Summary
慢性的な高眼圧症は、ラットおよびマウス、緑内障と網膜神経節細胞の構造と機能の劣化につながる circumlimbal 縫合を適用することによって誘導されます。
Abstract
Circumlimbal 縫合は、慢性的な眼圧 (IOP) 緑内障のよく知られている危険因子を高めることによって齧歯動物で実験的緑内障を誘発するテクニックです。このプロトコルは、長い期のラットと c57bl/6 マウスにこの手法を順を追って示します。全身麻酔下で「巾着」縫合糸は結膜、赤道周りや目の角膜の後ろ側に適用されます。仲間の目は、未処理のコントロールとして機能します。ラットの 8 週間と 12 週間のマウスの時代、我々 の研究期間にわたって IOP は上昇残った意識動物局所麻酔なしでリバウンド トノメトリで定期的に測定されました。両種で縫合の目は網膜機能の内部優遇の網膜機能不全と一致を示した。光干渉断層計は、網膜神経線維層の選択的な間伐を示した。断面を見つけたラット網膜組織減少神経節細胞層の細胞密度が他の細胞の層に変化はないです。フラット マウント マウス網膜神経節細胞特異的マーカー (RBPMS) と染色性神経節の細胞の損失を確認しました。Circumlimbal 縫合はシンプル、最低限ラットおよびマウスの神経節細胞傷害につながる眼圧を誘導するために侵襲的で費用効果の高い方法です。
Introduction
動物モデルでは、携帯の実験室調査のための重要なプラットフォーム潜在的な治療上の介在を評価する基になる緑内障の病因、同様の処理を提供します。いくつかの誘導型モデルは、持続的な眼圧 (IOP) 上昇、緑内障の最も重要なリスク因子を生成する開発されています。眼圧を高めるに適用されている方法があります:1レーザー光凝固小柱網2の輪部静脈3、およびように物質の眼注射の静脈の上強膜における高張生理食塩水注入ゴースト赤い血液細胞4、ミクロ粒子のニキビトリートメント5,6と粘弾性エージェント7。それぞれの方法には、利点と限界があります。
外傷、炎症、メディアの混濁など最小限の合併症との病気プロセスを模倣しては、緑内障のための良いモデル。これらの合併症は、眼圧上昇を誘導するための手順と頻繁に関連付けられる、結果の解釈を混同することができます。たとえば、前房穿刺異物が起きない場合でも示されているトラウマと典型的な緑内障性変化8,9の代表ではない炎症を起こす。、炎症を避けることの重要性だけでなく生体内イメージングと疾患の進行をモニターする電気生理学を容易に光学的透明度を維持します。これらの合併症が病気の調査に影響を与えるどの程度まで明確ではありませんがモデルの誘導中に目を貫通しないようにするより良いことがあります。Circumlimbal 縫合アプローチ地球の侵入を回避し、生体内で網膜の構造と機能の縦断的評価が容易になります。もっと重要なは、このモデルは必要に応じて縫合の除去によって眼圧を基準値に戻りますその容量で以前のものとは異なります。IOP 正規化は細胞を調査に役立つかもしれないし、分子相関可逆・不可逆的な神経節の細胞傷害10、11,12,13,14。
モデル誘導する手法について説明します。ラットおよびマウスのこのモデルによる網膜の損傷の評価の場合15,16,17,18,19に詳しく別の場所で見つけることができます。
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Protocol
すべての実験手順は、オーストラリア国立保健医療研究評議会によって設定の科学的な目的のためケアと動物の使用のためオーストラリアのコード練習で行われました。ハワード Florey 研究所動物倫理委員会から倫理が承認された (承認番号 13 044 UM と 13 068 UM ラットとマウス、それぞれ)。
1. 意識下ラットにおける眼圧測定
- 研究室のリバウンド眼圧計をラットの設定に設定します。動物を落ち着かせる柔らかい布の部分で目がさめているラットを押さえつけます。頭と首を公開します。優しく捜査員の胸に休んで動物の背中を片手で胴を保持します。
注: 局所麻酔は必要ありません。 - IOP プローブの先端が約 2 〜 3 mm から離れておよび垂直角膜頂点にようにラットの目には、近くリバウンド眼圧計を持ってもう一方の手を使用します。右手を使用して動物の右目と左目に左の手で眼圧を測定します。
- 落ち着かせ、測定ボタンを一度押ラットの数秒を待ちます。IOP プローブの先端は優しく角膜頂点を一度ヒットを観察します。一度リバウンド眼圧計のビープ音を聞きます。
注: 単一のビープ音、眼圧計の測定に成功、液晶画面から読むことができますを確認します。ビープ音は、測定エラーを示します。測定誤差はプローブと角膜、眼圧計、または、まぶたや角膜の非中央部に印象的なプローブの向きの過剰な傾きの不適切な作動距離などの要因から生じる。測定誤差に関する詳細については、製造元からリバウンド眼圧計のマニュアルを参照してください。 - 手順 1.3 1-2 秒の間隔で 10 回、これらの測定値からその時点の平均眼圧値を派生させます。5回読んだ後、眼圧計をリセットします。
- シリアル監視の日と21日 IOP サイクル20,による変動を最小限に抑えるための一貫した照明条件下で同時に眼圧を測定します。
2 意識下マウスにおける眼圧測定
- リバウンド眼圧計を製造元の指示に従ってマウスの設定に設定します。
- 手でマウスを牽制するには、グリルのケージの上にマウスを置くし、優しく後方、しっぽを引っ張る。
注意: これはその体を伸ばす少し前脚自体を楽しみ、プルしようと金属のグリルの上にグリップする動物を求められます。- 耳の後ろにすぐにたるんだ皮膚を把握するのに他の手を使用します。薬指と中指の間 (または小指と手のひらの間) の尾を保持することによって動物の下半身を固定します。
注: 試みきつすぎる、窒息、目の圧力を避けるために皮膚を把握していません。
- 耳の後ろにすぐにたるんだ皮膚を把握するのに他の手を使用します。薬指と中指の間 (または小指と手のひらの間) の尾を保持することによって動物の下半身を固定します。
- (当初は持ち株尾) 今のところ無料の手で、IOP のプローブの先端が約 2 〜 3 mm と垂直から角膜頂点にマウスの目に近いリバウンド眼圧計をもたらします。もう片方の目を測定するには、もう片方の目が、眼圧計の前に配置されるようにマウスを回転させます。
- 落ち着かせ、一度測定ボタンを押してマウスを待ちます。IOP プローブの先端は優しく角膜頂点; をヒットを観察します。成功の測定を確認する単一のビープ音。
注: ビープ音は、測定エラーを示します。最初の実験は、測定しながら 2 番目の実験者の読み取りとドキュメント眼圧測定値があることがあります。 - 2.4、IOP を派生させる 10 の成功した読み取りを取得する手順を繰り返します。5回読んだ後、眼圧計をリセットします。測定値間 1 〜 2 秒の間隔を許可します。
- ラットのシリアル測定に従って日のおよび一貫した照明条件下で同時にマウス眼圧を測定します。
3. 麻酔下ラット ・ マウスでの眼圧上昇の誘導
- 70% エタノールで 0.5% クロルヘキシジンと手術のベンチをクリーンアップします。滅菌ドレープとベンチをカバーします。オートクレーブあらかじめすべての手術用機器。すべて実験者着用適切な個人用保護具 (マスク、ガウンと滅菌手袋) を確認します。
- 全身麻酔を誘導するには、誘導室に動物を配置します。3 L/分の流量で O2 3 3.5% イソフルランを提供します。
- 2 L/分配信を介して手術中齧歯動物マスクで 1.5% イソフルレンで麻酔を維持します。足ピンチ反射の不在によって麻酔の十分な深さを確保します。
- 約 60 呼吸/分で呼吸を維持するために必要があるときの流量を調整することによって呼吸抑制を避けてください。
- 未処理のコントロールとして機能する反対側の眼の眼圧を誘導するために 1 つの目をランダムに選択します。局所麻酔のため 0.5 %proxymetacaine 点眼液の一滴を植え付けます。眼の表面をきれいにするには、通常生理食塩水 3 mL で目を洗います。
- 縫合するのに目を公開、滅菌穴あき外科ドレープの動物をカバーします。
- 世界中の眼球結膜に巾着縫合を実行します。ラットでは、織りの 7/0 の並列ナイロン縫合糸と 2 mm 後方に角膜 (図 1)。マウスで、角膜の後方 1 mm で 10/0 ナイロン縫合糸を配置しています。
- 強膜に浸透しないように注意してください。手術中に突然瞳孔の拡張では、強膜に侵入された可能性が高いことを示します。
- ラットでは, 5-6 アンカー ポイントとマウスの 4-5 アンカー ポイントを使用して結膜の縫合のアンカー。
- これらの静脈の交差点で結膜の下に縫合をスレッドによって主要な上強膜静脈に直接圧縮を避けます。
注: ラットにおける主要な上強膜静脈の圧縮を避けることをお勧めします、間ない日常的にこれはマウス マウスの目でこれらの静脈の低可視性のために。主要な静脈は直接圧縮されていない、にもかかわらずそれは小型船の上強膜静脈叢で、持続的な眼圧上昇する要因となる可能性があります圧力下でする可能性があります (眼圧上昇のメカニズムの議論を参照してください)。
- 後 2 番目の簡単なノット (図 1) に、スリップ ノットを結ぶことによって巾着縫合を締めます。過度に高いの手術後 IOP スパイクを避けるためには、すぐに 2 番目の結び目を固定する前に IOP を測定助手を持っています。
- IOP は高すぎることが判明、部分的に縫合 (図 1の矢印) の一方の端に緊張を解放によってスリップ ノットを調整します。
- 目的の IOP が達成された後 (ラットまたはマウスで 30-40 mmHg で理想的には 30 〜 60 mmHg) 縫合 (図 1の矢印) の最後に連続的な牽引力を維持しながら 2 つ目の結び目をネクタイ。
- 結び目が厳しく 2 番目の後、任意の異物感を最小限に抑えるため縫合糸の両端をトリミングします。全身麻酔からの回復の間に動物を監視します。
注: 目に十分な内方圧縮を確認するときに最初の結び目を結ぶスリップ ノットを使用することが重要です。数週間後に通常、両端になる結膜に埋め込まれている注意します。
4. 監視 IOP
- イソフルラン麻酔下で手術後 2 分で最初の眼圧測定を取る。齧歯類は前述の手順 1 および 2 に従って意識を取り戻したとき、その後、IOP を監視します。
注: は、最初の 1 週間で毎日、週に一度か二度あたり (2 分と 1 時間)、最初の日の間に二度 IOP を監視します。
5. 網膜の構造と機能の試金
- ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与を用いた全身麻酔下での (この場合は 8 週間ラットとマウスの 12 週間後) の目的実験終了点で説明されているようにバクテリオロドプシンの網膜電図 (ERG) と網膜の機能を測定します。他の場所でより詳細に15、16,17。
注: 我々 は堅牢な発見した神経節細胞の機能不全、網膜神経繊維層を薄く、神経節細胞の損失は 8-12 週の間の期間のため。他の人は正常に眼圧上昇14,15の長い期間を採用しています。 - ERG 測定後すぐに網膜神経線維層 (視神経) の厚さおよびスペクトル領域光コヒーレンス断層撮影 (SD 10 月) 16,18を使用して網膜の全体の厚さを測定します。
- 縦断的研究の終わりに、深い麻酔下の動物を安楽死します。
- 組織学は18、たとえば免疫 RNA 結合タンパク質など網膜神経節細胞 (RGC) の特異抗体を用いたスプライシング抗体 (RBPMS) 複数の脳固有ホメオ ボックス/POU ドメイン全体マウント網膜の網膜を解剖します。3 a タンパク質 (Brn3a)16,19,22。
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Representative Results
ラット18とマウス16次の結果以前に報告されている、ここでまとめます。Circumlimbal 縫合は、ラットおよびマウス (図 2) の眼圧上昇の同様のパターンを作り出した。簡単な IOP スパイク、ラットまで 58.1 ± 2.7 mmHg とマウスで 38.7 ± 2.2 mmHg は縫合処理の直後に発見されました。ラットでは、IOP の大きさは 44 ± 6 mmHg と 32 ± 2 mm Hg にそれぞれ153 24 時間に時間の経過と共に徐々 に減少。この初期の IOP スパイク後 IOP は数週間のため比較的安定している残った。実験期間中、眼高血圧 (エイチ) 目 IOP 残ったによる上昇 〜 によってラットでは, 8 週間の 9 mmHg 〜 12 週目に 5 mmHg。
RGC 関数を評価するために非常に薄暗い刺激エネルギーで幼魚 ERG 制御ラットおよびマウス (図 3) の両方の目を基準にして、OHT 目で減少することがわかった正幼魚しきい値応答 (pSTR) を誘発します。またあった小さく、ERG の a ・ b 波、それぞれ視細胞と双極細胞の軽度の機能障害を反映する可能性があります。しかし最大の赤字は、pSTR、軽度の慢性的な IOP 昇格後優遇内側の網膜機能不全の確認で発見されました。
内側の網膜機能障害と一致して、RGC 層細胞密度の選択的損失も OHT (図 4 a - 4 C) 網膜の断面で明白でした。対照的に、外側と内側の核層の細胞数に残った不変18ターゲットを虚血性効果が最小限に抑えていたことを示唆しています。ラットのような調査結果は、RGC 特異抗体と共焦点顕微鏡 (図 4E - 4 G) を使用して染色全体マウント マウス網膜のセル数によって確証されました。同様に、視神経の頭部のまわりの OCT スキャンを総網膜厚は両方の種は (図 4および4 H) に改ざんしながら慢性の眼圧上昇が視神経厚さが薄くで結果を示した。
図 1.目の赤道の周り Circumlimbal 縫合アプリケーション。A: まず、十分な内方圧縮は、1 つだけ文字列 (矢印) を引いて巾着縫合を締める、スリップ ノットを使用します。アシスタントは、すぐに 2 つ目の結び目を固定する前に IOP を測定できます。B: その後最初の結び目をロックする 2 番目単純な結び目を作る。C: マウスの目に circumlimbal 縫合の写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.Circumlimbal 縫合では眼圧をラットに 8 週間この場合に発生 (、n = 8) およびマウス 12 週間 (B、n = 23).IOP は対側制御の目に変わらずに残った。(個別 OHT 目赤い記号と制御の目で灰色の記号によって表される)。平均と標準偏差はブラックで重ね合わせます。データは、replotted 以前の作業16,18の許可を得て)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.慢性的な IOP 標高誘発ラット (A & B) と (C & D) マウスの両方の内側の網膜に特に機能赤字。A: 平均の ERG 波形 (n = 8 ラット) (2.07 と-5.31 cd.s.m-2トップのログおよびトレースをそれぞれ下) 明るく/暗く刺激への応答で眼圧上昇の 8 週間後。B: RGC 関数を示す指定 pSTR の相対振幅は photoreceptoral a 波よりもっと影響を受けると双極細胞駆動 b 波。CとDは、 AとBあたりが、眼圧上昇の 12 週間後 23 マウスのなかから派生しました。また、RGC 不全でした photoreceptoral と双極細胞機能障害よりも厳しかった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.エルグ: 網膜電図;エイチ: 眼圧。IOP: 眼圧。pSTR: 肯定的な幼魚閾値反応;RGC: 網膜神経節細胞;* P < 0.05。誤差範囲: 平均の標準誤差。データは前の仕事からの許可を再利用します。16,18この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Circumlimbal 縫合は、慢性的な高眼圧症の新しいモデルです。元代表の結果が供給された16,18の研究に加えて、最近研究15,23,24,25 の数のこの動物モデルを利用されています。 ,26。これらの以前のレポート間で比較メソッドがモデルの誘導中に眼圧上昇だけでなく、簡単な IOP スパイクの大きさをなど、再現性のある結果を生成することを示しています (後述を参照)。堅牢な RGC 変化を誘発するために必要な眼圧上昇の期間は 8 〜 12 週間の間は、モデルを維持できの長く、研究は眼圧上昇14,15の 15-16 週間の成果を報告します。再現性に加えてこのメソッドは比較的単純なコスト効果の高い、ラットとマウスの両方で使用できます。モデルの誘導で目を貫通を含む他の手法と比較すると、このモデルは、電気生理学や生体内で眼底イメージングなどの明確な光学メディアを必要とする調査に従う義務があります。この理由の 1 つは、穿刺を避けること、によって circumlimbal 縫合法目の免疫特権を維持し、外傷に関連する炎症や白内障を最小化を目指しています。その Iba 1 式を発見、この技術を用いた先行研究の炎症のためのマーカーないで亢進していた網膜15, しかし、他の炎症性マーカーや前房炎症の存在が定量化されていません。このモデルでは。別の利点は、抜糸は、軽い鎮静と局所麻酔14,15の下で行うことができます簡単な手順によって眼圧上昇を取り消すことができます。これは、circumlimbal 縫合緑内障24神経節細胞傷害の潜在的な可逆性を調査するためのユニークなモデルをレンダリングします。
縫合の手順が IOP を発生させますメカニズムは完全に理解されていない、房水の流出の閉塞原因いくつかの他の要因を除外した後です。前の調査から circumlimbal 縫合が大幅に15およびマウス16をラットと両方で前房深度または虹彩角度は変わりません、閉塞隅角緑内障のモデルではないことを示されています。さらに、瞳孔の拡張と瞳孔のサイズが変更されていない、光学メディアの透明度が維持された、房内 OCT を使用または網膜の断面をもつ、フランクの炎症性変化は認められなかった, 我々 は信じていないその眼圧標高は、炎症性のメカニズムによって発生します。最後に、IOP が circumlimbal 縫合糸を除去した後急速に正規化することができる私達の見つけることは、炎症の結果として小柱網の改造 IOP 昇格16,24の低い原因だろうと示唆しています。したがって、眼圧上昇が房水の流出障害、シュレムの運河を介して圧縮または上強膜静脈のいずれかから発生した可能性が高いです。さらに調査は進行中であるこのモデルによる房水の流出障害の正確な原因を特定します。
Circumlimbal 縫合には、いくつかの制限があります。1 つの明白な懸念は、数時間にわたって徐々 に減少の縫合の適用時に発生する初期の IOP スパイクです。確かに、過度の IOP スパイク慢性開放隅角緑内障の典型的ではない虚血再灌流傷害を誘発する可能性があります。この点で、ポスト外科的眼底検査や OCT 血管造影を用いた通常の網膜血流を確認することをお勧めします。
IOP スパイクの潜在的な貢献は、無処理目 2 日後削除する場合、上記で説明した方法に従って、縫合を行った偽の管理グループとを比較することによって最近対処されました。つまり、これらの偽の制御の目は同じ急性 IOP スパイクが 48 時間を超えて慢性の IOP 高度受けた。初期の IOP スパイクがこのモデルに見られる RGC 赤字で重要な役割を持っていなかったことを示す ERG、OCT を用いて、長期的な成果と RGC カウントまま未処理のコントロール16と比較すると、偽のコントロールで変更されていないことがわかった。慢性的な IOP 標高15と有意な相関があったに対し、これは眼圧 (エイチ) 目 IOP スパイクの大きさと長期的に RGC の機能不全間の相関がなかった事実によってサポートも。さらに、縫合が後 8 週間は、完全にその神経節細胞を示していますが削除された 1 つの研究回復モデル誘導に起因する簡単な IOP スパイクは、小さな貢献をして考えを支える pSTR24に、によって測定される、網膜機能不全は、慢性的な IOP 昇格後に発見されました。過渡の IOP スパイクされていた神経節細胞損傷に寄与する要因が、8 週で抜糸後ない回復が予想されます。したがって、過渡 IOP スパイクの制限があっても、眼圧の circumlimbal 縫合モデルは現在利用可能な小さな動物緑内障モデルに追加された便利です。
前述の証拠は、このモデルの有用性をサポートしています、あらゆる努力は過渡の IOP スパイクを最小限に抑えるためにしなければなりません。次は、モデルの誘導と助けるかもしれない。まず、最も一般的な問題が発生しましたは IOP が数日後縫合アプリケーション正常に戻ることができます。この圧力の正常化の原因は、縫合糸の結び目が時間をかけて徐々 に緩めることです。トラブルシューティングでは、最初 (slip) 結び目が 2 番目の結び目を結ぶ前にしっかりと固定されてを確認します。これは達成することができます継続的に 2 番目までスリップ ノット (図 1の矢印) の一方の端でのテンションを維持することによって結び目を結んだ。第 2 最も一般的な問題は、前房出血を縫合した後最初の数時間で起こることができます。我々 の経験でこれは、縫合糸を編むとき一般的過度に高い IOP スパイク (通常 ≥ 80 mmHg のラット及びマウス) や眼球の穿孔と関連付けられました。手順の他の合併症縫合スリッページやあるいは結膜の断裂により長期、短期的縫合の損失に白内障 (通常可逆的) 含めます。我々 はラットやマウスのすべてのコホートにおける眼表面感染の開発を記載しません。顕微鏡手術の初心者、いくつかの練習がマスター circumlimbal 縫合アプリケーションに必要です。我々 はマウス (40 のうち 81 マウス)16の私達の最初のコホートで初期の成功率は 50% を報告しています。我々 の経験で、これは練習で、70-80% に向上します。60 マウスのコホート研究においてその後、合計成功率 70%、前房出血 (13%) と 30% の故障率を占める縫合損失 (17%) を発見しました。20 ラットのコホート研究において、(10%)、前房出血のため除外されているのみ 2 匹のラットとマウスよりも高い成功率 (90%) を発見し、縫合の損失のために除外された動物がないです。手術中に穿孔は、ラットとマウスの両方のモデル (~ 1%) で稀です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は国立保健医療研究評議会オーストラリアのプロジェクト助成金 (1046203)、オーストラリアの研究評議会未来フェローシップ (FT130100338) によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal saline | Baxter International Inc | AHB1323 | Maintain corneal hydration during surgery |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | Disinfection of surgical instrument |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure |
| ocular lubricant | Alcon Laboratories | 1618611 | Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist |
| Needle holder (microsurgery) | World Precision Instruments | 555419NT | To hold needle during ocular surgery |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | Topical ocular analgesia |
| Scissors (microsurgery) | World Precision Instruments | 501232 | To cut excessive suture stump during ligation |
| Surgical drape | Vital Medical Supplies | GM29-612EE | Ensure sterile enviornment during surgery |
| Suture needle for rats (microsurgery) | Ninbo medical needles | 151109 | 8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm |
| Suture needle for mice (microsurgery) | Ninbo medical needles | 160905 | 10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm |
| Tweezers (microsurgery) | World Precision Instruments | 500342 | Manipulate tissues during ocular surgery |
| rebound tonometer | TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland | TV02 | for intraocular pressure monitoring |
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