Summary
Beschreven is de voorbereiding van de antigene Liposomale nanodeeltjes en hun gebruik in stimulerende B-cel activatie in vitro en in vivo. Consistente en robuuste antilichaam reacties geleid tot de ontwikkeling van een nieuw model van de pindaallergie. Het protocol voor het genereren van antigene liposomen kan worden uitgebreid tot verschillende antigenen en immunisatie modellen.
Abstract
Antilichaam reacties bieden kritische protectieve immuniteit aan een breed scala aan pathogenen. Er blijft een groot belang bij het genereren van robuuste antilichamen voor vaccinatie evenals begrijpen hoe pathogene antilichaam reacties allergieën en auto-immuunziekte ontwikkelen. Robuuste antigeen-specifieke antilichaam reacties te genereren is niet altijd triviaal. In muismodellen vereist het vaak meerdere rondes van inentingen met adjuvans die tot een grote hoeveelheid variabiliteit in de hoeveelheid opgewekte antilichamen leidt. Een voorbeeld is in muismodellen van pindaallergieën waar meer robuust en reproduceerbare modellen die muis nummers en het gebruik van adjuvante minimaliseren gunstig zou zijn. Hier gepresenteerd is een zeer reproduceerbaar muismodel van pindaallergie anafylaxie. Dit nieuwe model is gebaseerd op twee belangrijke factoren: (1) antigeen-specifieke splenocytes worden adoptively overgebracht van een pinda-gesensibiliseerde muis in een naïef ontvangende muis, normaliseren van het aantal antigeen-specifieke geheugen B - en T-cellen over een groot aantal muizen; en (2) ontvangende muizen zijn vervolgens versterkt met een sterke multivalent immunogeen in de vorm van liposomaal nanodeeltjes worden getoond op het grote pinda allergeen (Ara h 2). Het grote voordeel van dit model is de reproduceerbaarheid, die uiteindelijk het aantal dieren in elke studie verlaagt, terwijl het minimaliseren van het aantal dieren ontvangen meerdere injecties van adjuvans gebruikt. De modulaire vergadering van deze immunogene liposomen biedt relatief facile aanpassingsvermogen aan andere allergische of auto-immune modellen waarbij Pathogeen antilichamen.
Introduction
Voedselallergie is van invloed op 8% van de kinderen in de Verenigde Staten, en in de prevalentie is toegenomen in de afgelopen tien jaar1. Allergie voor pinda is van invloed op 1% van de kinderen en is niet typisch ontgroeid2. Hoewel verschillende veelbelovende klinische proeven zijn aan de gang voor de behandeling van voedselallergie, met inbegrip van mondelinge immunotherapie (OIT), sublinguale immunotherapie (SLIT) en epicutaneous immunotherapie (EPIT), zijn er momenteel geen FDA-goedgekeurde behandelingsstrategieën voor desensibilisatie pinda-allergische personen3,4,5,6,7,8. Allergische personen moeten daarom strikt allergenen Voorkom anafylaxie. Veel vragen blijven met betrekking tot routes van sensibilisatie en onderliggende mechanismen van voedsel allergie ontwikkeling.
Muismodellen zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van de mechanismen van allergie, alsmede het ontwikkelen van nieuwe tolerogenic en desensibilisatie therapieën9,10,11,12. Dit geldt met name omdat het grote pinda allergeen (Ara h 2; Ah2) bij de mens is ook het dominante allergeen in verschillende beschreven muis modellen13,14. Terwijl Muismodellen van de pindaallergie zijn van onschatbare waarde bij het bestuderen van de mechanismen van sensibilisatie en tolerantie, is een nadeel dat ze kunnen variabele worden en het gebruik van hulpstoffen vereisen. Meer potente immunogenen zou één manier om te minimaliseren van de intrinsieke variabiliteit van dergelijke modellen. Omdat B-cellen zijn sterk geactiveerd door multivalent antigenen, zijn antigene liposomen weergeven van het allergeen een goede optie omwille van hun vermogen om potentieel B-cellen activeren door de B-cel receptor (BHG), terwijl ook de eigenschap van efficiënt het compartiment van de T-cel via worden overgenomen door de niet-specifiek antigeen-presentatie priming cellen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor eiwit antigenen aan Liposomale nanodeeltjes met behulp van een strategie voor facile en modulaire conjugating. Met behulp van een surrogaat antigeen, anti-IgM Fab fragment, we laten zien hoe krachtig deze antigene liposomen kunnen in stimulerende B-cel-activatie. Antigene liposomen weergeven Ah2 antigeen werden gebruikt voor het ontwikkelen van een nieuwe muismodel van toegekende gevoeligheid. In dit model worden splenocytes van geverifieerde pinda allergische muizen, met pinda-specifieke geheugen B - en T-cellen, overgebracht naar de naïeve congenisch muizen. Geheugen antilichaam reacties worden veroorzaakt door injectie van liposomen geconjugeerd met Ah2 in de ontvangende muizen, zodat antilichamen tegen Ah2 ertoe worden aangespoord. Gevolgd door slechts één boost met oplosbare Ah2, leiden Ah2-specifieke antilichamen tot een sterke anafylactische reactie wanneer deze muizen zijn vervolgens uitgedaagd met Ah2. Zoals muizen ondergaan de allergische reactie op een zeer uniforme wijze reageren hebt en niet een adjuvans, deze benadering is een wenselijk pindaallergie model en de uitkomsten suggereren dat het nut in andere Muismodellen gedreven door antigenen die gericht wellicht allergenen en eventueel autoantigens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De algemene methode van eiwit koppelen aan lipide en integratie in liposomen is grotendeels gebaseerd op eerdere werk15. Alle dierlijke hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Alle muizen gebruikt in het model van de pindaallergie zijn BALB/cJ vrouwtjes gekocht bij op 3 weken leeftijd. De Universiteit van Alberta dierenverzorgers en gebruiken Comité (ACUC) heeft goedgekeurd experimenten met gebruik van muis milt voor ex vivo analyse van C57Bl/6 muizen van ten minste 6 weken oud.
1. de vervoeging van eiwit-antigeen tot een gepegyleerde lipide
- Voeg 3 g kruislings gekoppelde dextran gel kralen met een fractionering bereik van 1.500 tot 30.000 Dalton (Da) in een maatkolf van 250 mL vacuüm. Voeg 60 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voortdurend roeren met een magnetische roer bar. De erlenmeyer en hechten aan een vacuüm te leiden-vergassing op een bord roer voor een minimum van 1 h.
- Toevoegen in een 1.0 x 30 cm glas chromatografie kolom met de stop van de omzet gesloten, PBS naar de kolom om te wassen. Open de omzet stop en afvoer van de kolom. De gier van de getankte kralen na wassen, toevoegen aan de kolom. Voortdurend toe te voegen de drijfmest totdat de kolom is verpakt op een kraal hoogte van ongeveer 24 cm.
- Zodra de kolom een 'hoofd' van ongeveer 4-5 cm van PBS boven de ingepakte kralen heeft, hebben de volgende stappen klaar.
- Maak een hevel zwaartekracht stroom door het meten van een stukje slang lang genoeg te bereiken een plank 1 – 2 voeten boven de top van de kolom en maak een lus die druppels in de buurt van de onderkant van de kolom en keert terug naar de top van de kolom. Een stopper van de omzet aan één uiteinde van de buis, één kant van de buis open verlaten toevoegen. Plaats het einde open buis in een 500 mL fles van PBS en plaats op de plank boven de kolom.
- Neem het einde met de omzet stop en hechten een 10 mL spuit. Open de omzet stop klep op de regel van de buis en PBS trekken door de buis. Zodra de PBS driekwart van de weg door de buis bereikt heeft, snel de spuit verwijderen en toevoegen van de omzet-stop naar de top van de kolom — vloeistof moet worden uitgevoerd op de kolom.
Nota: Het bedrag van de 'hoofd' van PBS links bovenaan de kolom moet tussen 1 en 3 cm. De minimale hoeveelheid te wassen van de kolom is 3 delen van de kolom.
- Bepaalt de hoeveelheid eiwit (mollen) moet worden gekoppeld aan lipide op basis van het molecuulgewicht (MW).
Opmerking: Het Fab fragment van geit-antimuis IgM (zelf een IgG) wordt gebruikt als een universele surrogaat antigeen voor polyklonale stimulatie van B-cellen. Dienovereenkomstig, de Fab fragment van geit IgG heeft een MW van ongeveer 48 kiloDalton (kDa) en is commercieel beschikbaar in een totale hoeveelheid 1,3 mg. Zo is de hoeveelheid eiwit worden gekoppeld 27.1 µmol. - Bepaal de coëfficiënt van de extinctie van de proteïne van belang. Indien onbekend, meet de absorptie van eiwitten bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer en verdeel de waarde280 A door het aantal mol berekend in stap 1.4.
Opmerking: Het uitsterven co-efficiënt van Fab van geit IgG op 280 nm is 64,600 M-1. - Om ervoor te zorgen dat trace bedragen van amine-bevattende buffer worden verwijderd, het desalt van de proteïne van de kolom die is gemaakt in stappen 1.1-1.3 en het verzamelen van eiwitfracties in 1,5 mL microcentrifuge buizen (~ 500 µL per fractie).
- Sluit de omzet stop klep aangesloten op de top van de kolom en de bovenzijde van de kolom te verwijderen. Zoniet al open, open de omzet stop klep aan de onderkant van de kolom en wachten tot de 'hoofd' van PBS de bovenkant van de kralen raakt.
- Voeg langzaam in de proteïne van belang naar de top van de parels met behulp van een glazen pipet van Pasteur, voorzichtig om te minimaliseren van de verstoring naar de top van de kralen.
- Zodra de 'hoofd' van de eiwit-oplossing de top van de parels bereikt, voeg 1 mL PBS zachtjes via een pipet van Pasteur. Herhaal dit drie keer. PBS voor het maken van een hoofd van 4-5 cm en herhaal stap 1.3 te wassen de kolom toevoegen.
Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen als vaststaat dat er geen amine-bevattende buffer aanwezig is.
- Bepalen van de breuken die eiwitten door het meten van de A280 waarden bevat en bundelen de breuken die ongeveer 90% herstel van het eiwit geven.
Opmerking: Dit meestal verdunt de eiwit 1.5-2-vouw. Bepaal de eiwitconcentratie na pooling. Concentreren het eiwit bij deze stap indien nodig, met behulp van een concentrator centrifugeren. - 2.5 molaire equivalent van de crosslinker van de heterobifunctional aan het eiwit toevoegen.
- Eerst Weeg ongeveer 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionaat (SPDP, MW = 314 g/mol) in een microcentrifuge buis. Om te bepalen het volume te ontbinden van de SPDP, neem de molaire eiwitconcentratie en vermenigvuldig het door 250 x voor het genereren van een 100 x-oplossing die een 2.5 molaire overmaat in de reactie zal geven.
Opmerking: bijvoorbeeld, als de eiwitconcentratie 50 µM is, een oplossing van SPDP bij 12,5 mM nodig. 5 mg SPDP, komt dit overeen met 1,27 milliliters dimethylsulfoxide (DMSO).
- Eerst Weeg ongeveer 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionaat (SPDP, MW = 314 g/mol) in een microcentrifuge buis. Om te bepalen het volume te ontbinden van de SPDP, neem de molaire eiwitconcentratie en vermenigvuldig het door 250 x voor het genereren van een 100 x-oplossing die een 2.5 molaire overmaat in de reactie zal geven.
- SPDP aan de proteïne van belang bij een verdunning 1:100 toevoegen. Plaats de reactie op een oscillerende shaker bij kamertemperatuur (RT) gedurende ongeveer 1 uur.
- Verwijderen van de overtollige SPDP en beschermen van de endogene bisulfide-bond(s), in het eiwit in de verdere verlaging stap, equilibreer en wassen van de kolom die is gemaakt stappen 1.1-1.3 in 100 mM Natriumacetaat (NaOAc) bij pH 5.5 of maakt u een identieke kolom uitsluitend voor gebruik in deze buffer.
- Desalt na een incubatieperiode van 1 h met SPDP, het eiwit op de kolom geëquilibreerd in 100 mM NaOAc. Uitvoeren van deze stap op identieke wijze als stap 1.6 behalve gebruik van 100 mM NaOAc (pH 5.5) als de elutievloeistof. Verzamelen van de breuken, bepalen de A280en bundelen van de bovenste breuken. Was de kolom in PBS.
- Bereiden van een oplossing van 2.5 M van DTT (MW = 154 g/mol) in dubbel gedestilleerd water (ddH2van O). 25 mM DTT toevoegen aan de gepoolde fracties van eiwitten voor 5-10 min.
- Meten van de A-280 van het eiwit en verdeel dit door het uitsterven coëfficiënt. Ook bepalen de A343. Bereken de koppeling verhouding op basis van de molarity van eiwitten (een280) en linker (een343).
Opmerking: De A340 auto-kalibratie indien uitschakelen met behulp van een spectrofotometer nanodrop. De meting van de343 A vertegenwoordigt de extinctie van de pyridine-2-thion groep (uitsterven coëfficiënt = 7550 M-1) dat is verwijderd uit de cross-linker van de SPDP door de DTT. Een molaire verhouding voor linker: eiwitverhouding van 1,2 – 1,5 wordt over het algemeen bereikt bij het uitvoeren van de reactie met een 2.5 molaire overmaat van SDPD over een breed scala van eiwitten. - De gepoolde fracties overreden door de kolom gewassen in PBS zoals hierboven beschreven. Verzamelen van de fracties, bepalen van de A-280en zwembad top breuken. Bepaal de concentratie van proteïne door A280 na bundeling van de fracties.
- DSPE-PEG bereiden (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Dit zal worden toegevoegd aan het eiwit op een molaire 10:1-verhouding. Bereiden een 100 x voorraad van DSPE-PEG (2000)-Maleimide tot de gewenste concentratie.
- Bijvoorbeeld, als de eiwitconcentratie 10 µM na stap 1.14 is, bereiden een voorraad van DSPE-PEG (2000)-Maleimide op 10 mM. Weeg zorgvuldig DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) en voeg de juiste hoeveelheid DMSO. Meerdere rondes van zachte vortexing en sonicating kunnen het volledig opgelost krijgen.
- Bepalen van het totale volume van de breuken uit stap 1.14 en breng de oplossing kwantitatief zorgvuldig in een klein (10-25 mL) ronde onderkant kolf (RBF). Voeg de juiste hoeveelheid 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide op de proteïne te bereiken een 1 x, 10-fold molaire overtollige, definitieve concentratie. Zachtjes swirl de oplossing om ervoor te zorgen dat de DMSO volledig is verspreid.
- Reactie 's nachts onder stikstof worden uitgevoerd in een verzegelde RBF. Gebruik een rubber tussenschot en plaats in een zuurkast.
- Verwijder de sfeer door het septum prikken met een naald van 20 G gekoppeld aan een spuit met 3 mL aan het eind van de slang gekoppeld aan een vacuüm, en vacuüm voor 3 – 5 s inschakelen.
- De sfeer wordt vervangen door stikstof. Vul een ballon gekoppeld aan een 3 mL spuit snij doormidden met stikstof en hechten een naald van 20 G. Aanprikken van het septum te vullen de sfeer binnen de kolf met ronde bodem met stikstof. De verwijdering van de sfeer en de vervanging met stikstof nogmaals herhalen en laat de ballon van de stikstof die 's nachts aangesloten.
- Een aparte kruislings gekoppelde dextran gel kraal kolom met fractionering allerlei 4.000 – 150.000 Da in een 1.0 x 50 cm glas chromatografie kolom (volgens stappen 1.1-1.3) voor te bereiden.
- De volgende dag, verwijder het eiwit uit de ronde onderkant kolf bereid in stap 1.17 en run (volg de methode die wordt gebruikt in stap 1.6) over de kruiselings gekoppelde dextran gel kraal kolom (uit stap 1.18).
Opmerking: Het totale bedrag te laden op de kolom dient niet meer dan 2 mL. Als een grotere reactie werd gebruikt, in tweeën splitsen en uitvoeren op afzonderlijke kolommen of op een grotere diameter kolom uitgevoerd.- Verzamelen van de fracties en bepalen de A280, zwembad top breuken, bepaal de concentratie van eiwitten. De aanwezigheid van het lipide zal niet van invloed op de metingen.
- Bewaren de definitieve gepoolde fracties van lipide-linked eiwit bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
2. liposoom voorbereiding
- Weeg de lipiden: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Cholesterol (3b-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; en DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. maken een 5 mg/mL oplossing van 2 mg/mL oplossing van DSPE-PEG(2000) in chloroform, 4 mg/mL oplossing van Cholesterol en DSPC.
- Zorg ervoor dat de molaire verhouding van lipiden in de liposomen: 57% DSPC, 38% Cholesterol, en 5% DSPE-PEG(2000), zoals wordt weergegeven in tabel 1.
Opmerking: Het is belangrijk om te controleren van de hoeveelheid antigeen op de liposomen, die in het algemeen van 0.01-0,1 varieert %. In tabel 1, wordt 0.1% van geit-antimuis IgM Fab fragment gekoppeld aan gepegyleerde lipide gebruikt. Het is van cruciaal belang rekening te houden voor de 10-fold Kies overtollige van DSPE-PEG (2000)-Maleimide die is toegevoegd aan het eiwit in stap 1.15, om ervoor te zorgen dat de totale hoeveelheid gepegyleerde lipide 5% niet overschrijdt. - Overwegen de definitieve lipide bedragen (µmol) bij het maken van lipiden voor extrusie. Zie tabel 1 voor een voorbeeld van de berekening van de molaire lipide concentraties voor de oprichting van liposomen op een 1,25 µM totale vetgehalte.
- Zodra het juiste bedrag van elke lipide te worden bij elkaar opgeteld is berekend, combineren in een reageerbuis van 12 mL borosilicaat glas.
-
Afblazen zorgvuldig de chloroform.
- Gebruik de slang en een 3 mL-spuit met naald, in stap 1.17.1, willen zorgvuldig afblazen chloroform in de buis met stikstof. Zachtjes blazen een stroom van stikstof over de oplossing terwijl het draaien van de buis met de andere hand. Wees voorzichtig tot een minimum beperken spatten of het veroorzaken van de vloeistof manier moet worden uitgevoerd op de kant van de buis als het kan moeilijker om dit in de oplossing in de volgende stap.
- Voeg 100 µL van DMSO aan elke buis en 's nachts lyophilize van deze oplossing. Betrekking hebben op de top van de buis met een niet-statische laboratorium doekje, veilig met een rubberen band, en bevriezen van-80 ° C.
3. liposoom extrusie
- Voeg 1 mL PBS die eiwit lipide-gekoppeld aan de 12 mL-buis met de lipiden bevatten. Bewerk de oplossing voor ongeveer 30 ultrasone trillingen ten s tot 1 min in een waterbad ultrasoonapparaat. Voor 5 min of meer rust tussen elke ronde en 3-4 keer herhaalt.
-
Een extruder bereiden volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
- Het filter ondersteunt toevoegen aan de interne membraan steun, plaats een paar druppels (elke 10 µL) van PBS op paraffine film. Met pincet, pak een rand van de filterondersteuning en dompel het in het drop-10 µL.
- Plaats de filter binnen de O-ring. Doe dit voor beide zijden. Met pincet, pak een 0.8 µm filter op de rand en duik in het drop-10 µL en jas van de buitenkant van de O-ring met PBS. Plaats de 0.8 µm filter zachtjes op de O-ring zodat het filter niet over hang de interne membraan ondersteunt.
- Plaats de extruder verwarming blok op een warm bord om te Verwarm de extruder. Overschakelen van de verwarmingsplaat op laag en laat de extruder verwarmen blok te bereiken van de gewenste temperatuur. Om te voorkomen dat potentiële problemen met eiwit aggregatie, niet verwarmen het blok afgelopen 37 ° C.
- Laad het sonicated monster in een van de extruding spuiten in de extruder geplaatst. Plaats de extruder spuit in het andere einde van de extruder. Zorg ervoor dat de lege spuit zuiger is ingesteld op nul. De lege spuit zal vullen zoals de lipide is geëxtrudeerd via het polycarbonaat 0.8 µm membraan. Probeer te vermijden bubbels heen en weer door het membraan passeren.
- Plaats de volledig geassembleerd extruder in het blok van de verwarming. Duw de plunjer van de gevulde spuit met lipiden voorzichtig de lege spuit. Afhankelijk van het vetgehalte, zal dit moeilijk om erdoor te worden. Herhaal 20 x.
- De volledig geassembleerd extruder van de verwarming-blok verwijderen. Langzaam de gevulde spuit uit de extruder verwijderen, moet u voor het verzamelen van alle lipiden die lekken kunnen uit bij het verwijderen. Plaats liposomen in een schoon flesje. Herhaal de stappen met behulp van 3.4 – 3.6 polycarbonaat 0,2 µm en 0.1 µm membranen.
- Maak een 0.7 x 50 cm2 kruislings gekoppelde agarose kraal kolom met scheiding 0,7-10 aantal Mega Dalton (MDa) geëquilibreerd in PBS. De liposomen toevoegen en uitvoeren zoals in stap 1.6. Breuken met liposomen zal zijn gedaald transmissie van licht in de 250-400 nm-bereik.
- Sla de liposomen bij 4 ° C en niet invriezen.
4. calcium Flux om te controleren van de B-cel activatie door antigene liposomen
- Euthanaseren muizen door kooldioxide (CO2) of Isofluraan overdosis, volgens institutionele operationele standaardprocedures. Bevestig euthanasie van muizen door cervicale dislocatie.
- Het steriliseren van chirurgische instrumenten en muizen karkas met 70% ethanol. Gebruik 10 cm lang, 0.8 mm tip, gebogen iris pincet om te scheiden van de huid die betrekking hebben op de borstholte van de ribbenkast. Gebruik 10 cm lange, rechte ontrafeling schaar om een distale incisie met een bilaterale incisie.
- Gebogen iris pincet en ontleden schaar gebruiken om de milt uittreksel uit de buikholte. Vetweefsel rond de milt te verwijderen en vervolgens plaatst u deze in een 15 mL polystyreen conische buis gevuld met RPMI1640 gemiddeld met 1% foetaal kalfsserum (FCS), en penicilline-streptomycine.
- Overdracht milt en media over een 40 µm cel zeef gemonteerd op een kegelvormig tube van 50 mL. Met behulp van het einde van de rubber van een zuiger van de spuit 3 mL, zachtjes verpletteren de milt. Wassen van de 40 µm cel zeef met de media. Herhaal dit proces totdat alleen vetweefsel wordt overgelaten in de 40 µm cel zeef. Spoel de zeef met 3-5 mL van de media te verhogen van herstel van de cel.
- Centrifugeer cel homogenaat bij 300 x g gedurende 5 min op RT. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en voeg 10 mL 1 x RBC lysis-buffermengsel tot de pellet. Pipetteer omhoog en omlaag, laat gedurende 2-3 minuten bij RT en dan Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de rode bloedcel verarmd splenocytes in 10 mL van de media. Cel totaal getallen met behulp van een hemocytometer of andere cel tellen apparaat bepalen. Pellet de cellen door middel van centrifugeren, zoals hierboven beschreven.
Opmerking: De ideale eindconcentratie nodig voor het laden van de Indo-1 van splenocytes is 10-20 x 106 cellen/mL, maar een lagere concentratie van cellen kan worden gebruikt. - Splenocytes bij 15 x 106 cellen/mL in calcium flux laden van de buffer (RPMI1640 medium dat 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 1 mM magnesiumchloride (MgCl2), 1 mM ethyleenglycol-bis (resuspendeer Β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (EGTA), en 5% penicilline-streptomycine). Toevoegen in 1,5 µM Indo-1 uit een DMSO stamoplossing van 1 mM, omkeren de buis meerdere malen te mengen. Beschermen tegen licht en Incubeer de cellen op het waterbad 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Na de 30 min incubatie, toevoegen in 5 x de hoeveelheid calcium flux laden van de buffer. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 min op RT.
- Vlek voor het gating op B cellen, cellen met 1:200-antimuis CD5-PE en anti-muis 1:200 B220-PE/Cy7 in 0,5 mL van het laden van de buffer bij 4 ° C gedurende 20 min, beschermd tegen licht.
- Splenocytes wassen in calcium flux laden buffer en centrifuge op 300 x g gedurende 7 minuten op RT. resuspendeer cellen bij 10-20 x 106 cellen/mL in calcium flux met buffer (Henks uitgebalanceerd zoutoplossing (HBSS) met 1% FCS, 1 mM MgCl2 en 1 mM calciumchloride (CaCl2)). Opslaan op het ijs, beschermd tegen licht tot klaar om te draaien op stroom cytometer.
-
Setup stroom cytometry met onbevlekt en één vlek controles voor compensatie.
- Voer de gekleurde cellen de poorten op de juiste manier inrichten (Zie figuur 2A). Setup van Indo-1 (violet) versus de plot van de Indo-1 (blauw), aanpassen van de spanningen in de kanalen van de Indo-1 om de cellen kleuring aan een helling van 45 – 60 ° te maximaliseren van het signaal: ruisverhouding van de Indo-1 violet: blauwe verandering in verhouding na stimulatie van de B-cel.
Opmerking: Zorg ervoor dat de spanningen niet te hoog is zijn, zodanig dat een aanzienlijk percentage van de cellen (> 5%) zijn tegen de bovenkant van de plot. - Maken van een diagonale poort die het bovenste linker gedeelte (Violet+blauw-) van het perceel kapselt, zodanig zijn dat zonder stimulatie < 10% van de cellen zijn in de poort, die idealiter tot stijgen moet > 75% na stimulatie.
- Voer de gekleurde cellen de poorten op de juiste manier inrichten (Zie figuur 2A). Setup van Indo-1 (violet) versus de plot van de Indo-1 (blauw), aanpassen van de spanningen in de kanalen van de Indo-1 om de cellen kleuring aan een helling van 45 – 60 ° te maximaliseren van het signaal: ruisverhouding van de Indo-1 violet: blauwe verandering in verhouding na stimulatie van de B-cel.
-
Voeg 0,5 mL van cellen een afgetopte 5 ml ronde onderkant polystyreen buis (fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buis) en warm de cellen tot 37 ° C gedurende 3-5 minuten in een waterbad. Plaats de buis FACS in de 37 ° C water-jacketed kamer die is aangesloten op een opnieuw circulerende waterbad.
- Uitvoeren van de buis de water-jacket op de cytometer van de stroom en acquisitie, starten zonder het opslaan van de gegevens, op ongeveer 5.000-10.000 evenementen/s. Zodra de cellen hebben gestabiliseerd (15-30-s), initiëren data acquisitie en verzamelen gegevens voor ten minste 10 s om de achtergrond.
- Op de 10 s merk, snel verwijderen van de buis van de stroom cytometer, voeg de stimulatie (5-50 mM antigene liposomen in 2 tot 20 mL), pulse vortex en FACS buis op het stroom cytometer terug. Handhaven data-acquisitie en opslag door middel van deze tijd en verzamelen van gegevens voor 3-5 min.
- Gegevens analyseren in passende analysesoftware onder de kinetiek functies.
5. bereiding van pinda Extract
- Uittreksel pindaproteïnen door het mengen van pinda meel in een verhouding van 1:5 (wt:vol) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 M natriumchloride (NaCl). Meng de oplossing op magnetische roer plaat voor 2 h op RT behoud bij pH 8,5.
- Centrifuge oplossing bij 3000 x g gedurende 45 min bij 4 ° C. Decanteren en filter-steriliseren supernatant opeenvolgend door een 0.4 µm filter gevolgd door een 0,2 µm filter. Bepaal eiwitconcentratie bicinchoninic zuur (BCA) assay gebruikend bovien serumalbumine (BSA) als norm.
- Verminderen en denatureren van een steekproef van pindaproteïnen met 50 mM dithiothreitol (DTT) in een buffer met lithium dodecyl sulfaat bij een pH van 8.4, waarmee een maximale activiteit van de reductor en warmte bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- 10 µg gedenatureerde pinda eiwit op een Bis-Tris 4-12% precasted polyacrylamidegel ontworpen om optimale scheiding kleurovergang gel met molecuulgewicht vooraf gekleurd standaard uitgevoerd.
- Vlekken van de gel met disulfonated triphenylmethane en destain met ddH2O. Identify bekend grote pinda-allergenen Ara h 1, 2 en 3 in uittreksel preparaten. Ara h 1 verschijnt op 63 kDa, Ara h 2 moet worden weergegeven als twee isoforms op 17 en 19 kDa en Ara h 3 verschijnt op 37 kDa (zure subeenheid).
6. overgevoeligheid voor muizen aan pinda
- Resuspendeer 1 mg Cholera-toxine in 1 mL ultrazuiver water. 200 µL verdund pinda extract bevat 2 mg pinda eiwit en 10 µg cholera-toxine in PBS voorbereiden.
- 200 µL van de pinda extract met Cholera-toxine (2 mg pinda eiwit en 10 µg Cholera-toxine) via mondelinge maagsonde aan elke 4 – 5 week oud BalB/cJ vrouwelijke muis beheren. Herhaal keer per week gedurende drie weken (d.w.z., dag 0, 7, en 14).
- Toedienen van 300 µL verdund pinda extract (bevat pinda eiwit 5 mg en 10 µg Cholera-toxine) via mondelinge maagsonde aan elke muis in de vierde week (dat wil zeggen, dag 21).
7. uitdaging muizen met pinda Extract
- Bereid pinda extract tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL in PBS op dag 28. Maatregel basislijn lichaam temperaturen met behulp van een rectale thermometer (ongeveer 37,5-38.5 ° C). 200 µL (200 µg) beheren van pinda uittreksel via intraperitoneaal (i.p.) injectie.
- Lichaamstemperatuur meten met rectale thermometer, wordt elke 15 min voor 1 h na de injectie. Een duik in de lichaamstemperatuur geeft aan allergie voor pinda.
Opmerking: Hypothermie is een kenmerk van anafylaxie in muizen. Deze uitdaging zal aantonen dat muizen allergisch voor pinda zijn. 90% van de Balb/cJ muizen die ondergaan van het protocol van overgevoeligheid ontwikkelen meestal allergische reacties tijdens uitdaging gekenmerkt door ten minste een daling van de temperatuur 2 – 3 ° C.
8. isolatie van Splenocytes van allergische muizen en adoptief overdracht
-
Isoleren van de splenocytes van naïef en pinda allergische muizen.
- Op dag 30, euthanaseren zowel naïef en bevestigde pinda allergische muizen door het toedienen van 3 L/min voor CO2 in een gaskamer. Bevestig euthanasie van muizen door bilaterale Thoracotomie. Het steriliseren van chirurgische instrumenten en muis karkas met 70% ethanol. Gebruik pincet te scheiden van de huid die betrekking hebben op de borstholte van de ribbenkast. Gebruik rechte ontleden schaar om een bilaterale incisie de linker en rechter ribben breken.
- Pincet en ontleden schaar gebruiken om de milt uittreksel uit de buikholte. Verwijderen vetweefsel rond milt alvorens in polystyreen 15 mL conische buis, gevuld met 10 mL RPMI 1640 medium te plaatsen.
- Giet in een steriele laminaire flow kap, milt en media in een 35 mm polystyreen petrischaal. Naïef en allergische splenocytes houden in aparte petrischalen en media tijdens cel isolatie. Gebruik gesteriliseerde pincet en ontleden schaar milt in drieën gesneden en terugkeren naar de petrischaal.
- Met behulp van de ruwe, matte rand van twee glazen Microscoop dia's, zachtjes Meng (in RPMI) de milt stukken tot Wit weefsel tussen dia's blijft. Dia's tussen groepen wijzigen.
- Cel homogenaat van petrischaal overbrengen door een 70 µm cel zeef gemonteerd op een kegelvormig tube van 50 mL. De overgebleven fragmenten van de milt passeren door de zeef met een zuiger van een injectiespuit 1 mL. Spoel de zeef met 5 mL van de RPMI te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Filtraat overbrengen in een polystyreen 15 mL conische buis en centrifuge (450 x g, 10 min, RT).
- Gecombineerd supernatant en resuspendeer cel pellet in 2 mL rode bloedcellen lysis-buffermengsel (0,83% ammoniumchloride in 10 mM Tris buffer, pH 7,2) toe te voegen. Meng en Incubeer bij RT gedurende 2 – 3 min. Voeg toe 10 mL PBS - 2% FBS en centrifuge op 300 x g gedurende 7 minuten op RT.
- Wassen van de cellen opnieuw met 12 mL PBS - 2% FBS volledig verwijderen van alle resterende ammoniumchloride, en centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 minuten bij RT. resuspendeer cel pellet in 2 mL zuiver RPMI 1640 medium. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer of een automatische hematologie analyzer.
- Gebruik een 27 G, 5/8-inch naald op een insuline spuit van 1 mL, intraveneus injecteren 15 x 106 allergische of naïeve splenocytes geëxtraheerd zoals hierboven beschreven (in 200 µL) via de staart vein in muizen naïef (unsensitized).
9. injectie van muizen met Ara h 2 antigene liposomen
- Bereiden Ah2 liposomen met 0,1% Ah2 op 2.5 mM lipide. Voor de berekening van eiwitconcentratie, is de coëfficiënt uitsterven van Ah2 15.000 M-1. Verdunde liposomen tot 300 µM in steriele PBS.
- Een dag na adoptie overdracht (dag 31) van allergische of naïeve splenocytes, intraveneus injecteren 200 µL van PBS of de Ah2 antigene liposomen (300 µM) bevatten een totaal van 1.38 Ah2 via de ader van de staart van de BALB/cJ muizen die de splenocytes in stap hebt ontvangen µg 8.2.
10. boost en uitdaging van muizen met Ara h 2
- Twee weken na de injectie met Ah2 liposomen, op dag 45, gebruiken een 4 mm dierlijke lancet te verzamelen van 50-200 µL bloed vanaf de submandibulaire samenvloeiing van de muis. Verzamelen van bloed in een serum scheidingsteken buis zonder heparine; aparte het serum door centrifugatie bij 6.000 x g gedurende 15 min. gebruiken de verzamelde serum later naar maatregel antigeen-specifieke antilichamen.
- Op dag 46, twee weken na het injecteren van muizen met liposomen (stap 9.2), stimuleren van muizen door een i.p. injectie van 200 µL van PBS of 200 µg oplosbare Ah2 (gezuiverd zoals eerder beschreven16).
- Op dag 60, 50-200 µL bloed vanaf de submandibulaire samenvloeiing van de muis verzamelen en verwerken van bloed, zoals eerder is beschreven.
- Op dag 61, uitdaging elke groep van muizen met een injectie i.p. 200 µL van 300 µg oplosbare Ah2. Lichaam temperaturen meten met rectaal sonde elke 15 min zoals in afdeling 7.
11. kwantificering van Ara h 2-specifieke IgE en IgG1 door ELISA
- Een 96-Wells enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) jas-compatibel plaat met 100 µL HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapten geconjugeerd aan menselijk serumalbumine, 20 µg/mL) voor standaard curve of Ah2 (5 µg/mL) serummonsters verzameld in stappen 10.1 en 10.3, verdund coating buffer (50 mM carbonaat-bicarbonaat buffer, pH 9,6) bij 4 ° C's nachts of 37 ° C gedurende > 1 h.
- Wassen drie keer met 200 µL PBS-T (PBS met 0,05% Tween-20) en blokkeren van putjes met 200 µL PBS-T bevattende 2% BSA bij 37 ° C gedurende > 2 h.
- Toevoegen voor Ah2-specifieke IgE ELISA, 50 µL IgE-anti-DNP normen (2 – 0.002 µg/mL, bereid met seriële verdunningen 1:2) of muis serummonsters (1:20 verdunning) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, voeg 100 µL gezuiverd IgG1-anti-DNP-normen (2 – 0.002 µg/mL, bereid met seriële verdunningen 1:2) of muis serummonsters (1:500 verdunning) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C of 1 uur bij 37 ° C.
- Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Voor Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL schapen anti-muis IgE (0,5 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 100 µL voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, HRP geit anti-muis IgG1 (verdund 1:40,000 in PBS-T - 2% BSA). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL biotinyleerd-Donkey anti-schapen IgG (0,5 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, wip voor trede 11,7.
- Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Voor Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL betalen neutraal avidin-mierikswortelperoxidase (bijvoorbeeldNeutrAvidin-HRP, 0,3 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 100 µL 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substraat, incubeer 10-15 minuten of totdat monsters donkerblauw, voegt u 100 µL TMB eindeoplossing. Lees de plaat bij 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vervoeging van de proteïne van belang met DSPE-PEG(2000) kan worden aangetoond door het uitvoeren van een vermindering een toename in tonen moleculair gewicht in vergelijking met de unconjugated proteïne. Figuur 1A toont een representatieve gel van anti-muis IgM F(ab) fragment geconjugeerde PEG-DSPE, waarin een bandshift kDa 2-3 voor de gedenatureerde proteïne. Merk op dat ongeveer 50% van het eiwit lijkt te worden gewijzigd, die verwachting gezien het feit dat 1:1 stoichiometrie werd bereikt op de Fab fragment dat is een heterodimer van de zware en lichte keten. Figuur 1B toont een representatieve gel van Ah2 geconjugeerde PEG-DSPE. Om te beoordelen van calcium flux van B-cellen gestimuleerd door antigene liposomen, twee dingen zijn van cruciaal belang: (1) de instrumentele instellingen zijn afgestemd om te zien een verschil in de verhouding van de Indo-1 fluorescentie in de Ca2 + (violet) gebonden en ongebonden (blauw) formulieren en (2) de juiste gating strategie wordt gebruikt ter beoordeling van de B-cel activatie. Figuur 2A toont de gating regeling voor de stroom cytometry gebaseerde calcium flux assay. Live lymfocyten zijn gated in een SSC-A versus FSC-A (linkerdeelvenster), paren zijn die in een FSC-W versus SSC-W perceel (middelste deelvenster) en B200 omheinde+CD5- B-cellen worden geselecteerd uit een CD5-PE vs B220-PE/Cy7 plot (rechtervenster). Figuur 2B toont de verhouding van de Indo-1 (Violette) vs Indo-1 (blauw) fluorescentie na verloop van tijd als geanalyseerd. Opmerking dat de eiwitconcentratie totaal voor F(ab) en F(ab')2 in deze testen dezelfde waren, aan te tonen het superieure vermogen van antigene liposomen in stimulerende B-cel-activatie. Na de voorbereiding van de pinda extract, een aliquoot gedeelte op gel in werking een SDS-pagina om te bepalen van de relatieve hoeveelheden van Ara h 1, 2 en 3 in het extract. Figuur 3 toont een representatieve gel van een pinda extractie dat naast gezuiverde Ah2 werd uitgevoerd. Figuur 4 ziet u een schematische voorstelling van de algehele adoptief pindaallergie muismodel, inclusief eerste sensibilisatie voor pinda, uitdaging voor pinda, splenocyte isolatie en adoptief overdracht, liposomen injecties, bloed trekken gevolgd door Ah2 boost, en daag tot Ah2. Ah2-specifieke IgE en IgG1 ELISAs zijn uitgevoerd te kwantificeren van immunoglobulinen in serum, zoals weergegeven in figuur 5A en B. Muizen met toegekende gevoeligheid die een impuls heeft gegeven met Ah2 krijgen Ah2-specifieke IgE en IgG1 in hun serum. Lichaam temperaturen opgenomen tijdens de Ah2 uitdaging worden weergegeven in figuur 5C; allergische muizen gedaald lichaam temperaturen na de uitdaging, terwijl het lichaam temperaturen in naïef muizen bleef consistent. Foto's tonen naïef muizen vergeleken met pinda-allergische muizen gedurende de uitdaging staan in Figuur 6.
Figuur 1: vertegenwoordiger gel van anti-muis IgM F(ab) en Ah2 geconjugeerde aan PEG-DSPE. (A, B) SDS-pagina analyse van (A) geit anti-muis IgM F(ab) fragment en (B) Ah2 vóór en na conjugatie aan PEG-DSPE. Geit anti-muis IgM en Ah2 hebben molecuulgewicht van ongeveer 48 en 18 kDa, respectievelijk. Na de wijziging, wordt een iets grotere molecuulgewicht (~2.5 kDa) duidelijk waargenomen voor beide eiwitten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger gating strategie, calcium flux resultaten en analyse. (A) cellen werden geanalyseerd door middel van de volgende gating strategie: live lymfocyten (FSC-A vs. SSC-A), afzonderlijke cellen (FSC-W vs. SSC-W) en B-cellen (B220+CD5-). (B) het Indo-1/Ca2 + flux reactie (violet vs. blauw) van de B-cellen. Weergegeven is het calcium-flux voor anti-IgM Fab fragment liposomen en anti-IgM F(ab')2 op dezelfde eiwitconcentratie (2,5 µg/mL) alsmede buffer-gestimuleerd cellen als een besturingselement. Merk op dat tussen 10-22 s als de stimulatie wordt toegevoegd, dus geen gegevens gedurende deze tijd wordt verworven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger gel met pinda extract en Ah2. Pinda extract bevat verschillende eiwitten, met inbegrip van allergenen Ara h 1, 2, 3 en 6, in vergelijking met de twee isoforms die worden weergegeven voor Ah2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: schematische van adoptief-overdrachtsprotocol. Naïef BALB/cJ muizen waren gesensibiliseerde personen met pinda uittreksel (PN) en cholera-toxine (CT), en vervolgens uitgedaagd om PN. Splenocytes van bevestigde allergische muizen werden geïsoleerd en overgebracht naar naïef muizen. Muizen werden later gevuld met immunogene Ara h 2 liposomen of PBS, vervolgens versterkt met oplosbare Ah2. Ten slotte waren muizen met Ah2 uitgedaagd om te controleren van anafylaxie. Bloed verzameld op dag 45 en 60 gewend waren Ah2-specifieke immunoglobulinen kwantificeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: immunogene Ara h 2 liposoom verhoogt verleende-geheugen allergische reacties. Serum was geïsoleerd (dag 45) pre-en post (dag 60) impuls met PBS of 200 µL van 300 µM immunogene Ah2 liposoom te meten Ah2-sepcific IgE (A) en IgG1 (B). Individuele muizen zijn vertegenwoordigd met lijnen die medianen aangeeft. Muizen die allergische splenocytes ontvangen en waren toegediend Ah2 liposomen op dag 32 aanzienlijk hogere niveaus van Ah2-specifieke IgE en IgG1 hadden. Anafylaxie werd gemeten in de verschillende behandeling in groepen door het opnemen van lichaam temperaturen na Ah2challenge (C). Bedoel lichaam temperaturen afgebeeld met SEM. naïef: PBS (naïeve splenocytes en PBS prime), Allergic: PBS (bevestigde allergische splenocytes en PBS prime), Allergic: Ah2 (bevestigd allergische splenocytes en Ah2immunogenic liposoom prime). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.001, *** P < 0,0001 bepaald door ongepaarde 2-tailed Student t-test. Merk op dat deze resultaten vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: anafylactische symptomen waargenomen tijdens Ah2 uitdaging. Naïef muizen actief blijven en roze teint hebben op hun voeten (A, C). Allergische muizen activiteit is afgenomen, zijn vaak gebogen omhoog, hebben gearbeid ademhaling en ervaar cyanose, aangegeven door donkerder roze teint op hun voeten (B, D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Cholesterol | PEG-DSPE | overtollige PEG-DSPE | een IgM-PEG-DSPE | TOTAAL | |
| Molaire verhouding | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100,00 |
| massa (mg) | 0,56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0,06 | 0.98 |
| m mol | 0.71 | 0.47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1,25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0,00 | 525.97 | 755.03 |
| Conc. (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Cholesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| een IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
Tabel 1: berekeningen voor het maken van een 1,25 µM totale lipide concentratie liposoom. Voorbeeld van berekening tabel voor geit anti-muis IgM F(ab) fragment liposomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier geschetste methoden zijn een algemeen protocol voor de vervoeging van een proteïne aan een lipide waarmee de weergave van het eiwit op Liposomale nanodeeltjes. Voor zeer grote multi subeenheid eiwitten, dit protocol mogelijk beperkte nut. De ideale methode zou zijn de invoering van een specifieke code waarmee een biorthogonal chemische koppelen strategie om te worden gebruikt. Als uiting van het eiwit recombinantly, kan dit met behulp van beschikbare site-specifieke strategieën17, en een breed scala van functionele groepen aan het einde van de gepegyleerde lipide die commercieel beschikbaar zijn. Dienovereenkomstig, dit protocol is gericht op het verbinden van eiwit geïsoleerd uit natuurlijke bronnen en is toegankelijk voor een breed scala van wetenschappers die niet noodzakelijkerwijs vertrouwd zijn met chemische en biochemische transformaties.
Een belangrijk aspect van het runnen van een calcium flux experiment dat moet worden benadrukt is dat de cellen niet moeten worden geactiveerd voordat u ze op de stroom cytometry. Als steriele techniek niet strikt gebruikt is, zal dit goed voor een hoge achtergrond signaal van geactiveerde cellen (Indo-1 fluorescentie scheef richting van de emissie in het violet kanaal). Ook moeten de cellen op ijs voordat u de test om te voorkomen dat abnormale niveaus van achtergrond signaal in de kanalen van de Indo-1 worden gehouden. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen worden opgewarmd voor 2 – 3 min. alvorens aanschaffen door stroom cytometry en hele stimulatie tijdens data-acquisitie. Als de cellen blijven niet bij 37 ° C gedurende data-acquisitie behouden, kan worden verwacht dat cellen niet maximaal zullen reageren. Aangezien het antigeen-specifieke B-cellen in muizen in zeer kleine aantallen aanwezig zijn, is het ideaal om met behulp van een surrogaat-antigeen ter stimulering van alle B-cellen van muizen. Hoewel talrijke transgene muis stammen zijn beschikbaar die express antigeen-specifieke B-cellen, het doel van deze techniek is dat de gemiddelde gebruiker kan zitten kundig voor valideren van hun vermogen om antigene liposomen met wild-type muizen. Om deze doelstelling te bereiken, werden Fab fragmenten van IgM anti-muis gekoppeld aan lipiden en geformuleerd in antigene liposomen die cross-link van de B-cel receptor (BHG) in een polyclonal mode. Het is opmerkelijk dat het eerder werd aangetoond dat deze methode kan worden gebruikt om menselijke B-cellen10 met behulp van de juiste anti-menselijke IgM Fab fragment, die belangrijk, is omdat het is niet mogelijk om grote aantallen toegang te stimuleren antigeen-specifieke menselijke B-cellen. In deze studies, werd de potentie van antigene liposomen ter stimulering van de B-cel activatie geïllustreerd door hun verbeterde mogelijkheden voor het opwekken van calcium flux in vergelijking met gelijke hoeveelheden van anti-muis IgM F(ab') 2 fragmenten.
Het gebruik van antigene liposomen heeft de ontwikkeling van een methode voor sensibiliserend BALB/cJ muizen aan pinda, splenocytes overbrengen van allergische muizen in naïef muizen, injecteren van de host-muizen met Ah2 liposomen en uitdagend hen met Ah2 ingeschakeld. Antilichaam niveaus en anafylactische reacties binnen groepen van muizen worden in dit model worden gereproduceerd. Het is reeds lang gevestigde dat geheugen B - en T-cel reacties zijn van cruciaal belang in de ontwikkeling van pinda-specifieke antilichamen in muizen. Bovendien, een recente studie heeft aangetoond dat geheugen B-cellen repopulate plasmacellen in muizen, die verhoogde niveaus van antigeen-specifieke IgE onderhouden; Allergeen-specifieke geheugen B-cellen zijn dus een aantrekkelijk doelwit voor therapeutische interventie18. Het model nu hier beschreven staat een kans rechtstreeks richten Ah2-specifieke B geheugencellen, in tegenstelling tot een immunosuppressieve aanpak bortezomib met afbreken van de gehele plasma cel repertoire19. Een andere aanpak ter bestrijding van allergieën is voor het opwekken van tolerantie in de T-cel-compartiment. Een mogelijke strategie is om in te kapselen tolerantie-inducerende hulpstoffen binnen de liposomen. Eerder, nanodeeltjes encapsulating rapamycin werden gebruikt om de Tregs veroorzaken en auto-immune ziekte20te verminderen. Dit soort benadering kan worden aangewend om te ontwikkelen tolerogenic therapieën voor de behandeling van de pindaallergie. Globaal, manipulatie van het allergeen-specifieke liposoom door conjugating moleculen aan het oppervlak zorgt voor op maat gemaakte immuunresponsen, en drug-achtige moleculen encapsulating zorgt voor uitwisseling van drugs naar de allergeen-specifieke cel.
Algemene beperkingen van deze muismodel van pindaallergie zijn die overgevoeligheid aan pinda met Cholera-toxine en latere pinda uitdaging via i.p. injectie is niet volledig vertegenwoordiger van pinda allergie bij de mens (bijvoorbeeld mensen hebben Reacties op orale inname). Echter dit anti-model is de huidige standaard in het veld11,18,21, en laat ons toe om moleculaire mechanismen van de allergische ziekte onderzoeken en ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Vergeleken met deze conventionele benaderingen, biedt dit model adoptief overdracht drie primaire voordelen. De eerste is dat er eenvoudiger kan geheugen B - en T-cellen specifiek voor het allergeen directer worden bestudeerd. Inderdaad, bewijs nu sterk impliceert geheugen B-cellen als de belangrijkste bron van langdurige allergieën18. Ten tweede, omdat hetzelfde nummer van B - en T-geheugencellen zijn ingeplant in elke ontvangende muis, de allergische reacties zijn minimaal variabele. Ten derde, dit model biedt de mogelijkheid te bestuderen van allergische reacties op individuele allergenen, wat in het kader van het testen van nieuwe immuuntherapie handig is. Een intrigerende toepassing van dit model is het gebruik van de algemene aanpak in het kader van een gehumaniseerd muismodel, waar de allergische reacties in de geïmmuniseerde modellen22zijn bestudeerd. In het kader van een overdracht van het adoptie-model toegepast, een gehumaniseerd muismodel zou een krachtige aanpak uit te breiden en in vivo tests van B - en T-cellen van allergische patiënten.
Antilichaam ziekte pathogenese treedt niet alleen op in allergische modellen, maar ook in B-cel gemedieerde auto-immune ziekten23. Uiteindelijk zou adoptively gesensibiliseerde splenocytes overbrengen van muizen gezien een autoantigen zeer nuttig zijn bij het verminderen van het aantal gebruikte dieren, minimaliseren van het aantal dieren ontvangen meerdere injecties van adjuvante en verhogen de reproduceerbaarheid van reacties tussen cohorten van muizen in meerdere aanwijzingen van ziekte. Een voorbeeld zou zijn in een experimentele autoimmune model van myasthenia gravis (EAMG) in welke gevoelig muis zijn stammen (C57BL/6 SJL en AKR) meerdere keren geïmmuniseerd met acetylcholine receptor (AChR) in adjuvans om pathogene autoantilichamen. Deze autoantilichamen uiteindelijk leiden tot immunopathologische functies aanwezig in mensen zoals vermoeidheid/zwakte van de spier, storting van immunoglobulinen, alsmede aanvulling onderdelen op neuromusculaire kruispunten en in ernstige gevallen morbiditeit/death24. In EAMG varieert de incidentie van de ziekte sterk tussen 50-70%, dus om deze variabiliteit te verklaren zijn grote dieren cohorten moest bereiken statistische significantie25,26. De hier beschreven methode zou uiteindelijk het verminderen van het aantal dieren die worden gebruikt door het verlagen van de variabiliteit in de ziekte-incidentie. Zoals eerder genoemd, EAMG wordt veroorzaakt door meerdere injecties met AChR + hulpstoffen (Complete Freund van adjuvante en onvolledige Freund van adjuvante) tot trigger auto-antilichaam reacties. Deze methode zou het verminderen van het aantal dieren waarvoor meerdere injecteert met adjuvans. Tot slot, als gevolg van de aard van meerdere inentingen en verhoogt is het relatief moeilijk te definiëren van geschikte therapeutische windows voor preventieve en therapeutische behandelingen. Deze methode zou helpen met het synchroniseren van het antilichaam reactie ziekte pathogenese venster en daarmee een meer voorspelbare en reproduceerbaar. Deze zelfde logica kan worden toegepast op vele andere Muismodellen van antilichaam gemedieerde immuunziekten, zoals reumatoïde artritis27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0302 en W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
