Summary
ووصف هو إعداد جسيمات نانوية الاسمافرون مستضدي واستخدامها في تحفيز ب-خلية التنشيط في المختبر و في فيفو. استجابات جسم متسقة وقوية أدت إلى تطوير نموذج جديد لحساسية الفول السوداني. ويمكن تمديد البروتوكول من أجل توليد الدهنية مستضدي المستضدات المختلفة ونماذج التحصين.
Abstract
توفير استجابات جسم حرجة حصانة الحماية لمجموعة واسعة من العوامل الممرضة. لا يزال هناك مصلحة كبيرة في توليد أجسام مضادة قوية للتلقيح، فضلا عن فهم كيف الممرضة جسم تطوير الاستجابات في الحساسية وأمراض المناعة الذاتية. توليد استجابات قوية محددة مستضد الضد ليس دائماً تافهة. في نماذج الماوس، فإنه غالباً ما يتطلب جولات متعددة من التحصينات مع adjuvant الذي يؤدي إلى قدر كبير من التباين في مستويات الأجسام المضادة المستحث. مثال ذلك في نماذج الماوس من الحساسية الفول السوداني حيث سيكون من المفيد أكثر نماذج قوية واستنساخه أن تقليل إعداد الماوس واستخدام adjuvant. قدم هنا نموذج ماوس استنساخه بدرجة عالية من الحساسية المفرطة الحساسية الفول السوداني. هذا النموذج الجديد يعتمد على عاملين أساسيين: سبلينوسيتيس (1) على حدة مستضد أدوبتيفيلي نقل من ماوس توعية الفول السوداني إلى ماوس المتلقي ساذج، تطبيع عدد الذاكرة محددة مستضد خلايا ب وتي عبر عدد كبير من الفئران؛ ويتم بعد ذلك عزز الفئران المستفيدة (2) مع إيمونوجين متعددي قوية في شكل جسيمات نانوية الاسمافرون عرض حساسية الفول السوداني الرئيسية (ح ارا 2). والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو في إمكانية تكرار نتائج، مما يقلل عدد الحيوانات المستخدمة في كل دراسة، مع التقليل من عدد الحيوانات تلقي حقنات متعددة من adjuvant في نهاية المطاف. وتوفر الجمعية وحدات من هذه الدهنية مكسبه التكيف سهلة نسبيا لنماذج أخرى الحساسية أو المناعة الذاتية التي تنطوي على الأجسام المسببة للأمراض.
Introduction
الحساسية الغذائية يؤثر على نسبة 8% أطفال في الولايات المتحدة، وقد زاد في الانتشار على مدى العقد1. يؤثر على 1 في المائة أطفال الحساسية للفول السوداني وليس المتضخمة عادة2. على الرغم من أن عدة تجارب سريرية واعدة تجري حاليا لعلاج الحساسية للأغذية، بما في ذلك العلاج المناعي عن طريق الفم (OIT) والعلاج المناعي تحت اللسان (الشق) ابيكوتانيوس المناعي (EPIT)، لا يوجد حاليا لا استراتيجيات العلاج التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير الفلورايد الأفراد حساسية الفول السوداني3،4،5،6،،من78. ولذلك، يجب أن دقة تجنب حساسية الأفراد حساسية لتجنب الحساسية المفرطة. تبقى العديد من الأسئلة فيما يتعلق بطرق التوعية والكامنة وراء آليات لتنمية الحساسية الغذائية.
نماذج الفأرة أداة قيمة لدراسة آليات الحساسية، فضلا عن تطوير توليروجينيك جديدة والحساسية العلاجات9،10،،من1112. وهذا صحيح بصفة خاصة نظراً لحساسية الفول السوداني الرئيسية (ارا ح 2؛ Ah2) في البشر هو أيضا وصف الحساسية الغالبة في عدة الماوس نماذج13،14. في حين لا تقدر بثمن في دراسة آليات التوعية والتسامح نماذج الماوس من حساسية الفول السوداني، هو عيب أنهم يمكن أن يكون متغير وتتطلب استخدام المواد المساعدة. إيمونوجينس أقوى هو السبيل الوحيد للحد من تقلب الجوهرية لهذه النماذج. حيث يتم تنشيط الخلايا البائية بشدة من متعددي مولدات المضادات، مولده الدهنية عرض الحساسية خيار جيد بسبب قدرتها لتنشيط الخلايا البائية يحتمل أن تكون من خلال مستقبلات الخلية ب (المركز) بينما أيضا وجود ملك لكفاءة فتيلة حجرة تي خلية عن طريق يجري تناولها غير تحديداً بعرض مستضد الخلايا.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للتصريف المستضدات البروتين إلى جسيمات نانوية الاسمافرون استخدام استراتيجية سهلة ووحدات. استخدام مستضد مركب، ويفتت المضادة IgM القوات المسلحة البوروندية، نبدي قوية كيف يمكن أن تكون هذه الدهنية مولده في تحفيز ب-خلية التنشيط. واستخدمت الدهنية مستضدي عرض مستضد Ah2 تطوير نموذج ماوس جديدة الممنوحة للحساسية. في هذا النموذج، يتم نقل سبلينوسيتيس من التحقق من الفئران حساسية الفول السوداني، التي تحتوي على ذاكرة خاصة بالفول السوداني ب وخلايا تي، في الفئران كونجينيك ساذج. هي استجابات جسم الذاكرة الناجم عن حقن الدهنية مترافق مع Ah2 في الفئران المستفيدة، من أجل حمل الأجسام المضادة ضد Ah2. تليها دفعة واحدة فقط مع Ah2 القابلة للذوبان، الأجسام المضادة Ah2 محددة تؤدي إلى استجابة قوية تحسسي عند وتحدي هذه الفئران في وقت لاحق مع Ah2. كما الفئران تمر الارتكاس التحسسي الاستجابة بطريقة موحدة إلى حد كبير ولم نتلق adjuvant، هذا النهج نموذج مرغوب فيه حساسية الفول السوداني والنتائج تشير إلى أن التقرير قد يكون أداة في نماذج أخرى الماوس مدفوعا بمولدات المضادات التي تستهدف المواد المسببة للحساسية، وربما أوتوانتيجينس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأسلوب العام من اقتران البروتين للدهن وإدماج في الدهنية يستند إلى حد كبير سابق عمل15. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه بجامعة كارولاينا الشمالية في "تشابل هيل رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). جميع الفئران المستخدمة في نموذج حساسية الفول السوداني هي بالب/cJ الإناث التي تم شراؤها من 3 أسابيع من العمر. جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (ACUC) قد وافق التجارب التي تنطوي على استخدام الماوس الطحال لتحليل السابقين فيفو من الفئران C57Bl/6 من 6 أسابيع على الأقل من العمر.
1-تصريف مستضد بروتين إلى دهن سي
- إضافة الجيل الثالث 3g حبات جل ديكستران cross-linked مع وجود مجموعة من دالتونس 1,500 – 30,000 (دا) قارورة فراغ 250 مل. إضافة 60 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويحرك باستمرار مع شريط إثارة مغناطيسية. ختم قارورة ونعلق على فراغ لبدء فصل الغاز على صفيحة ضجة للحد ني ح 1.
- في عمود الفصل لوني لزجاج 1.0 سم × 30 سم مع سداده دوران مغلقة، إضافة برنامج تلفزيوني للعمود لغسل. فتح سداده دوران واستنزاف العمود. بعد الغسيل، إضافة الطين الخرز دي المشككين إلى العمود. باستمرار إضافة الملاط حتى هي معبأة في العمود بارتفاع 24 سم تقريبا حبة.
- مرة واحدة العمود 'رأس' حوالي 4 – 5 سم من برنامج تلفزيوني أعلاه الخرز معبأة، تكون الخطوات التالية جاهزة.
- إنشاء سيفون تدفق جاذبية بقياس قطعة من أنابيب طويلة بما يكفي للوصول إلى رف 1-2 أقدام فوق رأس العمود وإنشاء حلقة يسقط بالقرب من أسفل العمود وترجع إلى أعلى العمود. إضافة سداده دوران إلى واحدة من نهاية الأنبوب، ترك جانب واحد من فتح الأنابيب. ضع نهاية الأنبوبة مفتوحة في زجاجة 500 مل من برنامج تلفزيوني ووضع على الرف بأعلى العمود.
- نهاية بسداده دوران وإرفاق حقنه 10 مل. فتح صمام سداده الدوران على خط الأنابيب ورسم برنامج تلفزيوني من خلال الأنبوب. مجرد برنامج تلفزيوني وصل إلى ثلاثة أرباع الطريق من خلال الأنبوب، بسرعة إزالة المحاقن وإضافة سداده دوران إلى أعلى العمود — يجب أن يشغل السائل على العمود.
ملاحظة: يجب أن يكون مقدار 'رأس' في برنامج تلفزيوني غادر على رأس العمود بين 1 و 3 سم. الحد الأدنى لغسل العمود 3 العمود مجلدات.
- تحديد كمية البروتين (الشامات) لترتبط بالدهون استناداً إلى الوزن الجزيئي (ميغاواط).
ملاحظة: الجزء Fab الماعز بالماوس المضادة IgM (نفسها مفتش) يستخدم هنا مستضد بديل عالمي لتنشيط الخلايا البائية [بولكلونل]. تبعاً لذلك، بلغة القوات المسلحة البوروندية من الماعز مفتش ميغاواط من حوالي 48 كيلودالتون (كاتشين) وهو متاح تجارياً بكمية إجمالية 1.3 ملغ. وبالتالي، من كمية البروتين ربط 27.1 µmol. - تحديد معامل الانقراض من بروتين الفائدة. إذا كان غير معروف، قياس امتصاص البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي والفجوة قيمة280 عدد من جزيئات المحسوبة في الخطوة 1، 4.
ملاحظة: انقراض co كفاءة من القوات المسلحة البوروندية ماعز مفتش في 280 نانومتر هو م 64,600-1. - لضمان أن تتبع المبالغ التي تحتوي على أمين تتم إزالة المخزن المؤقت، وتحلية البروتين في العمود التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.1-1.3 وجمع الكسور البروتين إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب (~ 500 ميليلتر كل جزء).
- إغلاق صمام دوران سداده متصلة بالجزء العلوي للعمود وإزالة الجزء العلوي من العمود. إذا لم يكن بالفعل فتح، وفتح صمام سداده دوران في الجزء السفلي من العمود والانتظار حتى 'رأس' برنامج تلفزيوني يضرب الجزء العلوي من الخرز.
- ببطء إضافة في بروتين الفائدة إلى الأعلى من استخدام زجاج الخرز ماصة باستور، مع الحرص على تقليل الاضطرابات إلى الجزء العلوي من الخرز.
- بمجرد 'رأس' حل البروتين وصلت إلى الجزء العلوي من الخرز، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني بلطف عبر ماصة باستور. كرر ثلاث مرات. إضافة برنامج تلفزيوني لإنشاء رأس من 4 – 5 سم وكرر الخطوة 1.3 لغسل العمود.
ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان من المؤكد أن أي مخزن مؤقت الذي يحتوي على أمين موجود.
- تحديد الكسور التي تحتوي على البروتين بقياس القيم A280 وتجمع الكسور التي تعطي حوالي 90% في الانتعاش من البروتين.
ملاحظة: هذا يخفف عادة البروتين 1.5-2-إضعاف. تحديد تركيز البروتين بعد تجميع. تركيز البروتين في هذه الخطوة، إذا لزم الأمر، استخدام مركزات الطرد المركزي. - إضافة ما يعادل 2.5 المولى كروسلينكير هيتيروبيفونكشونال للبروتين.
- أولاً، تزن حوالي 5 ملغ سوكسينيميديل 3-(2-بيريديلديثيو) بروبيونات (سبدب، MW = 314 g/mol) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. لتحديد الحجم تذوب في سبدب وأخذ تركيز البروتين المولى واضربها ب 250 x لإيجاد حل 100 x التي ستعطى فائض مولى 2.5 في رد الفعل.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان تركيز البروتين 50 ميكرومتر، من سبدب في 12.5 ملم هناك حاجة إلى حل. ل 5 ملغ سبدب، وهذا يناظر 1.27 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
- أولاً، تزن حوالي 5 ملغ سوكسينيميديل 3-(2-بيريديلديثيو) بروبيونات (سبدب، MW = 314 g/mol) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. لتحديد الحجم تذوب في سبدب وأخذ تركيز البروتين المولى واضربها ب 250 x لإيجاد حل 100 x التي ستعطى فائض مولى 2.5 في رد الفعل.
- إضافة سبدب لبروتين مصلحة في إضعاف 1: 100. ضع رد فعل على شاكر التذبذب في درجة حرارة الغرفة (RT) لحوالي 1 ح.
- لإزالة سبدب الزائدة وحماية bond(s) ثنائي كبريتيد الذاتية، في البروتين في فترة خطوة التخفيض اللاحقة، وحجته وتغسل العمود التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.1-1.3 في 100 ملم خلات الصوديوم (نواك) على درجة الحموضة 5.5 أو إنشاء عمود مطابق للاستخدام فقط في هذا المخزن المؤقت.
- بعد حضانة ح 1 مع سبدب، تحلية البروتين في العمود اكويليبراتيد في 100 مم ناواك. القيام بهذه الخطوة بطريقة مماثلة كخطوة 1.6 ما عدا استخدام 100 ملم نواك (pH 5.5) كما الوينت. جمع الكسور وتحديد A280، وتجمع الكسور الأعلى. أغسل العمود في برنامج تلفزيوني.
- تعد حلاً من 2.5 م من DTT (MW = 154 غ/مول) في ازدواجية المقطر المياه (ddH2س). إضافة 25 مم DTT للكسور المجمعة من البروتين لمدة 5-10 دقائق.
- قياس أ280 من البروتين، وهذه القسمة على معامل الانقراض. كما أن تحديد A343. حساب نسبة الربط استناداً إلى مولاريتي من البروتين (280)، ورابط (343).
ملاحظة: إيقاف السيارات A340-المعايرة إذا استخدام جهاز المطياف الضوئي نانودروب. يمثل قياس343 بامتصاص الفريق 2-ثيوني بيريدين (معامل الانقراض = 7550 م-1) التي تتم إزالة من كروسلينكير سبدب بالقيمة. نسبة مولى لرابط: نسبة البروتين من 1.2 – 1.5 عموما يتحقق عند القيام برد فعل مع فائض مولى 2.5 من الشعبة في طائفة واسعة من البروتينات. - تشغيل الكسور المجمعة عبر العمود غسلها في برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه. جمع الكسور وتحديد A280، وتجمع الكسور الأعلى. تحديد تركيز البروتين التي A280 بعد تجميع الكسور.
- إعداد دسب-شماعة (2000)-ماليميدي (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)--ماليميدي. وهذا سوف تضاف إلى البروتين بنسبة 10:1 مولى. إعداد مخزون 100 x دسب-شماعة (2000)-ماليميدي لتحقيق التركيز المطلوب.
- على سبيل المثال، إذا كان تركيز البروتين 10 ميكرون بعد الخطوة 1، 14، إعداد مخزون من دسب-شماعة (2000)--ماليميدي في 10 ملم. تزن بعناية على شماعة دسبي (2000)-ماليميدي (MW = 3000 g/mol) وإضافة كمية مناسبة من [دمس]. قد تحصل على جولات متعددة للطيف فورتيكسينج وسونيكاتينج فحلت تماما.
- تحديد الحجم الإجمالي للكسور من الخطوة 1، 14 وتحويل الحل بعناية إلى صغيرة (10-25 مل) جولة أسفل قارورة (المصرف). إضافة المقدار المناسب من 100 × دسب-شماعة (2000)-ماليميدي للبروتين لتحقيق علامة x 1، إذ المولى التركيز الزائد، والنهائي. بلطف دوامة الحل للتأكد من أن [دمس] الكامل موزعة.
- تشغيل رد الفعل بين عشية وضحاها تحت النيتروجين في المصرف مختومة. استخدم الغشاء المطاطي وفي غطاء دخان.
- إزالة الغلاف الجوي عن طريق ثقب في الحاجز بإبرة ز 20 المرفقة بحقنه 3 مل في نهاية الأنابيب التي تعلق على فراغ، ودورة على فراغ ل s 3 – 5.
- استبدال الغلاف الجوي مع النيتروجين. ملء بالون المرفقة بحقنه 3 مل خفض إلى النصف مع النيتروجين وإرفاق إبرة 20 غ. ثقب الحاجز لملء الغلاف الجوي داخل قارورة أسفل جولة مع النيتروجين. كرر إزالة الغلاف الجوي واستبدالها بالنيتروجين مرة أخرى وترك البالون النيتروجين تعلق بين عشية وضحاها.
- إعداد عمود حبة جل ديكستران cross-linked منفصلة مع وجود مجموعة من 4,000 – 150,000 دا في عمود الفصل لوني لزجاج 1.0 سم x 50 سم (حسب الخطوات 1.1-1.3).
- في اليوم التالي، إزالة البروتين من قارورة أسفل جولة أعد الخطوة 1.17 وتشغيل (اتبع الطريقة المستخدمة في الخطوة 1، 6) على العمود حبة جل ديكستران cross-linked (من الخطوة 1، 18).
ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي تحميل على العمود لا يزيد عن 2 مل. إذا تم استخدام فعل أكبر، انقسم إلى اثنين وتشغيل في أعمدة منفصلة أو تشغيل على عمود قطر أكبر.- جمع الكسور وتحديد ألف280، تجمع الكسور أعلى، وتحديد تركيز البروتين. لن يؤثر وجود الدهن القياسات.
- تخزين الكسور المجمعة النهائية المرتبطة بالدهن البروتين في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
2. إعداد الحويصلية
- وزن خارجاً الدهون: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 ميجاوات = 2805.5 g/mol؛ ميغاواط (3b-هيدروكسي-5-تشوليستيني، 5-تشوليستين-3b-الرتب الأخرى)، الكولسترول = 386.7 g/mol؛ ودسبك (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) ميغاواط = 790.1 ز/mol. إنشاء حل 5 ملغ/مل دسبك والحل 4 مغ/مل من نسبة الكولسترول في الدم، والحل 2 مغ/مل من DSPE-PEG(2000) في كلوروفورم.
- التأكد من أن نسبة الدهون في الدهنية المولى: 57% دسبك، 38% نسبة الكولسترول في الدم، و 5% DSPE-PEG(2000)، كما هو ممثل في الجدول 1.
ملاحظة: من المهم للتحكم في مقدار مستضد على الحويصلية، التي تتراوح عادة بين 0.01-0.1%. ويستخدم في الجدول 1، 0.1% من الماعز الماوس المضادة IgM القوات المسلحة البوروندية يفتت مرتبطة بدهن سي. من المهم أن تأخذ في الاعتبار المولى إذ الزائدة من شماعة دسبي (2000)-ماليميدي الذي تمت إضافته إلى البروتين في الخطوة 1، 15، ضمان عدم تجاوز المبلغ الإجمالي للدهون سي 5%. - النظر في المبالغ النهائية في الدهون (µmol) عند إنشاء الدهون لقذف. انظر الجدول 1 للحصول على مثال لحساب تركيزات الدهون المولى لخلق الدهنية بتركيز دهن مجموع ميكرومتر 1.25.
- بمجرد تم حساب المبلغ الصحيح لكل الدهن تضاف معا، الجمع جميع أنبوب اختبار زجاج البورسليكات 12 مل.
-
ينفخون في كلوروفورم بعناية.
- استخدام الأنبوب وحقنه 3 مل مع الإبرة، أعدت في خطوة 1.17.1، لتفجير بعناية كلوروفورم في الأنبوب مع النيتروجين. بلطف ضربة تيار نيتروجين في الحل أثناء تدوير الأنبوبة باليد الأخرى. احرص على تقليل الرش أو التسبب في السائل لتشغيل الطريق حتى الجانب من الأنبوب كما أنه قد يكون أكثر صعوبة للحصول على هذا في الحل في الخطوة التالية.
- إضافة 100 ميليلتر من [دمس] لكل أنبوبة وليوفيليزي هذا الحل بين عشية وضحاها. يغطي الجزء العلوي من الأنبوب مع مسح مختبرات غير ثابتة، أماناً مع شريط المطاطي، وتجميد-80 درجة مئوية.
3-الحويصلية البثق
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على بروتين مرتبطة بالمادة الدهنية إلى 12 مل الأنبوبة التي تحتوي على الدهون. Sonicate الحل لما يقرب من 30 ثانية إلى 1 دقيقة في حمام مائي sonication. الراحة لمدة 5 دقائق أو أكثر بين كل جولة، وكرر 3 – 4 مرات.
-
إعداد الطارد حسب توجيهات الشركة المصنعة.
- إضافة يدعم مرشح لدعم الغشاء الداخلي، وضع بضع قطرات (10 ميليلتر في كل) من برنامج تلفزيوني على الفيلم البارافين. استخدام الملقط، الاستيلاء على حافة لدعم مرشح وتراجع ذلك في إسقاط 10 ميليلتر.
- وضع التصفية داخل يا الدائري. القيام بهذا لكلا الجانبين. استخدام الملقط، الاستيلاء على عامل تصفية 0.8 ميكرومتر على الحافة وتراجع في إسقاط 10 ميليلتر ومعطف خارج الدائري مع برنامج تلفزيوني. وضع التصفية 0.8 ميكرومتر بلطف على الدائري حيث لا عامل التصفية ليست أكثر من تعليق دعم الغشاء الداخلي.
- وضع كتلة تدفئة الطارد على صفيحة ساخنة للحرارة مسبقاً في الطارد. التبديل صفيحة منخفضة وتسمح الطارد تدفئة كتلة للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. لتجنب المشاكل المحتملة مع تجميع البروتين، عدم تسخين كتلة الماضية 37 درجة مئوية.
- تحميل عينة سونيكاتيد إلى واحدة من المحاقن extruding وضعها في الطارد. ضع المحاقن الطارد في الطرف الآخر من الطارد. تأكد من تعيين المكبس المحاقن الفارغة إلى الصفر. سيتم ملء المحاقن الفارغة كما هو مقذوف الدهن عبر غشاء البولي 0.8 ميكرومتر. في محاولة لتجنب تمرير فقاعات ذهابا وإيابا عبر الغشاء.
- المكان الطارد مجمع بشكل كامل إلى كتلة التدفئة. ادفع برفق المكبس لحقنه مليئة بالدهون للمحاقن الفارغة. اعتماداً على تركيز المادة الدهنية، وهذا سيكون من الصعب على الدفع من خلال. كرر 20 x.
- إزالة الطارد مجمع بشكل كامل من كتلة التدفئة. ببطء إزالة المحاقن شغلها من الطارد، يجب التأكد من جمع أي الدهون التي قد تسرب عند إزالة. ضع الدهنية في قنينة نظيفة. كرر الخطوات من 3، 3، 4-6 استخدام البولي 0.2 ميكرون و 0.1 ميكرومتر الأغشية.
- إنشاء عمود حبة cross-linked [اغروس]2 0.7 x 50 سم مع مجموعة الفصل 0.7-10 ميجا دالتونس (MDa) اكويليبراتيد في برنامج تلفزيوني. إضافة الدهنية وتشغيل كما هو الحال في الخطوة 1، 6. وانخفضت الكسور التي تحتوي على الدهنية سوف انتقال الضوء في حدود 250 – 400 نانومتر.
- تخزين الدهنية عند 4 درجة مئوية ولا تجمده.
4-الكالسيوم التمويه لمراقبة تفعيل ب-الخلايا الدهنية مستضدي
- Euthanize الفئران بثاني أكسيد الكربون (CO2) أو جرعة isoflurane، وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة المؤسسية. تأكيد القتل الرحيم للفئران بخلع عنق الرحم.
- تعقيم الأدوات الجراحية والذبيحة الفئران باستخدام الإيثانول 70%. استخدام 10 سم طويلة، نصيحة 0.8 ملم، منحنى ملقط القزحية لفصل الجلد الذي يغطي تجويف الصدر من القفص الصدري. استخدام 10 سم منذ فترة طويلة، على التوالي تشريح مقص جعل شق القاصي مع شق ثنائية.
- استخدام الملقط آيريس المنحنية ومقص تشريح لاستخراج الطحال من تجويف البطن. إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة الطحال وثم وضعه في أنبوب مخروطي البوليستيرين 15 مل مليئة RPMI1640 المتوسطة التي تحتوي على 1% العجل الجنين المصل (FCS) والبنسلين والستربتوميسين.
- نقل الطحال ووسائط الإعلام على مصفاة خلية 40 ميكرومتر تركيبها على أنبوب مخروطي 50 مل. برفق باستخدام المطاط نهاية المكبس حقنه 3 مل، سحق الطحال. أغسل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع وسائل الإعلام. كرر هذه العملية حتى يتم ترك فقط الأنسجة الدهنية في مصفاة ميكرومتر 40 على الخلية. شطف غربال مع 3-5 مل من وسائل الإعلام لزيادة استرداد الخلية.
- الطرد المركزي هوموجيناتي خلية في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية وإضافة 10 مل من 1 x ربك تحلل العازلة لبيليه. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، وتترك لمدة 2 – 3 دقيقة في RT، وثم الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند سبلينوسيتيس خلايا الدم الحمراء المنضب في 10 مل من وسائل الإعلام. تحديد أرقام مجموع الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو خلية أخرى عد الجهاز. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: هو تركيز النهائية المثالية اللازمة لتحميل الهندية-1 سبلينوسيتيس 10 – 20 × 106 خلايا/مل، ولكن يمكن استخدام تركيز أقل من الخلايا. - ريسوسبيند سبلينوسيتيس في 15 × 106 خلايا/مل في تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت (المتوسطة RPMI1640 التي تحتوي على 1% سفح المنحدر القاري، 10 ملم 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك حامض (هيبيس)، كلوريد المغنيسيوم 1 مم (MgCl2)، (جليكول-مكررا 1 مم Β-أمينو إيثايل البروم ثنائي الفينيل)-ن، ن، ن '، ن'--تيتراسيتيك الحمضية (اجتا)، و 5% البنسلين-ستربتوميسين). إضافة في 1.5 ميكرومتر الهندية-1 من حل أسهم [دمس] 1 مم، عكس الأنبوب عدة مرات المزيج. حماية من الضوء، واحتضان خلايا في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وبعد تفريخ 30 دقيقة، إضافة في 5 × مقدار تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 7 دقائق في الرايت
- النابضة في الخلايا ب، وصمة عار الخلايا مع الماوس المضادة 1: 200 CD5-PE والماوس المضادة 1: 200 B220-PE/Cy7 في 0.5 مل من تحميل المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية مدة 20 دقيقة، محمية من الضوء.
- أغسل سبلينوسيتيس في تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز 7 دقيقة في الخلايا "الرايت ريسوسبيند" في 10 – 20 × 106 خلايا/مل في تدفق الكالسيوم تشغيل المخزن المؤقت (هانك لموازنة محلول الملح (حبس) يحتوي على السفح 1%، 1 MgCl2 و 1 ملم كلوريد (كاكل2) من الكالسيوم). تخزين على الجليد، ومحمية من الضوء حتى جاهز لتشغيل على تدفق سيتوميتير.
-
إعداد التدفق الخلوي مع ضوابط وصمة عار أونستينيد وواحد للتعويض.
- تشغيل الخلايا الملون لإعداد البوابات على النحو المناسب (انظر الشكل 2 أ). الإعداد الهندية-1 (البنفسجي) مقابل الأرض الهندية-1 (أزرق)، وضبط الفولتية في القنوات الهندية-1 وضع الخلايا تلطيخ في منحدر من 45 – 60 ° إلى أقصى حد الإشارة: نسبة الضوضاء من البنفسجي الهندية-1: تغيير الأزرق في نسبة بعد تنشيط الخلية ب.
ملاحظة: تأكد من أن الفولتية ليست مرتفعة للغاية، حيث أن نسبة كبيرة من الخلايا (> 5%) هي ضد الأعلى من الأرض. - إنشاء بوابة قطري بتغليف الجزء الأيسر العلوي (فيوليت+الأزرق–) من الأرض، بدون تحفيز < 10% الخلايا في البوابة، التي ينبغي أن تزيد من الناحية المثالية إلى > 75% بعد التحفيز.
- تشغيل الخلايا الملون لإعداد البوابات على النحو المناسب (انظر الشكل 2 أ). الإعداد الهندية-1 (البنفسجي) مقابل الأرض الهندية-1 (أزرق)، وضبط الفولتية في القنوات الهندية-1 وضع الخلايا تلطيخ في منحدر من 45 – 60 ° إلى أقصى حد الإشارة: نسبة الضوضاء من البنفسجي الهندية-1: تغيير الأزرق في نسبة بعد تنشيط الخلية ب.
-
إضافة 0.5 مل خلايا إلى 5 مل توج الجولة أسفل الأنبوبة البوليستيرين (خلية تنشيط fluorescence فرز أنابيب (نظام مراقبة الأصول الميدانية)) والخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق في حمام مائي دافئ. ضع الأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية في الدائرة 37 درجة مئوية واتيرجاكيتيد متصل بحمام مائي إعادة تعميم.
- تشغيل الأنبوب واتيرجاكيت على سيتوميتير تدفق والشروع في اقتناء، دون تخزين البيانات، وفي حوالي 5,000 – 10,000 الأحداث/s. متى استقرت الخلايا (15 – 30 ثانية)، بدء البيانات اقتناء وجمع البيانات لمالا يقل عن 10 s لوضع الخلفية.
- عند علامة s 10، بسرعة إزالة الأنبوب من cytometer تدفق وإضافة التحفيز (5-50 ملم الدهنية مولده في 2 – 20 مل)، ودوامه النبض، والعودة أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية على cytometer التدفق. الحفاظ على الحصول على البيانات والتخزين من خلال هذا الوقت، وجمع البيانات لمدة 3 – 5 دقائق.
- تحليل البيانات في برامج التحليل المناسب تحت مهام حركية.
5-إعداد استخراج الفول السوداني
- استخراج بروتينات الفول السوداني بخلط طحين الفول السوداني بنسبة 1:5 (wt:vol) من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1 م كلوريد الصوديوم (NaCl). مزيج الحل على لوحة إثارة المغناطيسية ح 2 في الرايت مع الاحتفاظ في pH 8.5.
- حل أجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية. صب وتصفية-تعقيم المادة طافية تسلسلياً من خلال عامل تصفية 0.4 ميكرومتر تليها فلتر 0.2 ميكرون. تحديد تركيز البروتين بمقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك استخدام ألبومين المصل البقري (BSA) كالمعيار.
- تقليل وتؤذي عينة بروتينات الفول السوداني مع ديثيوثريتول 50 ملم (DTT) في المخزن مؤقت الذي يحتوي على الليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، مما يسمح للنشاط القصوى الفلزي والحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تشغيل 10 ميكروغرام للتشويه والتحريف بروتين الفول السوداني في تريس مكررا 4 – 12% بريكاستيد بولياكريلاميدي هلام مصممة لإعطاء الفصل الأمثل جل التدرج مع الوزن الجزيئي قبل الملون القياسية.
- وصمة عار للهلام مع تريفينيلميثاني ديسولفوناتيد وديستاين مع ddH2تحديد O. تعرف حساسية الفول السوداني الرئيسية ارا ح 1 و 2 و 3 في استخراج الأعمال التحضيرية. ح ارا 1 يظهر في كاتشين 63، ح ارا 2 يجب أن تظهر ك isoforms اثنين في كاتشين 17 و 19، ويظهر ح ارا 3 كاتشين 37 (وحدة فرعية الحمضية).
6-توعية فئران للفول السوداني
- ريسوسبيند 1 ملغ الكوليرا السمية في 1 مل من الماء عالي النقاوة. إعداد 200 ميليلتر المخفف استخراج الفول السوداني التي تحتوي على بروتين الفول السوداني 2 مغ والسمية الكوليرا 10 ميكروغرام في برنامج تلفزيوني.
- إدارة 200 ميليلتر من استخراج الفول السوداني التي تحتوي على السم (بروتين الفول السوداني 2 ملغ و 10 ميكروغرام الكوليرا السمية) الكوليرا عن طريق تزقيمية الشفوي لكل أسبوع 4 – 5 القديمة بالب/cJ الماوس الإناث. كرر مرة واحدة في أسبوع لمدة ثلاثة أسابيع (أي أيام 0 و 7 و 14).
- إدارة 300 ميليلتر المخفف استخراج الفول السوداني (الذي يحتوي على بروتين الفول السوداني 5 ملغ و 10 ميكروغرام الكوليرا السمية) عن طريق الفم تزقيمية مدتها لكل الماوس في الأسبوع الرابع (أي، 21 يوما).
7-التحدي الفئران مع استخراج الفول السوداني
- في يوم 28، إعداد استخراج الفول السوداني بتركيز 1 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني نهائي. قياس درجة حرارة الجسم الأساس باستخدام مقياس حرارة مستقيمي (حوالي 37.5 – 38.5 درجة مئوية). إدارة 200 ميليلتر (200 مكغ) استخراج الفول السوداني عن طريق الحقن داخل (القائمة).
- قياس درجة حرارة الجسم مع الحرارة المستقيمي كل 15 دقيقة ح 1 بعد الحقن. ويشير إلى تراجع في درجة حرارة الجسم الحساسية للفول السوداني.
ملاحظة: انخفاض درجة حرارة الجسم السمة مميزة لفرط الحساسية في الفئران. وسوف يثبت هذا التحدي أن الفئران حساسية من الفول السوداني. عادة، وضع 90% فئران بالب/cJ التي يخضع لها البروتوكول التوعية الحساسية خلال التحدي التي تتميز بانخفاض درجة حرارة 2-3 درجة مئوية على الأقل.
8-عزل سبلينوسيتيس من حساسية الفئران ونقل التبني
-
عزل سبلينوسيتيس من السذاجة والفئران حساسية الفول السوداني.
- في يوم 30، euthanize ساذجة وتأكدت من الفئران حساسية الفول السوداني بإدارة 3 لتر في الدقيقة من CO2 في غرفة الغاز. تأكيد القتل الرحيم للفئران بواسطة thoracotomy الثنائية. تعقيم الأدوات الجراحية والذبيحة الماوس باستخدام الإيثانول 70%. استخدام الملقط لفصل الجلد الذي يغطي تجويف الصدر من القفص الصدري. استخدام مقص تشريح مستقيم جعل شق ثنائية كسر الأضلاع اليمنى واليسرى.
- استخدام الملقط ومقص تشريح لاستخراج الطحال من تجويف البطن. إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة الطحال قبل وضع في الأنبوبة المخروطية البوليستيرين 15 مل، مليئة بمتوسط 10 مل 1640 ربمي.
- في غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة، صب الطحال ووسائط الإعلام في البوليسترين 35 مم طبق بيتري. تبقى ساذجة وحساسية سبلينوسيتيس في أطباق بتري منفصلة ووسائل الإعلام خلال عزل الخلية. استخدام الملقط المعقم وتشريح المقص لقطع الطحال إلى ثلاث قطع والعودة إلى طبق بيتري.
- استخدام حافة خشنة، متجمد الزجاج مجهر شريحتين، بلطف مجانسة (في ربمي) القطع الطحال حتى تبقى الأنسجة البيضاء بين الشرائح. تغيير الشرائح بين المجموعات.
- نقل الخلية هوموجيناتي من صحن بيتري من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر تركيبها على أنبوب مخروطي 50 مل. تمرير أجزاء الطحال المتبقية من خلال المصفاة مع المكبس من حقنه 1 مل. شطف غربال مع 5 مل ربمي إلى أقصى حد خلية الإنعاش. نقل فيلتراتي إلى أنبوب مخروطي البوليستيرين 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي (450 x ز، 10 دقيقة، RT).
- نضح المادة طافية وإضافة ريسوسبيند خلية بيليه في المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء 2 مل (0.83% كلوريد الأمونيوم في 10 ملم تريس العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2). خلط واحتضان في RT 2 – 3 دقيقة إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني-2% FBS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 7 دقائق في الرايت
- تغسل الخلايا مرة أخرى مع 12 مل برنامج تلفزيوني-2% FBS تماما إزالة أي بقايا من كلوريد الأمونيوم، والطرد المركزي في 300 x غ 7 دقيقة في الخلية "الرايت تعليق" إعادة بيليه في 2 مل متوسط RPMI 1640. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو محلل الدم التلقائي.
- 27 زاي، إبرة 5/8 بوصة في حقنه الأنسولين 1 مل، باستخدام حقن الوريد 15 × 106 حساسية أو السذاجة سبلينوسيتيس استخراج كما هو موضح أعلاه (في 200 ميليلتر) عن طريق الوريد الذيل في الفئران السذاجة (أونسينسيتيزيد).
9-حقن الفئران مع ارا ح 2 الدهنية مستضدي
- إعداد Ah2 الدهنية المحتوية على 0.1% Ah2 في الدهن 2.5 ملم. لحساب تركيز البروتين، هو معامل الانقراض Ah2 م 15,000-1. تمييع الدهنية إلى 300 ميكرون في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- يوم واحد بعد نقل التبني (يوم 31) من حساسية أو السذاجة سبلينوسيتيس، حقن الوريد 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو الدهنية Ah2 مستضدي (300 ميكرون) التي تحتوي على إجمالي 1.38 ميكروغرام من Ah2 عن طريق الوريد ذيل بالب/cJ الفئران التي حصلت سبلينوسيتيس في الخطوة 8.2.
10-دفعة والتحدي المتمثل في الفئران مع ارا ح 2
- استخدام أسبوعين بعد الحقن مع Ah2 الدهنية، في يوم 45، انسيت حيوان 4 مم لجمع 50 – 200 ميليلتر من الدم من مفرق اللهاة من الماوس. جمع الدم في أنبوب فاصل مصل دون الهيبارين؛ منفصلة المصل من سينتريفوجينج في س 6,000 ز عن 15 دقيقة استخدام المصل التي جمعت في وقت لاحق إلى قياس محددة مستضد الأجسام المضادة.
- اليوم 46، أسبوعين بعد حقن الفئران الدهنية (الخطوة 9.2)، تعزيز الفئران بحقن القائمة من 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو 200 ميكروغرام من Ah2 القابلة للذوبان (تنقية كما هو موضح سابقا16).
- اليوم 60، جمع 50-200 ميليلتر من الدم من مفرق اللهاة من الماوس، وتجهيز الدم كما هو موضح سابقا.
- في يوم 61، تحدي كل مجموعة من الفئران بحقن القائمة من 200 ميليلتر من 300 ميكروغرام Ah2 القابلة للذوبان. قياس درجة حرارة الجسم مع المسبار المستقيمي كل 15 دقيقة كما هو الحال في المادة 7.
11-تحديد مقدار ح ارا 2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي و IgG1 قبل أليسا
- معطف مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم 96-جيدا (أليسا)-لوحة متوافق مع 100 ميليلتر يمتلكهما-التثقيف (2، 4-دينيتروفينيل هابتين ألبومين المصل مترافق للبشرية، 20 ميكروغرام/مل) للمنحنى المعياري أو Ah2 (5 ميكروغرام/مل) لجمع عينات المصل في الخطوات 10-1 و 10-3، تضعف في طلاء المخزن المؤقت (50 مم كربونات بيكربونات المخزن المؤقت، pH 9.6) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو 37 درجة مئوية > ح 1.
- أغسل ثلاث مرات مع 200 ميليلتر PBS-T (برنامج تلفزيوني مع 0.05% توين-20) وكتلة الآبار مع 200 ميليلتر تي برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% جيش صرب البوسنة في 37 درجة مئوية > ح 2.
- أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، إضافة 50 ميليلتر فريق الخبراء الحكومي الدولي-مكافحة-التثقيف المعايير (2 – 0.002 ميكروغرام/ملليلتر، أعد من تخفيف المسلسل 1:2) أو عينات المصل الماوس (01:20 إضعاف) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أليسا IgG1 Ah2 على حدة، لإضافة 100 ميليلتر تنقية معايير IgG1-مكافحة-التثقيف (2 – 0.002 ميكروغرام/ملليلتر، أعد من تخفيف المسلسل 1:2) أو الماوس عينات المصل (تخفيف 1: 500) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1 في 37 درجة مئوية.
- أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، إضافة 100 ميليلتر الأغنام الماوس المضادة فريق الخبراء الحكومي الدولي (0.5 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1. أليسا IgG1 Ah2 على حدة، لإضافة 100 ميليلتر الماعز HRP الماوس المضادة IgG1 (المخفف 1:40,000 في "جيش صرب البوسنة" PBS-تي-2%). احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
- أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. لفريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة Ah2 أليسا، إضافة 100 ميليلتر بيوتينيلاتيد-حمار الغنم المضادة مفتش (0.5 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لإليزا IgG1 Ah2 محددة، قم بالتخطي إلى الخطوة 11.7.
- أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، أضف محايدة مكلفة 100 ميليلتر avidin-الفجل البيروكسيديز (مثلاً، نيوترافيدين-برنامج الصحة الإنجابية، 0.3 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 100 ميليلتر 3, 3 ', 5, 5'--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة، واحتضان 10-15 دقيقة، أو حتى تشغيل عينات اللون الأزرق الداكن، ثم قم بإضافة 100 ميليلتر TMB وقف الحل. قراءة اللوحة في 450 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إثبات تصريف بروتين الاهتمام مع DSPE-PEG(2000) التي تعمل تقليل تظهر زيادة في الوزن الجزيئي بالمقارنة مع البروتين أونكونجوجاتيد. يظهر الشكل 1A هلام ممثل للماوس المضادة IgM F(ab) يفتت الاقتران على شماعة-دسب، مما يدل باندشيفت 2 – 3 كاتشين للبروتين التشويه والتحريف. لاحظ ظهور ما يقرب من 50 في المائة البروتين إلى التعديل، الذي من المتوقع أن تحقق ستويتشيوميتري 1:1 في جزء على القوات المسلحة البوروندية التي يتم هيتيروديمير من السلسلة الثقيلة والخفيفة. ويبين الشكل 1B هلام ممثل لتصريف Ah2 على شماعة-دسبي. لتقييم تدفق الكالسيوم من الخلايا البائية تحفزها مستضدي الدهنية، هناك شيئان حاسما: (1) أداة إعدادات يتم ضبطها لترى فرق في نسبة الأسفار الهندية-1 في Ca2 + ملزمة (البنفسجي) وغير منضم أشكال (الأزرق) والصحيح (2) النابضة استراتيجية تستخدم لتقييم ب-خلية التنشيط. يبين الشكل 2 ألف مخطط النابضة للمقايسة التمويه الكالسيوم على أساس قياس التدفق. يتم عن طريق بوابة لمفاوية يعيش في ال SSC-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-أ (لوحة اليمنى)، دوبليتس هي عن طريق بوابة الخروج في منتدى التعاون الأمني-ث مقابل SSC-ث مؤامرة (الفريق الأوسط)، و B200+CD5– ب-الخلايا المحددة من مؤامرة مقابل B220-PE/Cy7 CD5 PE (اللوحة اليمنى). يوضح الشكل 2 نسبة الأسفار الهندية-1 (أزرق) مقابل (البنفسجي) الهندية-1 مع مرور الوقت كما تم تحليلها. علما أن تركيز البروتين الكلي F(ab) و F(ab')2 في هذه الاختبارات هي نفسها، مما يدل على قدرة متفوقة مستضدي الدهنية في تحفيز ب-خلية التنشيط. وبعد إعداد استخراج الفول السوداني، تشغيل قاسمة على هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتحديد الكميات النسبية من ح ارا 1 و 2 و 3 في الاستخراج. ويبين الشكل 3 هلام ممثل استخراج الفول السوداني الذي تم تشغيل جنبا إلى جنب مع Ah2 المنقي. ويبين الشكل 4 تخطيطي للطراز الماوس التبني عموما حساسية الفول السوداني، بما في ذلك توعية أولية للفول السوداني، تحديا للفول السوداني، والعزلة سبلينوسيتي ونقل التبني، وحقن الحويصلية، تليها رسم الدم Ah2 دفعة، و التحدي إلى Ah2. كانت تشغيل فريق الخبراء الحكومي الدولي واليساس IgG1 Ah2 محددة كمياً المناعية في المصل، كما هو مبين في الشكل 5 ألف و ب. وسيكون الفئران مع حساسية الممنوحة التي تعززت مع Ah2 Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي و IgG1 في المصل على. هيئة درجات الحرارة المسجلة خلال تحدي Ah2 مبينة في الشكل 5؛ حساسية الفئران انخفضت درجات حرارة الجسم بعد التحدي، بينما درجة حرارة الجسم في الفئران السذاجة ظل ثابتاً. الصور تظهر الفئران السذاجة مقارنة بالفئران حساسية الفول السوداني خلال التحدي الذي يرد في الشكل 6.
رقم 1: جل الممثل لتصريف الماوس المضادة IgM F(ab) و Ah2 على شماعة-دسب- (أ، ب) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل (A) الماعز الماوس المضادة IgM F(ab) يفتت و Ah2 (ب) قبل وبعد الاقتران على شماعة-دسبي. وقد الماعز الماوس المضادة IgM و Ah2 الأوزان الجزيئية كاتشين حوالي 48 و 18، على التوالي. بعد التعديل، لاحظ وزن الجزيئي أكبر قليلاً (كاتشين ~2.5) هو وضوح للبروتينات على حد سواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل النابضة الاستراتيجية والنتائج تدفق الكالسيوم والتحليل- تم تحليل الخلايا (A) من خلال استراتيجية النابضة التالية: يعيش لمفاوية (منتدى التعاون الأمني-أ مقابل SSC-أ)، الخلايا المفردة (منتدى التعاون الأمني-ث مقابل SSC-W)، والخلايا البائية (B220+CD5–). (ب) الهند-1/Ca2 + الجريان الاستجابة (البنفسجي مقابل الأزرق) ب-الخلايا. يظهر هو تدفق الكالسيوم المضادة IgM شظية Fab الدهنية والمضادة IgM F(ab')2 في تركيز البروتين نفسه (2.5 ميكروغرام/مل) فضلا عن المخزن المؤقت-وحفز الخلايا كعنصر تحكم. لاحظ أن من بين 10-22 ق هو عند إضافة التحفيز، ولذلك يتم الحصول على لا بيانات أثناء هذا الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: جل الممثل عرض استخراج الفول السوداني و Ah2- استخراج الفول السوداني تحتوي على بروتينات عدة، بما في ذلك الحساسية ارا ح 1، 2، 3 و 6، بالمقارنة مع isoforms اثنين التي تظهر في Ah2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التخطيطي لبروتوكول نقل التبني- الفئران السذاجة بالب/cJ توعية مع استخراج الفول السوداني (PN) والكوليرا السمية (CT)، وبعد ذلك تحدي للسندات الإذنية. سبلينوسيتيس من الفئران حساسية مؤكدة كانت معزولة وتحويلها إلى الفئران ساذجة. في وقت لاحق كانت جاهزة مع مكسبه ارا ح 2 الدهنية أو برنامج تلفزيوني الفئران، ثم عزز مع Ah2 القابلة للذوبان. وأخيراً، طعن الفئران مع Ah2 لرصد الحساسية المفرطة. الدم التي تم جمعها في أيام 45 و 60 استخدمت لتحديد كمية محددة Ah2 المناعية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الحويصلية ح 2 "ارا مكسبه" يعزز استجابات حساسية الذاكرة ممنوحة. كان المصل قبل معزولة (45 يوما)، وتعزيز وظيفة (60 يوما) مع برنامج تلفزيوني أو 200 ميليلتر من 300 ميكرون مكسبه Ah2 الحويصلية لقياس ايغي Ah2-سيبسيفيك (A) و IgG1 (ب). يتم تمثيل الفئران الفردية مع خطوط تشير إلى المتوسطات. الفئران التي تلقت سبلينوسيتيس حساسية وكانت تدار الدهنية Ah2 في يوم 32 وكانت مستويات أعلى بكثير من IgG1 و Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي. وتم قياس الحساسية المفرطة في مجموعات مختلفة من العلاج عن طريق تسجيل درجات حرارة الجسم بعد Ah2challenge (ج). يعني درجات حرارة الجسم يصور مع السذاجة sem.: برنامج تلفزيوني (السذاجة سبلينوسيتيس ورئيس الوزراء برنامج تلفزيوني)، وحساسية: برنامج تلفزيوني (سبلينوسيتيس حساسية مؤكدة ورئيس الوزراء برنامج تلفزيوني)، وحساسية: Ah2 (أكدت حساسية سبلينوسيتيس ورئيس الوزراء الحويصلية Ah2immunogenic). * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف مزاوج < 0.0001 يحددها الطالب ذو الذيل 2 ر-اختبار. لاحظ أن هذه النتائج هي الممثل لتجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: ملاحظة أعراض تحسسي خلال التحدي Ah2- الفئران ساذجة تظل نشطة وبشرة الوردي على أقدامهم (أ، ج). حساسية الفئران قد انخفض النشاط وهي غالباً ما متحدب، وقد احتملت التنفس وتجربة زرقة، يتبين من قتامة بشرة الأرجواني على أقدامهم (ب، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ميغاواط | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| دسبك | نسبة الكولسترول في الدم | دسب شماعة | دسبي شماعة الزائدة | أ IgM-شماعة-دسب | المجموع | |
| نسبة المولى | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100.00 |
| كتلة (mg) | 0.56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| m مول | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| مل | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| الأسفلت (mg/mL) | ||||||
| دسبك | 5 | |||||
| نسبة الكولسترول في الدم | 4 | |||||
| دسب شماعة | 2 | |||||
| أ IgM-شماعة-دسب | 0.114 |
الجدول 1: العمليات الحسابية لخلق الحويصلية تركيز دهن إجمالي 1.25 ميكرومتر. مثال لحساب الجدول للماعز الماوس المضادة IgM F(ab) يفتت الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة هنا هي بروتوكول عام لتصريف البروتين إلى دهن الذي يتيح عرض البروتين على جسيمات نانوية الاسمافرون. للبروتينات فرعية متعددة كبير جداً، وقد يكون هذا البروتوكول محدودة الأداة المساعدة. وسيكون الأسلوب المثالي الأخذ بالعلامة الخاصة بالموقع التي تمكن استراتيجية ربط بيورثوجونال كيميائية لاستخدامها. إذا كان التعبير عن البروتين ريكومبينانتلي، هذا يمكن أن يكون ممكناً استخدام الاستراتيجيات الخاصة بالموقع المتاحة17، وطائفة واسعة من المجموعات الوظيفية في نهاية المادة الدهنية سي متوفرة تجارياً. وبناء على ذلك، هذا البروتوكول تتجه نحو ربط البروتين المعزولة من المصادر الطبيعية والوصول إلى مجموعة واسعة من العلماء لم تكن مألوفة بالضرورة مع التحولات الكيميائية والبيوكيميائية.
أحد جوانب رئيسية لتشغيل تجربة التمويه كالسيوم والتي ينبغي أن يكون التأكيد على أن لا يتم تنشيط الخلايا قبل تشغيلها على قياس التدفق. إذا لم يتم استخدام تقنية تعقيم صارمة، وهذا سوف حساب إشارة خلفية عالية من تنشيط الخلايا (تميل نحو عن الانبعاثات في القناة البنفسجي الأسفار الهندية-1). وبالمثل، ينبغي أن تظل الخلايا على الجليد قبل تشغيل الفحص لتجنب مستويات غير طبيعية من الإشارات الخلفية في القنوات الهندية-1. من المهم أيضا التأكد من أن الخلايا يتم تسخينها لمدة 2 – 3 دقيقة قبل الحصول على التدفق الخلوي وفي جميع أنحاء التحفيز أثناء الحصول على البيانات. إذا لم يتم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية أثناء الحصول على البيانات، فإنه يمكن توقع أن الخلايا لا تستجيب الحد الأقصى. منذ مستضد محددة ب-خلايا موجودة في الفئران في أرقام صغيرة جداً، استخدام مستضد مركب لتحفيز جميع الخلايا البائية من الفئران مثالي. على الرغم من أن العديد الماوس المعدلة وراثيا سلالات تتوفر أن التعبير عن محددة مستضد الخلايا البائية، والغرض من هذا الأسلوب تمكين المستخدم العادي لتكون قادرة على التحقق من قدرتهم على كسب مستضدي الدهنية باستخدام الفئران البرية من نوع. ولتحقيق هذا الهدف، ترتبط بالدهون شظايا القوات المسلحة البوروندية من الماوس المضادة IgM وصياغتها في الدهنية مستضدي أن تشابك مستقبلات الخلية ب (المركز) بطريقة [بولكلونل]. جدير بالذكر أنه اتضح سابقا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لحفز الإنسان ب-الخلايا10 باستخدام الجزء IgM Fab الإنسان المضادة المناسبة، وهام لأنه ليس من الممكن الوصول إلى إعداد كبيرة من مستضد محددة ب-الخلايا البشرية. في هذه الدراسات، تم توضيح فاعلية الدهنية مولده لتحفيز تنشيط الخلية ب بقدرتهم المعززة للحث على تدفق الكالسيوم مقارنة بكميات متساوية من الماوس المضادة IgM F(ab') 2 الشظايا.
وقد مكن استخدام مستضدي الدهنية تطوير طريقة لتوعية بالب/cJ الفئران للفول السوداني ونقل سبلينوسيتيس من حساسية الفئران في الفئران ساذجة وحقن الفئران المضيف مع Ah2 الدهنية وتحديا لهم مع Ah2. مستويات الأجسام المضادة والردود تحسسي ضمن مجموعات من الفئران تم استنساخه في هذا النموذج. فقد كان راسخة الردود ب وتي خلية الذاكرة ذات أهمية حاسمة في تطوير أجسام مضادة خاصة بالفول السوداني في الفئران. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا أن الذاكرة repopulate ب-الخلايا خلايا البلازما في الفئران، التي تحافظ على مستويات مرتفعة من فريق الخبراء الحكومي الدولي مستضد على حدة؛ ولذلك تعتبر الذاكرة الخاصة بحساسية الخلايا البائية هدفا جذاباً للتدخل العلاجي18. يسمح النموذج الموصوف هنا الآن فرصة لاستهداف خلايا الذاكرة ب Ah2 على حدة، بدلاً من نهج كآبته استخدام bortezomib إلى استنزاف مرجع الخلية بأكملها البلازما19مباشرة. نهج آخر لمكافحة الحساسية الحث على التسامح في حجرة تي خلية. إحدى الاستراتيجيات المحتملة لتغليف المواد المساعدة الذي يحفز التسامح داخل الحويصلية. سابقا، وجسيمات نانوية تغليف ربمسن استخدمت لحمل تريجس ويقلل من أمراض المناعة الذاتية20. ويمكن استخدام هذا النوع من النهج لتطوير العلاجات توليروجينيك لعلاج الحساسية الفول السوداني. إجمالاً، يتيح التلاعب الحويصلية المسببة للحساسية الخاصة بالتصريف الجزيئات على السطح للاستجابات المناعية المصممة خصيصا، وتغليف جزيئات شبيهة بالمخدرات يمكن إيصال المخدرات إلى الخلية الخاصة بالحساسية.
القيود العامة من هذا الطراز الماوس من حساسية الفول السوداني أن التوعية للفول السوداني مع السمية الكوليرا والتحدي الفول السوداني اللاحقة عن طريق الحقن القائمة ليست تماما ممثل حساسية الفول السوداني في البشر (مثل البشر لديهم ردود الفعل على الابتلاع عن طريق الفم). بيد أن هذا النموذج الحساسية هو المعيار الحالي في الميدان11،،من1821، ويسمح لنا بالتحقيق في الآليات الجزيئية لأمراض الحساسية وتطوير نهج علاجية جديدة. مقارنة بهذه النهج التقليدية، يوفر هذا الطراز نقل التبني المزايا الأساسية الثلاثة. الأول أنه يمكن الذاكرة ب-والخلايا التائية الخاصة بحساسية إلى دراسة أكثر مباشرة. والواقع أن الأدلة الآن بشدة تورط الذاكرة ب-الخلايا كمصدر رئيسي ل الحساسية طويلة الأجل18. وثانيا، لأن نفس العدد من الذاكرة ب-تي-خلايا وهي مزروع في كل الماوس المتلقية، ردود حساسية الحد الأدنى متغير. ثالثا، هذا النموذج يوفر الفرصة لدراسة استجابات حساسية لمسببات الحساسية الفردية، التي مفيدة في سياق اختبار إيمونوثيرابيس الجديدة. أحد التطبيقات مثيرة للاهتمام من هذا الطراز استخدام النهج العام في سياق نموذج أنسنة الماوس، حيث تمت دراسة استجابات حساسية في نماذج المحصنين22. تطبق في سياق نموذج نقل التبني، يمكن أن تكون نموذجا ماوس أنسنة قوية نهج التوسع و في فيفو اختبار لخلايا ب و T من مرضى الحساسية.
جسم المرض المرضية لا تحدث إلا في نماذج حساسية، ولكن أيضا في ب-الخلية بوساطة23من أمراض المناعة الذاتية. نقل أدوبتيفيلي سبلينوسيتيس توعية من الفئران نظراً أوتوانتيجين سيكون في نهاية المطاف أن تكون مفيدة جداً في خفض عدد الحيوانات المستخدمة تقليل عدد الحيوانات تلقي حقنات متعددة من adjuvant وزيادة إمكانية تكرار نتائج من الردود بين أفواج فئران في دلائل متعددة على المرض. سيكون مثال واحد في نموذج تجريبي المناعة الذاتية للوهن العضلي الشديد (إيمج) في الماوس الذي عرضه سلالات (C57BL/6 وسخل وأكر) يتم تحصين عدة مرات مع مستقبلات أستيل (الأمريكية) في adjuvant لتطوير الأجسام المضادة المسببة للمرض. هذه الأجسام المضادة تؤدي في نهاية المطاف إلى immunopathological الميزات الموجودة في البشر مثل التعب/ضعف العضلات، وإيداع المناعية، ومكونات مكملة في الوصلات العصبية العضلية وفي الحالات الشديدة الاعتلال/الوفيات24. في إيمج، يختلف انتشار المرض على نطاق واسع بين 50 – 70%، حيث تستأثر بهذا التغير أفواج الحيوانات الكبيرة هي اللازمة للوصول إلى دلالة إحصائية25،26. وفي نهاية المطاف سيقلل الأسلوب الموصوفة هنا عدد الحيوانات المستخدمة بتقليل التفاوت في الإصابة بالمرض. كما ذكر سابقا، إيمج هو الناجم عن حقن متعددة مع يجيزان + المواد المساعدة (Adjuvant "كاملة فروند" و Adjuvant ناقصة فروند) لاستجابات جسم السيارات الزناد. هذا الأسلوب سيقلل عدد الحيوانات التي تتلقى متعددة يقحم مع adjuvant. وأخيراً، نظراً لطبيعة عمليات التحصين ويعزز متعددة، من الصعب نسبيا لتعريف windows العلاجية المناسبة للعلاجات الوقائية والعلاجية. وسيساعد هذا الأسلوب مزامنة جسم استجابة والمرض المرضية النافذة، يجعله أكثر قابلية للتنبؤ واستنساخه. يمكن تطبيق هذا المنطق نفسه على العديد من نماذج الماوس الأخرى لجسم بوساطة أمراض المناعة الذاتية، مثل التهاب المفاصل الرثياني27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث المنح المقدمة من وزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0302 و W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
