Summary
Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.
Abstract
Respuestas de anticuerpos proporcionan inmunidad protectora crítica a una amplia gama de patógenos. Existe un gran interés en la generación de anticuerpos robustos para la vacunación, así como entender cómo patógeno anticuerpo respuestas desarrollan alergias y enfermedades autoinmunes. Generar respuestas de anticuerpos específicos del antígeno robusta no es siempre trivial. En modelos de ratón, a menudo requiere múltiples rondas de inmunización con adyuvante que conduce a una gran cantidad de variabilidad en los niveles de anticuerpos inducidos. Un ejemplo es en modelos de ratón de alergia a los cacahuates en modelos más robustos y reproducibles que minimicen el número de ratón y el uso de adyuvante sería beneficiosos. Presentado aquí es un modelo de ratón altamente reproducible de anafilaxis alergia del cacahuete. Este nuevo modelo se basa en dos factores clave: (1) específica de antígeno esplenocitos eventualmente se transfieren de un ratón sensibilizado de maní en un ratón receptor ingenuo, normalizando la cantidad de memoria específica de antígeno las células B y T a través de un gran número de ratones; y ratones receptores (2) posteriormente se refuerzan con un fuerte inmunógeno multivalente en forma de nanopartículas liposómicos mostrando el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2). La gran ventaja de este modelo es su reproducibilidad, que en última instancia, disminuye el número de animales utilizados en cada estudio, al tiempo que minimiza el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante. El montaje modular de estos liposomas inmunogénicas proporciona relativamente fácil adaptabilidad a otros modelos alérgicas o autoinmunes que involucran anticuerpos patógenos.
Introduction
La alergia alimentaria afecta al 8% de los niños en los Estados Unidos y prevalencia se ha incrementado en los últimos decenio1. Alergia al maní afecta a 1% de los niños y no es típicamente pequeño2. Aunque varios prometedores ensayos clínicos están en marcha para el tratamiento de la alergia alimentaria, incluyendo inmunoterapia oral (OIT), la inmunoterapia sublingual (SLIT) y epicutánea inmunoterapia (EPIT), actualmente no hay estrategias de tratamiento aprobado por la FDA para individuos alérgicos a cacahuete3,4,5,6,7,8de desensibilización. Por lo tanto, personas alérgicas deben evitar estrictamente los alergenos para evitar la anafilaxia. Quedan muchos interrogantes en cuanto a vías de sensibilización y subyacente a los mecanismos de desarrollo de alergia alimentaria.
Modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de la alergia, así como desarrollar nuevos tolerogénicas y desensibilización terapias9,10,11,12. Esto es particularmente cierto porque el alergénico principal del cacahuete (Ara h 2; Ah2) en seres humanos es también el alergeno dominante en varios descrito ratón modelos13,14. Mientras que los modelos de ratón de la alergia del cacahuete son invaluables en el estudio de los mecanismos de sensibilización y tolerancia, una desventaja es que puede ser variable y requieren el uso de adyuvantes. Inmunógenos más potente sería una forma de minimizar la variabilidad intrínseca de dichos modelos. Puesto que las células de B son fuertemente activadas por antígenos multivalentes, liposomas antigénicas mostrando el alérgeno son una buena opción debido a su capacidad para potencialmente activar células B a través de los receptores de células B (BCR) mientras que también tiene la propiedad de manera eficiente el compartimiento de las células T a través de ser tomado no específica de antígeno-presentación de cebado las células.
Aquí, describimos un protocolo detallado para antígenos de la proteína a la nanopartículas mediante una estrategia modular y fácil de conjugar. Utilizando un antígeno de suplente, fragmento Fab de anti-IgM, demostramos cómo potente estos liposomas antigénicas pueden ser en la activación de células B estimulante. Liposomas antigénicas con Ah2 antígeno fueron usados para desarrollar un nuevo modelo de ratón de confiere sensibilidad. En este modelo, los esplenocitos de ratones alérgicas cacahuetes verificadas, que contienen cacahuete específica memoria células B y T, se transfieren a ratones Congénicos de ingenuo. Inyección de liposomas conjugados con Ah2 en los ratones receptores, con el fin de inducir anticuerpos contra Ah2 induce respuestas de anticuerpos de memoria. Seguido por un único impulso con Ah2 soluble, anticuerpos específicos Ah2 dan lugar a una fuerte respuesta anafiláctica cuando estos ratones son desafiados posteriormente con Ah2. Ratones sometidos a la reacción alérgica responden de manera más uniforme y no han recibido un adyuvante, este enfoque es un modelo de alergia del cacahuete deseable y los resultados sugieren que puede tener utilidad en otros modelos de ratón impulsados por antígenos dirigidos a alérgenos y posiblemente autoantígenos.
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Protocol
El método general de acoplamiento proteína lípidos y incorporar en liposomas se basa en gran parte en trabajo anterior15. Todos los procedimientos animales descritos a continuación han sido aprobados por la Universidad de Carolina del norte en la colina de la capilla institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Todos los ratones utilizados en el modelo de la alergia del cacahuete son hembras BALB/cJ compradas de 3 semanas de edad. El cuidado Animal de la Universidad de Alberta y el Comité uso (ACUC) aprobó experimentos relacionados con el uso de bazos de ratón para análisis ex vivo en ratones C57Bl/6 de al menos 6 semanas de edad.
1. Conjugación de la proteína antígeno lípido pegilado
- Añadir 3 g de perlas de gel dextran reticulado con un rango de fraccionamiento de 1.500 – 30.000 Daltons (Da) a un matraz kitasato de 250 mL. Añadir 60 mL de tampón fosfato salino (PBS) y revolver continuamente con una barra de agitación magnética. Sellar el frasco y coloque en un vacío para iniciar la desgasificación en una placa de agitación durante un mínimo de 1 h.
- En una columna de 1.0 cm x 30 cm vidrio cromatografía con el tope de facturación cerrado, añadir PBS a la columna para lavar. Abrir el tapón de la facturación y la columna de desagüe. Después de lavar, añadir la mezcla de granos de gaseado a la columna. Añadir continuamente la mezcla hasta que la columna se encuentra a una altura de grano de aproximadamente 24 cm.
- Una vez que la columna tiene una 'cabeza' de aproximadamente 4 – 5 cm de PBS por encima de los granos envasados, tienen los siguientes pasos listos.
- Crear un sifón de flujo de gravedad mediante la medición de una pieza de tubería lo suficientemente larga para llegar a un estante de 1 – 2 pies por encima de la parte superior de la columna y crear un bucle que cae cerca de la parte inferior de la columna y regresa a la parte superior de la columna. Añadir un tapón de facturación a un extremo de la tubería, dejando a un lado de la tubería abierta. Coloque el extremo del tubo abierto en una botella de 500 mL de PBS y el lugar en el estante encima de la columna.
- Tome el extremo con el tapón de la facturación y conectar una jeringa de 10 mL. Abra la válvula de tope de facturación en la línea de tubería y drenaje PBS a través del tubo. Una vez que la PBS ha alcanzado tres cuartas partes de la forma a través de la tubería, rápidamente Retire la jeringa y añadir el tope de facturación a la parte superior de la columna, líquido debe estar en ejecución en la columna.
Nota: La cantidad de 'cabeza' de PBS en la parte superior de la columna de la izquierda debe estar entre 1 y 3 cm. La cantidad mínima para lavar la columna es de 3 volúmenes de columna.
- Determinar la cantidad de proteína (lunares) vincularse a lípidos basados en su peso molecular (MW).
Nota: El fragmento Fab de cabra anti-ratón IgM (sí mismo una IgG) se utiliza aquí como un antígeno sustituto universal para la estimulación policlonal de células B. En consecuencia, el fragmento Fab de la IgG de cabra tiene un MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) y está comercialmente disponible en una cantidad total de 1,3 mg. Así, la cantidad de proteína relacionada es 27,1 μmol. - Determinar el coeficiente de extinción de la proteína de interés. Si desconocido, medir la absorbancia de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro y dividir el valor280 por el número de moles calculado en el paso 1.4.
Nota: La extinción co-eficiente de Fab de cabra IgG a 280 nm es 64.600 M-1. - Para asegurar que dibujan cantidades de amina que contiene tampón se retiran, desalar la proteína sobre la columna creada en pasos 1.1 – 1.3 y recoger fracciones de proteína en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (~ 500 μl por fracción).
- Cierre la válvula de tope de facturación conectada a la parte superior de la columna y quitar la parte superior de la columna. Si no ya abra, abra la válvula de tope de volumen en la parte inferior de la columna y espere hasta que la 'cabeza' de PBS golpea la parte superior de los granos.
- Agregue lentamente en la proteína de interés a la parte superior de los granos con un vidrio pipeta Pasteur, teniendo cuidado de reducir al mínimo disturbio a la parte superior de los granos.
- Una vez que la 'cabeza' de la solución de la proteína ha llegado a la parte superior de los granos, añadir 1 mL de PBS suavemente a través de una pipeta Pasteur. Repetir tres veces. Añadir PBS para crear una cabeza de 4 – 5 cm y repetir el paso 1.3 para lavar la columna.
Nota: Este paso puede omitirse si es cierto que ningún búfer que contiene amina está presente.
- Determinar las fracciones que contienen proteína midiendo valores A280 y las fracciones que dan aproximadamente el 90% de recuperación de la proteína de la piscina.
Nota: Normalmente esto diluye la proteína 1.5-2-fold. Determinar la concentración de proteínas después de la puesta en común. Concentrado de la proteína en este paso, si es necesario, utilizando un concentrador de centrifugación. - Agregue 2.5 equivalente molar del crosslinker de heterobifunctional a la proteína.
- En primer lugar, pesan aproximadamente 5 mg de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) en un tubo de microcentrífuga. Para determinar el volumen para disolver la SPDP, tome la concentración molar y multiplíquelo por 250 x para generar una solución de 100 x que le dará un exceso molar de 2,5 en la reacción.
Nota: por ejemplo, si la concentración de proteína es de 50 μm, de SPDP 12,5 mm se necesita una solución. Para 5 mg de SPDP, esto corresponde a 1,27 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
- En primer lugar, pesan aproximadamente 5 mg de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) en un tubo de microcentrífuga. Para determinar el volumen para disolver la SPDP, tome la concentración molar y multiplíquelo por 250 x para generar una solución de 100 x que le dará un exceso molar de 2,5 en la reacción.
- Añadir SPDP a la proteína de interés en una dilución 1: 100. Lugar la reacción en un agitador oscilante a temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 1 h.
- Quitar exceso SPDP y proteger el enlace de disulfuro endógena, en la proteína en el paso subsiguiente reducción, equilibrar, y lavar la columna creada en los pasos 1.1 – 1.3 en 100 mM acetato de sodio (NaOAc) a pH 5.5 o crear una columna idéntica exclusivamente para uso en este memoria intermedia.
- Después de 1 h de incubación con SPDP, desalar la proteína en la columna equilibrada en 100 mM NaOAc. Llevar a cabo este paso de la misma manera como paso 1.6 excepto usando 100 mM NaOAc (pH 5.5) como eluyente. Recoger las fracciones, determinar A280y las fracciones superiores de la piscina. Lavar la columna en PBS.
- Preparar una solución de 2,5 M de la TDT (MW = 154 g/mol) en doble destilado agua (ddH2O). Añadir 25 mM TDT a las fracciones combinadas de proteínas de 5-10 minutos.
- Mida A280 de la proteína y esta divida por el coeficiente de extinción. También, determinar A343. Calcular la relación vincular basada en la molaridad de la proteína (un280) y linker (A343).
Nota: Desactivar la calibración automática del A340 si usando un espectrofotómetro nanodrop. La medición343 representa la absorbancia del grupo piridina 2-Tiona (coeficiente de extinción = 7550 M-1) que es eliminado de la vinculante SPDP por la TDT. Un cociente molar de vinculador: relación de 1.2 – 1.5 generalmente se logra al realizar la reacción con un 2.5 exceso molar de SDPD en una amplia gama de proteínas. - Ejecutar las fracciones agrupadas sobre la columna de lavado en PBS como se describió anteriormente. Recoger las fracciones, determinar A280y fracciones superiores de la piscina. Determinar la concentración de proteína por A280 después de agrupación de las fracciones.
- Preparar DSPE-PEG (2000)-maleimida (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-maleimida. Esto se añadirá a la proteína en una proporción molar de 10:1. Preparar un stock de 100 x de DSPE-PEG (2000)-maleimida para alcanzar la concentración deseada.
- Por ejemplo, si la concentración de proteína es 10 μm después de paso 1.14, preparar un caldo de DSPE-PEG (2000)-maleimida en 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG (2000)-maleimida (MW = 3000 g/mol) y añadir la cantidad apropiada de DMSO. Múltiples rondas de Vortex suave y sonicando pueden conseguirlo completamente disuelto.
- Determinar el volumen total de las fracciones de paso 1.14 y transfiera la solución cuidadosamente a un pequeño (10-25 mL) ronda matraz de fondo (FBR). Añadir la cantidad apropiada de 100 x DSPE-PEG (2000)-maleimida a la proteína para lograr un 1 x, 10 veces concentración molar de exceso, final. Agite suavemente la solución para asegurarse de que el DMSO es totalmente dispersa.
- Ejecutar la reacción durante la noche bajo nitrógeno en un RBF sellado. Utilizar una membrana de goma y colocar en una campana de humos.
- Quite la atmósfera pinchando el tabique con una aguja de 20 G conectada a una jeringa de 3 mL en el extremo del tubo atado vacío y gire en vacío de 3 a 5 s.
- Reemplazar la atmósfera con el nitrógeno. Llene un globo conectado a una jeringa de 3 mL por la mitad con nitrógeno y conecte una aguja de 20 G. Punción del septo para llenar la atmósfera dentro del matraz de fondo redondo con nitrógeno. Repetir la extracción de la atmósfera y el reemplazo con nitrógeno una vez más y dejar el balón de nitrógeno conectado toda la noche.
- Preparar una columna de grano de gel dextran reticulado separada con un rango de fraccionamiento de 4.000 – 150.000 Da en una columna de cromatografía de vidrio de 1.0 cm x 50 cm (según medidas 1.1-1.3).
- Al día siguiente, quitar la proteína desde el matraz de fondo redondo preparado en el paso 1.17 y run (seguir el método utilizado en el paso 1.6) sobre la columna de perla gel dextran reticulado (del paso 1.18).
Nota: El monto total a cargar en la columna debe ser no más de 2 mL. Si se utiliza una reacción más grande, dividido en dos y correr en columnas separadas o en una columna de diámetro más grande.- Recoger las fracciones, determinar la A280, fracciones superiores de la piscina y determinar la concentración de proteína. La presencia de los lípidos no afectará las medidas.
- Almacenar las fracciones combinadas finales de proteína lípidos vinculados a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
2. preparación de liposomas
- Pesar los lípidos: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-cholestene, 5-colesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; y DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/bandeo crear una solución de 5 mg/mL de DSPC, solución 4 mg/mL de colesterol y 2 mg/mL de solución de DSPE-PEG(2000) en cloroformo.
- Asegurar que la relación molar de lípidos en los liposomas: 57% DSPC 38% colesterol y 5% DSPE-PEG(2000), según lo representado en la tabla 1.
Nota: Es importante controlar la cantidad de antígeno en los liposomas, que generalmente oscila entre 0.01 – 0.1%. En la tabla 1, se utiliza el 0.1% de cabra anti-ratón fragmento IgM Fab ligado a pegilado lípidos. Es fundamental tener en cuenta de la muela 10 veces exceso de DSPE-PEG (2000)-maleimida que se agregó a la proteína de paso 1.15, para asegurar que la cantidad total de lípidos pegilado no exceda del 5%. - Considerar las cantidades de lípidos final (μmol) al crear los lípidos para extrusión. Vea la tabla 1 para obtener un ejemplo de cálculo de las concentraciones de lípidos molar para la creación de liposomas en una concentración de lípido total 1,25 μm.
- Una vez se ha calculado la cantidad correcta de cada lípido a se suman, combinan todos en un tubo de ensayo de vidrio borosilicato de 12 mL.
-
Sople con cuidado el cloroformo.
- Use el tubo y una jeringa de 3 mL con aguja, preparada en el paso 1.17.1, soplar cuidadosamente de cloroformo en el tubo de nitrógeno. Suénese suavemente la corriente de nitrógeno en la solución mientras gira el tubo con la otra mano. Tenga cuidado minimizar salpicaduras o causando el líquido a correr camino hasta el lado del tubo que sea más difícil llegar a esta solución en el siguiente paso.
- Añada 100 μl de DMSO a cada tubo y liofilizar esta solución durante la noche. Cubrir la parte superior del tubo con un trapo de laboratorio no estático, seguro con una banda elástica y congelar a-80 ° C.
3. liposomas extrusión
- Añadir 1 mL de PBS con la proteína lípidos vinculados al tubo de 12 mL que contiene los lípidos. Someter a ultrasonidos la solución por aproximadamente 30 s a 1 min en un baño de sonicación. Descansar durante 5 minutos o más entre cada ronda y repetir 3-4 veces.
-
Preparar una extrusora lo indicado por el fabricante.
- Añadir los soportes del filtro en el soporte de la membrana interna, coloque unas pocas gotas (10 μl) de PBS en la película de parafina. Con unas pinzas, agarra un borde del soporte del filtro y sumergir en la gota de 10 μl.
- Coloque el filtro dentro de la junta tórica. Hacer esto para ambos lados. Con unas pinzas, un filtro de 0,8 μm en el borde del gancho agarrador y sumergir en la gota de 10 μl y capa exterior de la junta tórica con PBS. Coloque el filtro de 0,8 μm suavemente en la junta tórica para que filtro soporta no sobre colgar la membrana interna.
- Coloque el bloque de calefacción de extrusora en un plato caliente para precalentar la extrusora. Encender la placa de baja y deje que la extrusora de bloque de calefacción alcanzar la temperatura deseada. Para evitar posibles problemas con la agregación de la proteína, no calentar el bloque pasado 37 ° C.
- Cargar la sonicación de la muestra en una de las jeringas extrudadas en la extrusora. Coloque la jeringa de la extrusora en el otro extremo de la extrusora. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa vacía se establece en cero. Se llenará la jeringa vacía como el lípido se extruye a través de la membrana de policarbonato 0.8 μm. Trate de evitar pasar burbujas hacia adelante y hacia atrás a través de la membrana.
- Coloque la extrusora completamente montada en el bloque calefactor. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa llena con lípidos hacia la jeringa vacía. Dependiendo de la concentración de lípidos, será difícil empujar a través. Repita 20 x.
- Retire la extrusora completamente montada el bloque de calefacción. Lentamente retire la jeringa llena del estirador, recoger cualquier lípidos que pueden gotear al retirar. Colocar liposomas en un frasco limpio. Repita los pasos 3.4-3.6 uso policarbonato 0,2 μm y 0,1 μm membranas.
- Crear una columna de grano reticulado agarosa 0,7 x 50 cm2 con separación entre 0.7-10 Mega Daltons (MDa) equilibrados en PBS. Añade los liposomas y ejecuta como en el paso 1.6. Fracciones que contienen liposomas habrá disminución de transmisión de luz en el rango de 250-400 nm.
- Almacenar los liposomas a 4 ° C y no congelar.
4. calcio flujo para controlar la activación de células B por liposomas antigénicas
- Eutanasia a ratones por dióxido de carbono (CO2) o sobredosis de isoflurano, según procedimientos de operación estándar institucionales. Eutanasia de ratones para confirmar la dislocación cervical.
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos y canal de ratones con etanol al 70%. Uso 10 cm de largo, 0,8 mm punta, curva pinza de iris para separar la piel que cubre la cavidad torácica de la caja torácica. Utilizar 10 cm tijeras de disección largo, recto para hacer una incisión distal con una incisión bilateral.
- Utilice el iris curva pinzas y tijeras de disección para extraer el bazo de la cavidad abdominal. Eliminar tejido graso que rodea bazo y colocarla en un tubo cónico de 15 mL poliestireno, llenado de RPMI1640 medio que contiene 1% suero fetal del becerro (FCS) y penicilina-estreptomicina.
- Bazo de transferencia y los medios de comunicación sobre un tamiz de 40 μm células montados en un tubo cónico de 50 mL. Utilizando el extremo de la goma de un émbolo de la jeringa de 3 mL, aplastar suavemente el bazo. Lave el filtro de la célula de 40 μm con los medios de comunicación. Repita este proceso hasta que sólo tejido graso queda en el colador de célula 40 μm. Enjuague la criba con 3-5 mL de medio para aumentar la recuperación de la célula.
- Centrifugar el homogeneizado celular a 300 x g durante 5 min a TA. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y añadir 10 mL de tampón de lisis de RBC de x 1 a los pellets. Pipetee hacia arriba y hacia abajo, dejar de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
- Deseche el sobrenadante y resuspender esplenocitos glóbulos rojos agotado en 10 mL de medio. Determinar un número total de células usando un hemocitómetro u otro dispositivo de conteo de celdas. Sedimenten las células por centrifugación como se describió anteriormente.
Nota: La concentración final ideal necesaria para Indo-1 carga de esplenocitos es 10 – 20 x 106 células/mL, pero puede utilizar una menor concentración de células. - Resuspender esplenocitos en 15 x 106 células/mL en el flujo de calcio cargando buffer (medio RPMI1640 que contiene 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), 1 mM cloruro de magnesio (MgCl2), (1 mM) etilenglicol bis Β-aminoetil éter)-N, N, N', N'-tetraacético, ácido (EGTA) y el 5% penicilina-estreptomicina). Añadir 1,5 μm Indo-1 de una solución stock de 1 mM DMSO, invertir el tubo varias veces para mezclar. Proteger de la luz e incubar las células en baño de agua de 37 ° C durante 30 minutos.
- Después de la incubación de 30 min, añadir 5 x la cantidad de flujo de calcio buffer de carga. Centrifugar a 300 x g por 7 min a TA.
- Para la sincronización de las células de B, mancha las células con 1: 200 anti-ratón CD5-PE y 1: 200 de anti-ratón B220-PE/Cy7 en 0,5 mL de buffer a 4 ° C por 20 min, protegido de la luz de carga.
- Lave esplenocitos en el flujo de calcio carga de buffer y centrifugar a 300 x g por 7 min en RT. resuspender las células en 10 – 20 x 106 células/mL en el flujo de calcio corriente buffer (Hank equilibrada solución de sal (HBSS) que contiene 1% FCS, 1 mM MgCl2 y 1 mM cloruro de calcio (CaCl2)). Almacenar en hielo, protegidos de la luz hasta que esté listo para ejecutar en citómetro de flujo.
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Configuración de citometría de flujo con manchas sin manchas y solo controles de compensación.
- Funcionamiento de las células para las puertas adecuadamente (ver figura 2A). Configuración de Indo-1 (violeta) versus la trama de la Indo-1 (azul), ajustar las tensiones en los canales de Indo-1 para colocar las células de coloración en una cuesta de 45 a 60 ° para maximizar la señal: ruido de la violeta de Indo-1: cambio azul en proporción después de estimulación de células B.
Nota: Asegúrese de que las tensiones no son demasiado altas, que un porcentaje significativo de las células (> 5%) son contra la parte superior de la parcela. - Crear una puerta diagonal que encapsula la parte izquierda superior (violeta+azul–) de la parcela, tal que sin estimulación < 10% de las células están en la puerta, que idealmente debería aumentar a > 75% después del estímulo.
- Funcionamiento de las células para las puertas adecuadamente (ver figura 2A). Configuración de Indo-1 (violeta) versus la trama de la Indo-1 (azul), ajustar las tensiones en los canales de Indo-1 para colocar las células de coloración en una cuesta de 45 a 60 ° para maximizar la señal: ruido de la violeta de Indo-1: cambio azul en proporción después de estimulación de células B.
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Añadir 0,5 mL de células a 5 mL con tubo de poliestireno fondo (celular activado por fluorescencia tubo (FACS) de clasificación) y calentar las células a 37 ° C durante 3 – 5 min en un baño de agua. Coloque el tubo de la FACS en la cámara de agua de 37 ° C conectado a un baño de agua recirculante.
- Ejecutar el tubo la water-jacket en el citómetro de flujo e iniciar la adquisición, sin almacenar los datos, a aproximadamente 5.000 – 10.000 eventos/s. Una vez que las células han estabilizado (15-30 s), iniciar la adquisición y recogida de datos para al menos 10 s para establecer el fondo.
- En la marca de la s 10, rápidamente Retire el tubo de la citometría de flujo, agregar la estimulación (liposomas antigénica 5-50 mM 2-20 ml), el vórtice de pulso y devolver el tubo FACS en el citómetro de flujo. Mantener la adquisición de datos y almacenamiento de información a través de este tiempo y recopilar datos durante 3 – 5 minutos.
- Analizar los datos en el software de análisis apropiado bajo las funciones de la cinética.
5. preparación del extracto de cacahuete
- Extracto de proteínas maní mezclando harina de cacahuete en una proporción de 1:5 (wt:vol) de tampón fosfato salino (PBS) con cloruro de sodio de 1 M (NaCl). Mezcle la solución en la placa de agitación magnética durante 2 h a temperatura ambiente manteniendo a pH 8.5.
- Solución de centrifugar a 3.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C. Decantar y filtro-esterilizar sobrenadante secuencialmente a través de un filtro de 0.4 μm, seguido por un filtro de 0.2 μm. Determinar la concentración de proteína por el análisis de (BCA) ácido bicinchoninic utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.
- Reducir y desnaturalizar una muestra de proteínas maní con 50 mM Ditiotreitol (DTT) en un tampón que contiene dodecil sulfato de litio a un pH de 8.4, que permite la máxima actividad del agente de reducción y de calor a 70 º C durante 10 minutos.
- Ejecutar 10 μg de proteína desnaturalizada del cacahuete en un gel de poliacrilamida de empaquetados 4 – 12% Bis-Tris diseñado para dar separación óptima gel del gradiente con peso molecular previamente manchada estándar.
- Tinción del gel con disulfonated triphenylmethane y desmanchar con ddH2identificar O. conoce los principales alergénicos del cacahuete Ara h 1, 2 y 3 en las preparaciones de extracto. Ara h 1 aparece de 63 kDa, Ara h 2 debe aparecer como dos isoformas en el 17 y 19 kDa, y Ara h 3 aparece en 37 kDa (subunidad ácida).
6. sensibilización de los ratones al cacahuete
- Resuspender la toxina del cólera 1 mg en 1 mL de agua ultrapura. Preparar 200 μL diluidas Extracto de cacahuete contiene 2 mg proteína del cacahuete y 10 μg toxina del cólera en PBS.
- Administrar 200 μL del extracto de cacahuete contiene cólera toxina (proteína del cacahuete 2 mg y 10 μg toxina del cólera) vía oral por sonda nasogástrica a cada ratón hembra de 4 – 5 semanas viejo BalB/cJ. Repetir una vez por semana durante tres semanas (es decir, en los días 0, 7 y 14).
- Administrar 300 μL diluir Extracto de maní (contiene proteína del cacahuete 5 mg y 10 μg toxina del cólera) vía oral por sonda nasogástrica a cada ratón en la cuarta semana (es decir, 21 días).
7. desafío de ratones con el extracto de cacahuete
- En el día 28, preparar Extracto de cacahuete a una concentración final de 1 mg/mL en PBS. Medir la temperatura del cuerpo de referencia usando un termómetro rectal (aproximadamente 37,5 a 38,5 ° C). Administrar 200 μl (200 μg) de extracto de maní mediante inyección intraperitoneal (i.p.).
- Medir temperatura con termómetro rectal cada 15 min durante 1 h después de la inyección. Un baño en la temperatura corporal indica alergia al cacahuete.
Nota: La hipotermia es un rasgo distintivo de la anafilaxia en ratones. Este desafío será demostrar que ratones están alérgicos al cacahuete. Típicamente, el 90% de los ratones de Balb/cJ que el protocolo de sensibilización desarrollan reacciones alérgicas durante reto caracterizado por al menos una disminución de temperatura de 2 – 3 ° C.
8. aislamiento de esplenocitos de ratones alérgicos y transferencia adoptiva
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Aislar los esplenocitos de ingenuo y ratones alérgicas cacahuetes.
- El día 30, eutanasia ingenuo y ratones alérgicas cacahuetes confirmadas mediante la administración de 3 L/min de CO2 en una cámara de gas. Confirmar la eutanasia de los ratones por toracotomía bilateral. Esterilizar instrumentos quirúrgicos y canal de ratón utilizando etanol al 70%. Usar pinzas para separar la piel que cubre la cavidad torácica de la caja torácica. Utilizar tijeras rectas de disección para realizar una incisión bilateral rompiendo las costillas izquierdas y derecha.
- Use pinzas y tijeras de disección para extraer el bazo de la cavidad abdominal. Eliminar el tejido graso que rodea el bazo antes de colocar en el tubo cónico de 15 mL poliestireno, con Medio RPMI 1640 de 10 mL.
- En una campana de flujo laminar estéril, vierta el bazo y los medios de comunicación en un poliestireno de 35 mm placa de Petri. Mantenga ingenuo y esplenocitos alérgico en distintos platos de Petri y los medios de comunicación durante el aislamiento de células. Use pinzas esterilizadas y tijeras disección bazo en tres pedazos y volver a plato de Petri.
- Utilizando el borde áspero, helado de dos portaobjetos de cristal, suavemente homogeneizar (en RPMI) las piezas del bazo hasta tejido blanco permanece entre las diapositivas. Cambio, se desliza entre los grupos.
- Transferencia de homogeneizado celular de plato de Petri por un colador de célula μm 70 montada en un tubo cónico de 50 mL. Pasar los fragmentos del bazo a través de la filtro con un émbolo de una jeringa de 1 mL. Enjuague la criba con 5 mL de RPMI para maximizar la recuperación de la célula. Transferir el filtrado a un tubo cónico de poliestireno de 15 mL y centrifugar (450 x g, 10 min, RT).
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celulares en tampón de lisis de eritrocitos de 2 mL (cloruro de amonio de 0,83% en tampón Tris 10 mM, pH 7,2). Mezclar e incubar a temperatura ambiente 2 – 3 minutos agregar 10 mL de PBS - 2% de SBF y centrifugar a 300 x g durante 7 min a TA.
- Lavar las células otra vez con 12 mL de PBS - 2% FBS completamente quitar cualquier cloruro de amonio residual y centrifugar a 300 x g por 7 min en RT. resuspender células pellets en 2 mL de Medio RPMI 1640. Contar las células usando un hemocitómetro o analizador automático de Hematología.
- Usando un 27 G, aguja de 5/8 de pulgada en una jeringa de insulina 1 mL, inyectar por vía intravenosa 15 x 106 alérgica o ingenuo esplenocitos extraído como se describió anteriormente (en 200 μL) a través de la vena de la cola en ratones ingenuos (intolerancia al Rh-negativo).
9. inyección de ratones con liposomas antigénica de Ara h 2
- Preparar el Ah2 liposomas que contienen 0,1% Ah2 a lípidos de 2,5 mM. Para el cálculo de la concentración de proteína, el coeficiente de extinción de Ah2 es 15.000 M-1. Liposomas diluidas a 300 μm en PBS estéril.
- Un día después de la transferencia adoptiva (día 31), de alergia o ingenuo esplenocitos, inyectar por vía intravenosa 200 μL de PBS o los liposomas antigénicos Ah2 (300 μm) que contienen un total de 1.38 μg de Ah2 a través de la vena de la cola de ratones BALB/cJ que recibieron los esplenocitos en el paso 8.2.
10. impulso y desafío de ratones con Ara h 2
- Dos semanas después de la inyección con Ah2 liposomas, en el día 45, utilice una lanceta de animal de 4 mm para recoger 50 – 200 μL de la sangre de la ensambladura submaxilar del ratón. Recoja la sangre en un tubo separador de suero sin heparina; separado el suero por centrifugación a 6.000 x g durante 15 minutos usar el suero recogido más tarde en anticuerpos de antígenos específicos de medida.
- En el día 46, dos semanas después de la inyección a ratones con liposomas (paso 9.2), impulse ratones una inyección i.p. de 200 μL de PBS o 200 μg de Ah2 soluble (purificada como se describió anteriormente16).
- En 60 días, recoge 50-200 μL de sangre de la ensambladura submaxilar del ratón y procesar la sangre como se describió anteriormente.
- Día 61, desafiar a cada grupo de ratones con una inyección i.p. de 200 μL de 300 μg Ah2 soluble. Medir la temperatura del cuerpo con sonda rectal cada 15 min como en sección 7.
11. cuantificación de Ara h 2-específico IgE e IgG1 por ELISA
- Capa un ensayo de 96 pocillos enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA)-placa compatible con 100 μl HSA-DNP (2, 4-dinitrofenilo hapteno conjugado al ser humano de seroalbúmina, 20 μg/mL) para la curva estándar o Ah2 (5 μg/mL) para las muestras de suero recolectaron en pasos 10.1 y 10.3, diluido en de tampón con revestimiento (50 mM de tampón carbonato-bicarbonato, pH 9.6) a 4 ° C durante la noche o 37 ° C durante > 1 h.
- Lavar tres veces con 200 μL PBS-T (PBS con 0,05% Tween-20) y bloquear pozos con 200 μL PBS-T que contiene BSA 2% a 37 º C durante > 2 h.
- Ah2-específico IgE ELISA, añadir niveles de IgE anti-DNP de 50 μl (2 – 0.002 μg/mL, preparado a partir de diluciones seriadas 1:2) o las muestras de suero de ratón (1:20 dilución) e incubar durante la noche a 4 ° C. Para ELISA de IgG1 específico Ah2, agregar 100 μl purificada normas IgG1 anti-DNP (2 – 0.002 μg/mL, preparado a partir de diluciones seriadas 1:2) o ratón (dilución 1: 500) de las muestras de suero e incubar durante una noche a 4 ° C o 1 h a 37 ° C.
- Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Para Ah2-específico IgE ELISA, añada 100 μl ovejas anti-ratón IgE (0,5 μg/mL) e incubar a 37 ° C durante 1 h. Para ELISA de IgG1 específico Ah2, añada 100 μl HRP cabra anti-Mouse IgG1 (diluido 1:40,000 en PBS-T - 2% BSA). Incubar a 37 ° C durante 1 h.
- Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Ah2-específico IgE ELISA, añadir 100 ovejas contra burro biotinilado de μl (0,5 μg/mL) de IgG e incuban a 37 ° C por 45 minutos. Para ELISA de IgG1 Ah2-específicos, vaya al paso 11.7.
- Lavar tres veces con 200 μL PBS-T. Ah2-específico IgE ELISA, agregar 100 μl neutral cargada avidina-peroxidasa (p. ej., NeutrAvidin-HRP, 0,3 μg/mL) e incube a 37 ° C durante 30 minutos.
- Añada 100 μl 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato, incubar 10-15 minutos o hasta que muestras azul oscuro, luego agregar 100 μl parada de TMB. Leer la placa a 450 nm.
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Representative Results
Conjugación de la proteína de interés con DSPE-PEG(2000) puede demostrar ejecutando una reducción mostrando un incremento en el peso molecular en comparación con la proteína no conjugada. Figura 1A muestra un gel representante de conjugación de fragmento de anti-ratón IgM F(ab) PEG-DSPE, que muestra un bandshift de 2 – 3 kDa de la proteína desnaturalizada. Tenga en cuenta que aproximadamente el 50% de la proteína parece ser modificado, que se espera que la estequiometría 1:1 se logró en el fragmento Fab es un heterodímero de la cadena pesada y ligera. Figura 1B muestra un gel representante de Ah2 Conjugación DSPE PEG. Para evaluar el flujo de calcio de las células B estimuladas por liposomas antigénicas, dos cosas son cruciales: (1) las opciones están ajustadas para ver una diferencia en el cociente de la fluorescencia de Indo-1 en el Ca2 + limitado (violeta) y sin consolidar formas (azul) y (2) la propia estrategia de control se utiliza para evaluar la activación de células B. Figura 2A muestra el esquema de bloquea para el análisis de flujo de calcio basados en citometría de flujo. Energizados linfocitos son bloqueados en un SSC-A frente a FSC-A (panel izquierdo), dobletes son cerradas hacia fuera en una W FSC y SSC-W trama (panel central) y B200+CD5– de células B se seleccionan de una parcela de vs B220-PE/Cy7 CD5-PE (panel derecho). Figura 2B muestra la relación de Indo-1 (violeta) vs Indo-1 (azul) de la fluorescencia con el tiempo ya analizados. Tenga en cuenta que la concentración de proteínas totales de F(ab) y F(ab')2 en estos ensayos era los mismos, demostrando la capacidad superior de liposomas antigénicas en la activación de células B estimulante. Después de preparar el extracto de cacahuete, ejecutar una alícuota en un gel de SDS-PAGE para determinar las cantidades relativas de Ara h 1, 2 y 3 en el extracto. La figura 3 muestra un gel representativo de una extracción del maní que se ejecutó junto con Ah2 purificada. La figura 4 muestra un esquema del modelo de ratón general adoptivos alergia del cacahuete, incluyendo sensibilización inicial al cacahuete, reto de maní, splenocyte aislamiento y transferencia adoptiva, inyecciones de liposomas, sorteo de sangre seguido por impulso Ah2, y desafiar a Ah2. Ah2-específico IgE e IgG1 ELISAs fueron funcionadas para cuantificar las inmunoglobulinas en el suero, como se muestra en la figura 5A y B. Ratones con confiere sensibilidad que han sido potenciados con Ah2 tendrá Ah2-específico IgE e IgG1 en su suero. Temperaturas corporales en el desafío de Ah2 se muestran en la figura 5; ratones alérgicos habían disminuido las temperaturas del cuerpo tras el desafío, mientras que las temperaturas del cuerpo en ratones ingenua seguía siendo constante. Fotos de ratones ingenuos en comparación con ratones alérgicos a cacahuete durante el desafío de que se muestran en la figura 6.
Figura 1: gel representante de conjugación IgM F(ab) y Ah2 de anti-ratón a PEG-DSPE. (A, B) Análisis de SDS-page de (A) cabra anti-ratón IgM F(ab) fragmento y Ah2 (B) antes y después de la conjugación a PEG-DSPE. Cabra anti-ratón IgM y Ah2 tienen pesos moleculares de aproximadamente 48 y 18 kDa, respectivamente. Después de modificación, un peso molecular ligeramente más grande (~2.5 kDa) es claramente observado para ambas proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representación análisis, estrategia y resultados del flujo de calcio que bloquean. (A) las células fueron analizadas a través de la siguiente estrategia bloquea: viven los linfocitos (FSC-A vs SSC-A), las células (FSC-W vs SSC-W) y las células de B (B220+CD5–). (B) el Indo-1/Ca2 + flujo respuesta (violeta y azul) de las células de B. Es el flujo de calcio para liposomas del fragmento Fab de anti-IgM y anti-IgM F(ab')2 en la misma concentración de proteína (2,5 μg/mL) así como células de buffer-estimulados como control. Tenga en cuenta que entre s 10-22 es cuando se añade la estimulación y, por lo tanto, no hay datos se adquirieron durante este tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante gel con extracto de cacahuete y Ah2. Extracto de cacahuete contiene varias proteínas, incluyendo alérgenos Ara h 1, 2, 3 y 6, en comparación con las dos isoformas que aparecen para Ah2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema de protocolo de transferencia adoptiva de. Ratones BALB/cJ ingenuo fueron sensibilizados con extracto de cacahuete (PN) y la toxina del cólera (CT) y posteriormente desafió a PN. Esplenocitos de ratones alérgicos confirmados fueron aislados y transferidos en ratones ingenuos. Ratones más adelante fueron imprimados con inmunógenos liposomas de Ara h 2 o PBS, luego potenciados con Ah2 soluble. Por último, ratones fueron desafiados con Ah2 supervisar anafilaxia. Sangre recogida en los días 45 y 60 se utilizaron para cuantificar las inmunoglobulinas específicas Ah2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: liposomas de h 2 Ara inmunogénica aumenta las respuestas alérgicas atribuidas memoria. Suero era pre aislado (día 45) y post (día 60) impulso con PBS o 200 μL de inmunogénica Ah2 liposomas de 300 μm para medir IgE sepcific Ah2 (A) y IgG1 (B). Los ratones están representados con líneas que indican medianas. Los ratones que recibieron esplenocitos alérgica y son administran Ah2 liposomas día 32 tenían niveles significativamente más altos de IgE específico Ah2 y IgG1. Anafilaxia se midió en los grupos de tratamiento diferentes, registrando temperaturas corporales después de Ah2challenge (C). Significa temperaturas de cuerpo representadas con ingenua de SEM.: PBS (esplenocitos ingenuo y primer PBS), alérgicas: PBS (esplenocitos alérgica confirmada y primer PBS), alérgicas: Ah2 (confirmado esplenocitos alérgica y Ah2immunogenic liposomas prime). * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, *** P < 0.0001 determinado por desapareado del estudiante 2-cola t-test. Tenga en cuenta que estos resultados son representativos de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: síntomas anafilácticos observan durante reto Ah2. Ingenuo ratones permanecen activos y tienen la tez rosada sobre sus pies (A, C). Ratones alérgicos han disminuido la actividad, son a menudo encorvadas hacia arriba, han trabajado respiración y cianosis, indicado por tez púrpura más oscuro en los pies (B, D) de la experiencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Colesterol | PEG-DSPE | PEG-DSPE exceso | un IgM-PEG-DSPE | TOTAL | |
| Relación molar | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100.00 |
| masa (mg) | 0,56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| m mol | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| Concentración (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Colesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| un IgM-PEG-DSPE | 0,114 |
Tabla 1: cálculos para la creación de un liposoma de concentración total de lípidos de 1,25 μm. Ejemplo de tabla de cálculo para liposomas de cabra anti-ratón IgM F(ab) fragmento.
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Discussion
Los métodos descritos aquí son un protocolo general para la conjugación de una proteína a un lípido que permite la visualización de la proteína en nanopartículas liposómicos. Para proteínas de multi-subunidades muy grandes, este protocolo puede haber limitado utilidad. El método ideal sería la introducción de una etiqueta específica que permite una estrategia de enlace químico biorthogonal ser utilizado. Si expresan la proteína por vía recombinante, esto puede ser posible utilizando estrategias específicas disponibles17y una gran variedad de grupos funcionales en el final de los lípidos pegilado que están comercialmente disponibles. En consecuencia, este protocolo está dirigido a la vinculación de proteína aislada de fuentes naturales y es accesible a una amplia gama de científicos no necesariamente familiarizados con las transformaciones químicas y bioquímicas.
Un aspecto clave de ejecutar un experimento de flujo de calcio que debe destacarse es que las células no deben activarse antes de ejecutar el por citometría de flujo. Si no se utiliza rigurosamente una técnica estéril, esto representará una señal de alto de fondo de las células activadas (Indo-1 fluorescencia sesgada hacia su emisión en el canal violeta). Del mismo modo, las células deben mantenerse en hielo antes de ejecutar el análisis para evitar niveles anormales de fondo de señal en los canales de Indo-1. También es importante asegurarse de que las células son calentadas para 2 a 3 minutos antes de la adquisición por citometría de flujo y a lo largo de estímulo durante la adquisición de datos. Si las células no se mantienen a 37 ° C durante la adquisición de datos, se puede esperar que las células no responden máximo. Puesto que el antígeno específico de células B están presentes en ratones en números muy pequeños, usando un antígeno de sustituto para estimular todas B-las células de los ratones es ideal. Aunque existen numerosas cepas de ratón transgénico que expresa el antígeno específico de células B, el propósito de esta técnica es que el usuario medio poder validar su capacidad para hacer liposomas antigénicas utilizando ratones de tipo salvaje. Para lograr este objetivo, fragmentos Fab de anti-ratón IgM eran ligados a lípidos y formulados en liposomas antigénicas que enlazará el receptor de células B (BCR) de forma policlonal. Cabe destacar que anteriormente se demostró que este método puede usarse para estimular el humano las células de B10 utilizando el apropiado anti-humano IgM Fab fragmento, que es significativo porque no es posible acceder a un número significativo de específica de antígeno B-las células humanas. En estos estudios, la potencia de liposomas antigénicas para estimular la activación de células B fue ilustrada por su mayor capacidad para inducir el flujo de calcio en comparación con cantidades iguales de anti-ratón IgM F(ab') 2 fragmentos.
El uso de liposomas antigénicos ha permitido el desarrollo de una metodología para sensibilizar a ratones BALB/cJ al cacahuete, transferencia de esplenocitos de ratones alérgicas en ratones ingenuos, inyectando los ratones host con liposomas Ah2 y desafiándolos con Ah2. Los niveles de anticuerpos y respuestas anafilácticas en grupos de ratones son reproducibles en este modelo. Ha sido bien establecido que las respuestas de células T y B de memoria son fundamentales para el desarrollo de anticuerpos específicos de maní en ratones. Por otra parte, un estudio reciente ha demostrado que la memoria repoblación de células B células del plasma en ratones, que mantienen elevados niveles de IgE específica de antígeno; por lo tanto memoria alergénico-específicos de células B son un objetivo atractivo para intervención terapéutica18. El modelo descrito aquí ahora permite una oportunidad para atacar directamente las células de memoria B Ah2-específicas, en contraposición a un enfoque inmunosupresor con bortezomib a agotar el repertorio de toda la célula de plasma19. Otro enfoque para luchar contra las alergias es para inducir tolerancia en el compartimiento del T-cell. Una estrategia posible es encapsular adyuvantes inductores de tolerancia dentro de los liposomas. Previamente, nanopartículas encapsulando rapamicina fueron utilizadas para inducir Tregs y disminuir la enfermedad autoinmune20. Este tipo de enfoque podría emplearse para desarrollar terapias de tolerogénicas para tratar la alergia del cacahuete. En general, manipulación de la liposoma alergénico-específicos por conjugar las moléculas a la superficie permite a medida de las respuestas inmunitarias y encapsular las moléculas de droga-, como permite la entrega de drogas a la célula específica de alergeno.
Limitaciones generales de este modelo de ratón de la alergia del cacahuete son que la sensibilización a cacahuete con la toxina del cólera y posterior desafío cacahuete vía i.p. la inyección no es completamente representativo de alergia del cacahuete en los seres humanos (por ejemplo, los seres humanos tienen reacciones a la ingestión oral). Sin embargo, este modelo de alergia es el estándar actual en el campo11,18,21y nos permite investigar los mecanismos moleculares de la enfermedad alérgica y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. En comparación con los enfoques convencionales, este modelo de transferencia adoptiva ofrece tres ventajas principales. La primera es que permite memoria B - y las células T específicas para el alergeno a estudiar más directamente. De hecho, evidencia ahora fuertemente implica memoria de células B como la fuente principal de las alergias a largo plazo18. En segundo lugar, porque el mismo número de B - y T-células de memoria se implanta en cada ratón receptor, las respuestas alérgicas son mínimamente variables. En tercer lugar, este modelo ofrece la oportunidad de estudiar las respuestas alérgicas a alérgenos individuales, que es útil en el contexto de pruebas nuevas inmunoterapias. Una aplicación interesante de este modelo es usar el enfoque general en el contexto de un modelo de ratón humanizado, donde las respuestas alérgicas se han estudiado en modelos inmunizados22. Aplicado en el contexto de un modelo de transferencia adoptiva, un modelo de ratón humanizado podría ser un poderoso enfoque de expansión y en vivo la prueba de B - y las células T de pacientes alérgicos.
Patogénesis de la enfermedad anticuerpos no sólo ocurren en modelos de alergicos, pero también en células B mediada por enfermedades autoinmunes23. Transferir eventualmente sensibilizado esplenocitos de ratones dados un autoantígeno sería en última instancia muy útil en la reducción del número de animales utilizados, minimizar el número de animales que recibieron las inyecciones múltiples de adyuvante y aumentar la reproducibilidad de respuestas entre cohortes de ratones en múltiples indicaciones de enfermedad. Un ejemplo sería en un modelo experimental autoinmune de la miastenia gravis (EAMG) en que ratón susceptible de cepas (C57BL/6, SJL y AKR) se vacunan varias veces con el receptor de acetilcolina (AChR) en coadyuvante para el desarrollo de autoanticuerpos patógenos. Estos autoanticuerpos se llevan finalmente a immunopathological características presentes en los seres humanos como la fatiga/debilidad muscular, depósito de inmunoglobulinas y componentes del complemento en las ensambladuras neuromusculares y en casos severos, muerte morbilidad24. En EAMG, la incidencia de la enfermedad varía ampliamente entre 50 – 70%, así que para tener en cuenta esta variabilidad grandes cohortes de animales se necesitan para alcanzar significación estadística25,26. El método descrito aquí en definitiva reduciría el número de animales utilizados por la disminución de la variabilidad en la incidencia de la enfermedad. Como se mencionó anteriormente, EAMG es inducida por múltiples inyecciones con CAIS + coadyuvantes (adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund) gatillo auto-anticuerpo respuestas. Este método reduciría el número de animales que reciben múltiples inyecta con adyuvante. Finalmente, debido a la naturaleza de múltiples vacunas y aumenta, es relativamente difícil de definir windows terapéuticos apropiados para tratamientos terapéuticos y profilácticos. Este método ayudaría a sincronizar el anticuerpo respuesta y enfermedad patogénesis ventana, haciéndolo más predecible y reproducible. Esta misma lógica puede aplicarse a muchos otros modelos de ratón de anticuerpos mediada por enfermedades autoinmunes, como artritis reumatoide27.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por becas del Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0302 y W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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