30 minuter.
- Efter 30 min ruvning, Lägg i 5 x mängden kalcium flux lastning buffert. Centrifugera vid 300 x g under 7 min på RT.
- För gating på B-celler, färga celler med 1: 200 antimus CD5-PE och antimus 1: 200 B220-PE/Cy7 i 0,5 mL lastning buffert vid 4 ° C i 20 min, skyddas från ljus.
- Tvätta splenocytes i kalcium flux lastning buffert och centrifugera vid 300 x g under 7 min på RT. Omsuspendera cellerna på 10 – 20 x 106 celler/mL i kalcium flux kör buffert (Hanks balanserad saltlösning (HBSS) som innehåller 1% FCS, 1 mM MgCl2 och 1 mM kalciumklorid (CaCl2)). Förvaras på is, skyddas från ljus förrän du är klar att köra på flödescytometer.
-
Setup flödescytometri med ofärgade och enda fläcken för ersättning.
- Kör de färgade cellerna för att konfigurera portarna på lämpligt sätt (se figur 2A). Setup Indo-1 (violett) kontra Indo-1 (blå) tomt, justera spänningar i de Indo-1 kanalerna att placera cellerna färgning på en lutning på 45 – 60 ° att maximera signalen: brus av den Indo-1 violett: blå förändring i förhållande B-cell stimulering.
Kontrollera att spänningarna inte är för hög, så att en betydande andel av cellerna (> 5%) är upp mot toppen av tomten. - Skapar en diagonal grind som kapslar in den övre vänstra delen (violett+blå–) av tomten, så att utan stimulering < 10% av cellerna är i utfärda utegångsförbud för, som helst bör öka till > 75% efter stimulering.
- Kör de färgade cellerna för att konfigurera portarna på lämpligt sätt (se figur 2A). Setup Indo-1 (violett) kontra Indo-1 (blå) tomt, justera spänningar i de Indo-1 kanalerna att placera cellerna färgning på en lutning på 45 – 60 ° att maximera signalen: brus av den Indo-1 violett: blå förändring i förhållande B-cell stimulering.
-
Tillsätt 0,5 mL av celler till en utjämnade 5 mL rund botten polystyren tube (fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) tube) och varm celler till 37 ° C under 3 – 5 minuter i ett vattenbad. Placera FACS röret i 37 ° C water-jacketed kammaren som är ansluten till ett nytt cirkulerande vattenbad.
- Köra röret i den water-jacket på flödescytometer och initiera förvärv, utan att lagra data, på cirka 5 000 – 10 000 händelser/s. När cellerna har stabiliserad (15 – 30 s), initiera data förvärv och samla data för minst 10 s att fastställa bakgrunden.
- På 10 s-märket, snabbt bort röret från flödescytometer, tillsätt stimulering (5-50 mM antigena liposomer i 2 – 20 mL), pulse vortex och returnera FACS tube på flödescytometer. Upprätthålla datainsamling och lagring genom denna tid och samla in uppgifter för 3 – 5 min.
- Analysera data i lämplig analys programvara under kinetik funktioner.
5. beredning av jordnötssmör extrakt
- Extrahera jordnöt proteiner genom att blanda jordnötter mjöl i förhållandet 1:5 (wt:vol) av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1 M natriumklorid (NaCl). Blanda lösningen på magnetiska rör tallrik för 2 h på RT bibehållen vid pH 8,5.
- Centrifugera lösningen vid 3 000 x g i 45 min vid 4 ° C. Dekantera och filtrera-sterilisera supernatanten sekventiellt genom en 0,4 µm filter följt av ett 0,2 µm filter. Bestämma proteinkoncentration av bicinchoninic syra (BCA) analysen använder bovint serumalbumin (BSA) som standard.
- Minska och denaturera ett prov av jordnöt proteiner med 50 mM Ditiotreitol (DTT) i en buffert som innehåller litium dodecyl sulfate vid ett pH på 8,4, vilket möjliggör maximal aktivitet reduktionsmedel och värme vid 70 ° C i 10 min.
- Kör 10 µg av denaturerat jordnötsprotein på en Bis-Tris 4 – 12% precasted polyakrylamidgel utformad för att ge optimal separation gradient gel med molekylvikt pre målat standard.
- Fläcken gelen med disulfonated triphenylmethane och avfärga med ddH2O. identifiera kända stora jordnöt allergener Ara h 1, 2 och 3 i extrakt preparat. Ara h 1 visas på 63 kDa, Ara h 2 ska visas som två isoformer på 17 och 19 kDa och Ara h 3 visas på 37 kDa (sura subunit).
6. sensibilisering av möss till jordnötter
- Återsuspendera 1 mg kolera toxin i 1 mL ultrarent vatten. Förbereda 200 µL utspädd jordnötssmör extrakt innehållande 2 mg jordnötsprotein och 10 µg kolera toxin i PBS.
- Administrera 200 µL av jordnöt extraktet innehållande kolera toxin (2 mg jordnötsprotein och 10 µg kolera toxin) via oral sondmatning till varje 4-5 vecka gammal BalB/cJ kvinnliga mus. Upprepa en gång i veckan i tre veckor (dvs dagar 0, 7 och 14).
- Administrera 300 µL utspädd jordnötssmör extrakt (som innehåller 5 mg jordnötsprotein och 10 µg kolera toxin) via oral sondmatning till varje mus i den fjärde veckan (dvs. dag 21).
7. utmaning möss med jordnötssmör extrakt
- Dag 28, förbereda peanut extraktet till en slutlig koncentration av 1 mg/mL i PBS. Mäta baslinjen organ temperaturer med en rektal termometer (cirka 37,5-38,5 ° C). Administrera 200 µL (200 µg) av jordnötssmör extrakt via intraperitoneal (IP) injektion.
- Mäta kroppstemperaturen med rektal termometer varje 15 min för 1 h efter injektion. Ett dopp i kroppstemperatur anger allergi mot jordnöt.
Obs: Hypotermi är ett signum för anafylaxi hos möss. Denna utmaning kommer att visa att möss är allergisk mot jordnötter. 90% av Balb/cJ möss som genomgår protokollet sensibilisering utvecklas vanligtvis allergiska reaktioner under utmaning kännetecknas av minst en 2 – 3 ° C temperatursänkning.
8. isolering av Splenocytes från allergiska möss och överföring
-
Isolera splenocytes från naiva och jordnöt allergisk möss.
- Dag 30, avliva både naiv och bekräftade jordnöt allergisk möss genom att administrera 3 L/min för CO2 i en gaskammare. Bekräfta eutanasi av möss genom bilaterala torakotomi. Sterilisera Kirurgiska instrument och mus kadavret med 70% etanol. Använd tången för att separera huden som täcker brösthålan från bröstkorgen. Använd raka dissekera sax göra ett bilaterala snitt för att bryta de vänstra och högra revben.
- Använd tången och dissekera saxen för att extrahera mjälte från bukhålan. Ta bort fettvävnad kring mjälte innan du placerar i polystyren 15 mL koniska rör, fylld med 10 mL RPMI 1640 medium.
- I en steril LAF, häll mjälte och media i en 35 mm polystyren petriskål. Hålla naiva och allergisk splenocytes i separata petriskålar och media under cell isolering. Använd steriliserad pincett och dissekera sax att klippa mjälte i tre bitar och återgå till petriskål.
- Använder två glas objektglas grov, frostat kant, försiktigt homogenisera (i RPMI) mjälte bitar tills vit vävnad förblir mellan bilderna. Ändra bilder mellan grupperna.
- Överföra cell Homogenatet från petriskål genom en 70 µm cell SIL monterad på en 50 mL konisk tub. Passera silen med en kolv återstående mjälte fragment från en 1 mL spruta. Skölj sikten med 5 mL RPMI att maximera cell återhämtning. Överföra filtratet till en polystyren 15 mL koniska rör och centrifugera (450 x g, 10 min, RT).
- Sug ut supernatant och tillsätt Omsuspendera cellpelleten i 2 mL röd blod cell lyseringsbuffert (0,83% ammoniumklorid i 10 mM Tris buffert, pH 7,2). Blanda och inkubera vid RT i 2 – 3 min. Tillsätt 10 mL PBS - 2% FBS och centrifugera vid 300 x g under 7 min på RT.
- Tvätta cellerna igen med 12 mL PBS - 2% FBS att helt ta bort eventuella kvarvarande ammoniumklorid och centrifugera 300 x g för 7 min på RT. återsuspendering cell pellets i 2 mL RPMI 1640 medium. Räkna celler som använder antingen en hemocytometer eller automatiska hematologi analyzer.
- Använda en 27 G, 5/8-tums nål på en 1 mL spruta av insulin, intravenöst injicera 15 x 106 allergiska eller naiva splenocytes extraheras som beskrivits ovan (i 200 µL) via svansen ven i naiv (unsensitized) möss.
9. injektion av möss med Ara h 2 Antigenic liposomer
- Förbereda Ah2 liposomer innehållande 0,1% Ah2 på 2,5 mM lipid. För att beräkna proteinkoncentration, är utrotning Ah2 15.000 M-1. Späd liposomer 300 µm i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- En dag efter överföring (dag 31) av allergisk eller naiva splenocytes, injiceras intravenöst 200 µL PBS eller Ah2 antigena liposomer (300 µM) som innehåller sammanlagt 1,38 µg Ah2 via svans venen BALB/cJ möss som fått splenocytes i steg 8.2.
10. boost och utmaningen att möss med Ara h 2
- Två veckor efter injektionen med Ah2 liposomer, på dag 45, Använd en 4 mm djur lancet för att samla 50 – 200 µL blod från submandibular korsningen av musen. Samla in blod i ett serum separator rör utan heparin; separat serumet genom centrifugering vid 6000 x g i 15 min. Använd den insamlade serumen senare vidare till åtgärd antigen-specifika antikroppar.
- Dag 46, två veckor efter injicera möss med liposomer (steg 9,2), öka möss genom en i.p.-injektion av 200 µL av PBS eller 200 µg av lösliga Ah2 (renas enligt tidigare16).
- På dag 60, samla 50-200 µL blod från submandibular korsningen av musen, och bearbeta blod som tidigare beskrivits.
- På dag 61, utmana varje grupp av möss med en i.p.-injektion av 200 µL 300 µg lösliga Ah2. Mäta kroppstemperatur med rektal sond varje 15 min som i avsnitt 7.
11. kvantifiering av Ara h 2-specifika IgE och IgG1 av ELISA
- Coat en 96 brunnar enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-kompatibel platta med 100 µL HSA-DNP (2,4-Dinitrophenylen hapten konjugerad till humant serumalbumin, 20 µg/mL) för standardkurvan eller Ah2 (5 µg/mL) för serumprover samlas i steg 10.1 och 10.3, utspädd i coatingbuffert (50 mM karbonat-bikarbonat buffert, pH 9,6) vid 4 ° C över natten eller 37 ° C för > 1 h.
- Tvätta tre gånger med 200 µL PBS-T (PBS med 0,05% Tween-20) och blockera brunnar med 200 µL PBS-T innehållande 2% BSA vid 37 ° C för > 2 h.
- För Ah2-specifika IgE ELISA, tillsätt 50 µL IgE-anti-DNP standarder (2 – 0.002 µg/mL, beredd från 1:2 seriella utspädningar) eller mus serumprover (1:20 utspädning) och inkubera över natten vid 4 ° C. För Ah2-specifika IgG1 ELISA, tillsätt 100 µL renat IgG1-anti-DNP standarder (2 – 0.002 µg/mL, beredd från 1:2 seriella utspädningar) eller mus serumprover (1: 500 utspädning) och inkubera över natten vid 4 ° C eller 1 h vid 37 ° C.
- Tvätta tre gånger med 200 µL PBS-T. För Ah2-specifika IgE ELISA, tillsätt 100 µL fåren antimus IgE (0,5 µg/mL) och inkubera vid 37 ° C i 1 h. För Ah2-specifika IgG1 ELISA, tillsätt 100 µL HRP get antimus IgG1 (utspädd 1:40,000 i PBS-T - 2% BSA). Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
- Tvätta tre gånger med 200 µL PBS-T. För Ah2-specifika IgE ELISA, lägga 100 µL biotinylerade-åsna anti får IgG (0,5 µg/mL) och inkubera vid 37 ° C i 45 min. För Ah2-specifika IgG1 ELISA, hoppa till steg 11,7.
- Tvätta tre gånger med 200 µL PBS-T. För Ah2-specifika IgE ELISA, tillsätt 100 µL neutralt debiteras avidinen-pepparrotsperoxidas (t.ex., NeutrAvidin-HRP, 0.3 µg/mL) och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Tillsätt 100 µL 3, 3', 5, 5'-tetrametylbensidin (TMB) substrat, inkubera i 10-15 min eller tills prover stänger mörkblå, Lägg sedan till 100 μl TMB stopplösning. Läs plattan vid 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Böjningar av proteinet av intresse med DSPE-PEG(2000) kan påvisas genom att köra en reducerande visar en ökning i molekylär vikt jämfört med proteinet okonjugerat. Figur 1A visar en representativ gel av antimus IgM F(ab) fragment konjugation till PEG-DSPE, som visar en 2 – 3 kDa bandshift för denaturerat protein. Observera att cirka 50% av proteinet visas ändras, vilket är väntat med tanke på att 1:1 stökiometri uppnåddes på den Fab-fragment som är en heterodimer av tunga och lätta kedjan. Figur 1B visar en representativ gel av Ah2 konjugation till PEG-DSPE. För att bedöma kalcium flux av B-celler stimuleras av antigen liposomer, två saker är avgörande: (1) instrumentinställningarna är inställda för att se en skillnad i förhållandet mellan Indo-1 fluorescens i den Ca2 + bundet (violett) och obundet (blå) former och (2) korrekt gating strategi används för att bedöma B-cells aktivering. Figur 2A visar Usenets systemet för flödet flödescytometri-baserade kalcium flux analysen. Levande lymfocyter är gated i ett SSC-A kontra FSC-A (vänster), midjekort jacka är gated ute i en FSC-W kontra SSC-W tomt (mellersta panelen) och B200+CD5– B-celler väljs från ett CD5-PE vs B220-PE/Cy7 tomt (höger panel). Figur 2B visar förhållandet mellan Indo-1 (violett) vs Indo-1 (blå) fluorescens över tid som analyseras. Observera att den totala protein koncentrationen av F(ab) och F(ab')2 i dessa analyser var samma, visar överlägsen förmåga av antigena liposomer i stimulerande B-cells aktivering. Efter att förbereda peanut extraktet, kör en alikvot på en SDS-PAGE gel att bestämma de relativa mängder Ara h 1, 2 och 3 inom extraktet. Figur 3 visar en representativ gel av en jordnöt utvinning som kördes tillsammans med renat Ah2. Figur 4 visar en schematisk bild av övergripande adoptiv jordnötsallergi musmodell, inklusive initiala sensibilisering mot jordnötter, utmaning för jordnötter, splenocyte isolering och överföring, Liposom injektioner, blodprov följt av Ah2 boost, och utmana till Ah2. Ah2-specifika IgE och IgG1 ELISAs drevs för att kvantifiera immunoglobuliner i serum, som visas i figur 5A och B. Möss med tilldelad känslighet som har marknadsförts med Ah2 har Ah2-specifika IgE och IgG1 i deras serum. Kroppstemperatur under Ah2 utmaningen visas i figur 5 c; allergisk möss hade minskat kroppstemperatur efter utmaningen, medan organ temperaturer i naiva möss varit konsekvent. Foton visar naiva möss jämfört med jordnöt-allergisk möss under utmaningen visas i figur 6.
Figur 1: representativa gel av antimus IgM F(ab) och Ah2 konjugation till PEG-DSPE. (A, B) SDS-page analys av (A) get antimus IgM F(ab) fragment och (B) Ah2 före och efter konjugering till PEG-DSPE. Geten antimus IgM och Ah2 har molekylvikter av cirka 48 och 18 kDa, respektive. Efter ändring, en något större molekylvikt (~2.5 kDa) observeras tydligt för båda proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa gating strategi, kalcium flux resultat och analys. (A) celler analyserades genom följande Usenets strategi: live lymfocyter (FSC-A vs. SSC-A), enstaka celler (FSC-W vs SSC-W) och B-celler (B220+CD5–). (B) The Indo-1/Ca2 + flux svar (violett vs. blue) av B-celler. Visas är kalcium flux för anti-IgM Fab-fragment liposomer och anti-IgM F(ab')2 på samma proteinkoncentration (2,5 µg/mL) samt buffert-stimulerade celler som en kontroll. Observera att mellan 10-22 s när stimulering läggs och, därför, inga data förvärvas under denna tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa gel visar jordnötssmör extrakt och Ah2. Jordnötssmör extrakt innehåller flera proteiner, inklusive allergener Ara h 1, 2, 3 och 6, jämfört med de två isoformer som visas för Ah2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk av adoptiv överföringsprotokoll. Naiva BALB/cJ möss var sensibiliserats med jordnötssmör extrakt (PN) och kolera toxin (CT), och därefter utmanas att PN. Splenocytes från bekräftade allergiska möss var isolerade och överföras till naiva möss. Möss var senare primas med immunogent Ara h 2 liposomer eller PBS, då boostad med lösliga Ah2. Slutligen, utmanades möss med Ah2 att övervaka anafylaxi. Blodet samlas på dag 45 och 60 har använts för att kvantifiera Ah2-specifika immunglobuliner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: immunogent Ara h 2 Liposom ökar som tilldelats-minne allergisk svaren. Serum var isolerade pre (dag 45) och post (dag 60) boost med PBS eller 200 µL 300 µM immunogent Ah2 Liposom att mäta Ah2-speciella IgE (A) och IgG1 (B). Enskilda möss är representerade med linjer som anger medianer. Möss som fick allergiska splenocytes och var administreras Ah2 liposomer på dag 32 hade signifikant högre nivåer av Ah2-specifika IgE och IgG1. Anafylaxi mättes i de olika behandlingsgrupperna genom inspelning kroppstemperatur efter Ah2challenge (C). Menar organ temperaturer avbildas med SEM. naiva: PBS (naiva splenocytes och PBS prime), allergiska: PBS (bekräftade allergiska splenocytes och PBS prime), allergiska: Ah2 (bekräftade allergiska splenocytes och Ah2immunogenic Liposom prime). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, *** P < 0,0001 bestäms av oparade 2 Students t-test. Observera att resultaten är representativa för två oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: anafylaktiska symtom observerats under Ah2 utmaning. Naiva möss förblir aktiva och har rosa hy på fötterna (A, C). Allergisk möss har minskad aktivitet, är ofta böjd, har ansträngd andning och uppleva cyanos, anges med mörkare lila hy på fötterna (B, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Kolesterol | PEG-DSPE | överskjutande PEG-DSPE | en IgM-PEG-DSPE | TOTALT | |
| Molar förhållandet | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| massan (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| m mol | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0.00 | 1,25 |
| mL | 112,50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| Konc (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Kolesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| en IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
Tabell 1: beräkningar för att skapa en 1,25 µM totala lipid koncentration Liposom. Exempel på beräkning tabell för geten antimus IgM F(ab) fragment liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här är ett allmänt protokoll för konjugationen av ett protein till en lipid som möjliggör visning av proteinet på liposomalt nanopartiklar. För mycket stora multi subenhet proteiner, har detta protokoll begränsad nytta. Den idealiska metoden skulle vara införandet av en platsspecifik tagg som möjliggör en biorthogonal kemisk länka strategi som ska användas. Om uttrycker proteinet recombinantly, kan detta vara möjligt med hjälp av tillgängliga platsspecifika strategier17och ett brett utbud av funktionella grupper i slutet av den pegylerat lipid som är kommersiellt tillgängliga. Således detta protokoll är inriktad på sammankoppling av proteinet isoleras från naturliga källor och är tillgänglig till en lång rad forskare inte nödvändigtvis bekant med kemisk och biokemisk transformationer.
En viktig aspekt av kör en kalcium flux experiment som bör betonas är att cellerna inte bör aktiveras innan du kör dem på flödescytometri. Steril teknik används inte strikt, kommer detta konto för en hög bakgrund signal från aktiverade celler (Indo-1 fluorescens skev mot dess utsläpp i violett kanalen). Likaså bör celler hållas på is innan du kör analysen för att undvika onormala nivåer av bakgrund signal i de Indo-1 kanalerna. Det är också viktigt att se till att cellerna värms för 2 – 3 min före förvärv av flödescytometri och hela stimulering under datainsamling. Om cellerna inte bevaras vid 37 ° C under datainsamling, kan det förväntas att celler inte svarar maximally. Sedan antigen-specifika B-celler är närvarande hos möss vid mycket små siffror, är använda ett surrogat antigen för att stimulera alla B-celler från mus idealisk. Även om många transgena möss stammar finns tillgängliga som express antigen-specifika B-celler, syftet med denna teknik är att den genomsnittliga användaren att kunna validera deras förmåga att göra antigena liposomer med vildtyp möss. För att uppnå detta mål, var Fab fragment av antimus IgM kopplade till lipider och formulerade i antigena liposomer som tvärbinda B-cells receptor (BCR) i en polyklonala mode. Det är anmärkningsvärt att det visades tidigare att denna metod kan användas för att stimulera människors B-celler10 med hjälp av lämpliga antihumana IgM Fab fragmentet, som är betydande eftersom det inte är möjligt att komma åt betydande antal antigen-specifika mänskliga B-celler. I dessa studier visades styrkan av antigena liposomer att stimulera B-cells aktivering av sin förbättrade förmåga att inducera kalcium flux jämfört med lika mängder antimus IgM F(ab') 2 fragment.
Användning av antigena liposomer har möjliggjort utvecklingen av en metod för sensibiliserande BALB/cJ möss till jordnöt, överföra splenocytes från allergiska möss till naiva möss, injicera värd möss med Ah2 liposomer och utmana dem med Ah2. Nivåer av antikroppar och anafylaktiska reaktioner inom grupper av möss är reproducerbara i denna modell. Det har varit väl etablerade som minne B - och T-cell svar är kritiska i utvecklingen av jordnöt-specifika antikroppar hos möss. En färsk studie har dessutom visat att minnet B-celler återbefolka plasma celler i möss, som upprätthåller förhöjda antigen-specifika IgE nivåer; allergen-specifika minne B-celler är därför ett attraktivt mål för terapeutisk intervention18. Den modell som beskrivs här nu tillåter en möjlighet att direkt rikta Ah2-specifika B minnesceller, i motsats till en immunsuppressiv metod med bortezomib för att tömma hela plasma cell repertoar19. En annan metod att bekämpa allergier är att inducera tolerans i T-cell facket. En potentiell strategi är att kapsla in tolerans-inducerande adjuvans inom Liposom. Tidigare användes nanopartiklar encapsulating rapamycin att inducera Tregs och minska autoimmun sjukdom20. Denna typ av strategi kan användas för att utveckla tolerogena terapier för att behandla jordnötsallergi. Sammantaget manipulation av de allergen-specifika Liposom av konjugera molekyler på ytan möjliggör skräddarsydda immunsvar och kapsla in drug-liknande molekyler som möjliggör leverans av läkemedel till cellen allergen-specifika.
Allmänna begränsningar av denna musmodell av jordnötsallergi är att allergi mot jordnötter med kolera toxin och efterföljande jordnöt utmaning via i.p. injektion är inte helt representativt av jordnötsallergi hos människa (t.ex. människor har reaktioner vid oralt intag). Denna allergi-modell är den nuvarande standarden i fält11,18,21, vilket tillåter oss att undersöka molekylära mekanismer av allergisk sjukdom och utveckla nya behandlingsmetoder. Jämfört med dessa konventionella metoder, erbjuder denna överföring modell tre primära fördelar. Först är att det möjliggör minne B - och T-celler specifika för allergen studeras mer direkt. Faktiskt ifrågasätter bevis nu starkt minne B-celler som den huvudsakliga källan av långfristiga allergier18. För det andra, eftersom samma nummer av B - och T-minnesceller implanteras i varje mottagande mus, allergisk svaren är minimalt rörliga. För det tredje, denna modell ger möjlighet att studera allergisk Svaren till enskilda allergener, vilket är användbart i samband med testning nya immunterapier. Ett spännande program av denna modell är att använda det allmänna tillvägagångssättet i samband med en humaniserad musmodell, där allergiska reaktioner har studerats i immuniserade modeller22. Tillämpas i samband med en överföring modell, en humaniserad musmodell kunde vara en kraftfull strategi för att expandera och i vivo tester av B - och T-celler från allergiska patienter.
Antikropp sjukdomspatogenes uppstår inte bara i allergisk modeller, men också i B-cells medierade autoimmuna sjukdomar23. Adoptively överföra sensibiliserade splenocytes från möss som gavs ett autoantigen skulle i slutändan vara mycket användbara i att sänka antalet djur används, minimera antalet djur flera injektioner av adjuvant och öka reproducerbarhet Svaren mellan kohorter av möss i flera sjukdom indikationer. Ett exempel skulle vara i en experimentell autoimmuna modell av myasthenia gravis (EAMG) i vilken mottagliga mus stammar (C57BL/6, SJL och AKR) är immuniserats flera gånger med acetylkolin receptorn (AChR) i adjuvant att utveckla patogena autoantikroppar. Dessa autoantikroppar i slutändan leda till immunopatologiska funktioner som finns i människor såsom muskel trötthet/svaghet, insättning av immunglobuliner och kompletterande komponenter på neuromuskulära korsningar och i svåra fall sjuklighet/död24. I EAMG varierar sjukdom incidensen mycket mellan 50 – 70%, så för att beakta denna variation behövs stora djur kohorter att nå statistisk signifikans25,26. Den metod som beskrivs här skulle i slutändan minska antalet djur som används genom att minska variationen i sjukdomsfall. Som tidigare nämnts, EAMG framkallas av flera injektioner med AChR + adjuvans (komplett Freunds adjuvans och ofullständig Freunds adjuvans) till trigger auto-antikroppssvar. Denna metod skulle minska antalet djur som får flera sprutar med adjuvant. Slutligen på grund av flera vaccinationer och ökar är det relativt svårt att definiera lämpliga terapeutiska windows för profylaktiska och terapeutiska behandlingar. Denna metod skulle bidra till att synkronisera antikropp svar sjukdom patogenes fönstret och gör det en mer förutsägbar och reproducerbara. Samma logik kan tillämpas på många andra musmodeller av antikropp medierad autoimmuna sjukdomar, såsom reumatoid artrit27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av bidrag från Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 och W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
