Apparater for høsting vev Microcolumns

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å produsere høsting pinne som kan brukes til å samle full-tykkelse hud vev uten forårsaker donor området arrdannelse. Nålene kan kombineres med en enkel samling å oppnå høy-volum høsting.

Abstract

Dette manuskriptet beskriver prosessen for en laboratoriet apparater, laget av sokkel komponenter, som kan brukes til å samle microcolumns av full-tykkelse hud vev. Den lille størrelsen på microcolumns lar donor områder leges raskt uten å forårsake donor-område arr mens høsting full-tykkelse vev gjør inkorporering av alle mobilnettet og ekstracellulære komponenter av huden vev, inkludert de tilhørende med dypere dermal regioner og adnexal huden strukturer, som har ikke gjengis vellykket med konvensjonelle tissue engineering teknikker. Microcolumns kan brukes direkte i huden sår å øke healing, eller de kan brukes som autolog cellen/vev kilde til andre vev engineering tilnærminger. Høsting nålene er laget ved å endre standard sprøyte nåler, og de kan brukes alene for høsting små mengder vev eller kombinert med en enkel inntaks-baserte systemer (også laget av vanlig laboratoriet forsyninger) for høyt volum høsting for å lette studier i store dyr modeller.

Introduction

Autologous skin pode er bærebjelke i såret reparasjon, men det er begrenset av donor området knapphet og sykelighet, fører til felles innsats i de siste tiårene å utvikle nye behandlingsalternativer erstatte konvensjonelle skin pode^1,2 . Vi har nylig utviklet en alternativ metode for høsting huden til å utnytte fordelene med full-tykkelse skin pode samtidig som donor-område sykelighet. Ved å samle full-tykkelse huden i form av små (~0.5 mm diameter) "microcolumns", donor områdene er i stand til å helbrede raskt og uten arrdannelse under normale omstendigheter (se diskusjon nedenfor for mulige unntak,)³. Microcolumns kan brukes direkte i såret senger å akselerere såret nedleggelse, redusere sammentrekning³, og gjenopprette et variert utvalg av epidermal og dermal celletyper og funksjonelle adnexal strukturer⁴, hvorav mange er mangler i konvensjonelle split-tykkelse skin pode eller gjeldende bioengineered huden erstatter⁵. Muligheten for microcolumns å øke healing og deres donor steder å leges uten arrdannelse er begge blitt uavhengig godkjent av andre forskning grupper^6,7.

Vi har tidligere utviklet et laboratorium høsting system for å aktivere samlingen av microcolumns på skala⁸; men er dette systemet sammensatt av mange tilpassede komponenter som ikke er allment tilgjengelig. Her beskrive vi i detalj prosessen for produsere høsting nåler, samt enkel innsamlingssystemer, laget av det meste sokkel komponenter, som kan brukes til å oppnå høy-volum høsting. Apparatet beskrevet i dette manuskriptet er egnet for i vitro og dyr arbeid, men ikke for bruk i mennesker. En klinisk enhet med FDA klaring for å bruke denne teknikken på mennesker er kommersielt tilgjengelig, men vil ikke bli diskutert i detalj her.

Protocol

Alt arbeid med levende dyr og dyr vevsprøver er godkjent av Massachusetts generelle sykehus institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. produksjon av høsting nåler

1. Oppsett av produksjonen
   1. Sikre en kvinnelig luer lås kobling på et innlegg, og montere innlegget på en rotasjon slik at luer-lock er i sentrum av scenen (figur 1A).
   2. Plasser dette første rotasjon trinnet vertikalt, og montere den vinkelrett på en andre, horisontal rotasjon (figur 1B).
   3. Montere horisontal rotasjon scenen på en to-akse oversettelse (figur 1B).
   4. Fest kombinasjonen på en stabil overflate, for eksempel en optisk brødfjel.
   5. Separat montere en roterende verktøy på den samme brødfjel, med verktøyet plassert parallelt med brødfjel og omtrent samme høyde som luer lås koblingen på rotasjon/oversettelse kombinasjon scenen (figur 1C).
   6. Installere to cut-off hjul concentrically til roterende verktøyet (en mindre, lavere grus diamant cut-off hjul over et større, høyere grus stein cut-off hjul) (figur 1D).
      Merk: Om en 9 mm forskjellen mellom diameter av to hjul er vanligvis tilstrekkelig.
   7. Plasser en overhead lys kilde med en justerbar arm over verktøyet roterende med lys rettet mot klipping hjulene.
   8. For å forsterke visualisering, plasser dissecting mikroskop over produksjon oppsettet slik at i okularet er fokusert på kutte plater (figur 1C).
      Merk: Alternativt kan brukere bruke forstørrelsesglass briller.
2. Omforme pinne-spissen
   1. Bruk vernebriller og en kirurgiske maske for å hindre at fine metall partikler å øyne eller airways.
   2. Velg sprøyte nåler av riktige måle størrelsen, basert på eksperimentell krav.
   3. Merk av for hvor lenge hver høsting strikkes.
      Merk: For høsting av svin hud, 8 mm nålene er vanligvis nok; Selv om lengden kan variere basert på eksperimentell behov (f.eks., tykkelsen på huden vevet, måle p). Generelt, en 19-gauge nål fungerer bra for svin huden.
   4. Lavere nålen vinkelrett til roterende verktøyet med makt, med kanten av ytre kutte platen til klipp av overflødig lengden av nålen, på punktet markert i trinn 1.2.3.
   5. Koble forkortet, sløv nålen til kvinnelige luer lås på produksjonen.
   6. Juster horisontal rotasjon scenen slik at nålen er i 12° vinkel parallelt kutte plater på roterende verktøyet (endre vinkelen vil påvirke kraften som er nødvendig mot).
   7. Slå på overhead lys og justere plasseringen mens observere nålen under forstørrelse til lyset reflekteres av midtlinjen (Langside) nålen.
   8. Slå på den roterende verktøy, så bruk oversettelse scenen å fremme nålen mot den indre (diamant) kutte platen (figur 2A).
   9. Holde fremme nålen sakte mot kutte platen til kutte platen når ca midtlinjen nåløyet (som visualisert av overhead lyset refleksjon langs midtlinjen).
   10. Sakte flytte kuttet nål overflaten fra indre diamant hjulet på det ytre stein hjulet til slutt kuttet nål overflaten med en finere polsk (figur 2B).
   11. Trekke nålen fra kutte platen.
   12. Bruke loddrett rotasjon scenen, rotere nålen 180°.
   13. Gjenta trinn 1.2.9-1.2.10 for å endre den andre siden av nålen.
       Merk: Nålen skal nå ha to kutte tips omtrent like lange (figur 2C og 2D).
   14. Fjern nålen fra produksjonen.
   15. Rengjør innsiden kjede med en metalltråd som er litt mindre enn nålens indre diameter.
   16. Bruke en skarp trestav (f.eks., ved å klikke på slutten av små tre pinne på en bomull tips applikator), fjerne eventuelle grader som fortsatt kan festes til kantene av nydannede nålen.
       Merk: Høsting nåler kan være electropolished og steriliseres ved autoklav om nødvendig.

2. huden vev høsting

1. Bruk høsting nålene for å samle huden microcolumns ex vivo vev eller levende dyr.
2. For ex vivo hud vev er tynn (spesielt fra eksempler der subkutant fett mangler eller ble trimmet bort), som holder vevet over åpningen av en 50 mL sentrifuge tube, eller stable to typer vev oppå hverandre, for å unngå å skade n eedle tips ved å treffe dem mot harde flater.
   Merk: For høsting fra levende dyr i vivo , anbefales det at lokale lidocaine og adrenalin administreres av intradermal injeksjon for analgesi og redusere blødning.
3. Samle høsting apparatet etter mengden microcolumns nødvendig, som beskrevet nedenfor.
4. Lav-middels volum alternativ:
   1. For å høste små til middels mengder microcolumns, Fyll en standard sprøyte (10-20 mL sprøyter vanligvis fungerer bra) med vanlig saltvann og koble den til en høsting nål.
   2. Helt høsting nålen inn donor huden, så trekke det.
   3. Trykke stempelet på sprøyten for å tømme saltvann gjennom høsting nålen og utvise microcolumn som sitter fast i p bar.
   4. For å fremskynde høstingen prosessen, gjentar du trinn 2.4.2 3 til 5 ganger før utvise microcolumns i trinn 2.4.3.
      Merk: Det er vanligvis nyttig å utvise microcolumns i en standard celle sil å lette den påfølgende samlingen av microcolumns.
   5. Hvis nåler bli tett, øke presset på stempelet utvise fast vev og fjerne tresko. Hvis bare økende press er utilstrekkelig, bar sett inn en metalltråd gjennom nål tips åpningen fjerne tresko i nålen.
   6. Holde microcolumns neddykket i saltvann eller middels til bruk for å hindre uttørking.
      Merk: Med en erfaren operatør, metoden beskrevet over kan brukes å høste microcolumns med en hastighet på ca 1 microcolumn per sekund.
5. Høyt volum alternativ:
   1. Opprette en enkel suging-assistert enhet som kan konstrueres for å lette innsamling av store mengder microcolumns.
      Merk: Enheten består av en høsting nål, 20 mL sprøyte med luer lås dyse, suge kortet brukes vanligvis for fettsuging (Figur 3A), og sterile sugekraft canister.
   2. Fjern stempelet fra 20 mL sprøyte.
   3. Koble sprøyten til et inntaks-kort.
   4. Fyll samlingen ved å feste en høsting nålen på sprøyten (Figur 3B).
   5. Bruke et sterilt inntaks rør koble sugekraft kortet til en steril sugekraft canister. Kontroller at høsting apparatet er koblet til en canister-inngang som gjør at væske til å flyte i beholderen uhindret (som krever tilkobling til en canister-port som er merket for strøm i stedet for tilsig).
   6. Koble apparatet til en negative trykket kilde.
      Merk: Trykket kreves avhenger på nål diameter og lengde, som beskrevet tidligere⁸. For apparatet beskrevet i dette manuskriptet, er suge systemet i typisk operasjonssaler vanligvis tilstrekkelig.
   7. Koble en høsting nål til sprøyten.
   8. Harvest på microcolumns ved å sette inn høsting nålen inn i huden.
      Merk: Microcolumns vil bli trukket inn i sprøyten ved å suge, så skylles inn sugekraft canister.
   9. Midlertidig dyppe høsting nålen i en beholder med bakteriefri saline under høsting prosedyren å tømme systemet.
      Merk: Denne saltvann flush muliggjør transport av microcolumn og sikrer de bo hydrated. Alternativt kan en MFF luer adapter kobles til luer-lock av, og gjennom en forbindelsesslangen, også til en hengende saltvann drypp bag.
   10. Holde i hånden en metalltråd eller mindre måle p, som er litt mindre enn høsting nålens indre diameter. Hvis nålen blir tilstoppet, kan det fjernes ved å stikke metalltråd inn nålen bar.
   11. Når ønsket antall microcolumns har akkumulert i canister, koble enheten fra sug, så helle innholdet i den sugekraft canister ut gjennom et filter for å samle microcolumns.
6. Etter høsting, bruke en aktuell antibiotika sårsalve over webområdene donor.
   Merk: Ekstra dressinger er vanligvis ikke nødvendig for donor steder.

Representative Results

Høsting pinnene skal kunne samle microcolumns av full-tykkelse huden vev med ca en 80-90% suksessrate, og hvert microcolumn bør inneholde dermis og epidermis, og noen subkutant fett (Figur 4). Hvis suksessrate på høsting er lav, eller hvis det blir vanskelig å sette inn en nål i vev, er deretter en ny nål sannsynlig nødvendig. Hvis suksessraten for høsting er gjennomgående lav, selv med nye nåler, da er nålene sannsynligvis for kort.

Hvis brukes i vivo, bør donor områder leges raskt, som re epithelialization oppstår vanligvis innen noen dager³. Microcolumns kan brukes til direkte for å sår senger å utvide sårheling^3,4, eller de kan kombineres med ulike matrix materialer å produsere kombinasjon konstruksjoner. Microcolumns kan også vedlikeholdes i kultur for i vitro studier⁹.

Figur 1 : P gjør apparatet. (A) en mannlige luer-lock kontakt sikret via et montering innlegg på en loddrett plassert rotasjon, slik at luer-lock er i sentrum av scenen. (B) loddrett rotasjon scenen er montert vinkelrett på en andre, horisontal rotasjon (svart pil). Horisontal rotasjon scenen er sikret en to-akse oversettelse scenen (hvit pil). (C) Positioning av verktøyet roterende parallelt brødfjel (hvit pil), og dissecting mikroskopet over p-making apparatet (rød pil). (D) konsentriske cut-off hjul montert på roterende verktøy, med diamant hjul på innsiden (svart pil) og stein på utsiden (hvit pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Etter klipping nålen til ønsket lengde, roterende verktøyet brukes til å slipe nye nål tips. (A) først diamant cut-off hjulet til å "grove" kutt å danne nye kutte tips og overflater. (B) etter at de nye kutte tipsene er dannet med diamant hjulet, flyttes nålen til stein hjulet fine polering. (C) ferdig høsting p sett fra fronten og (D) fra siden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Samlingen for høyt volum høsting. (A) enkeltkomponenter i samlingen, inkludert (venstre) sugekraft adapter, 20 mL sprøyter med luer-lock munnstykke og høsting nål. (B) vist er fullført forsamlingen, klar til å koble til negative trykket kilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Representant huden microcolumns høstet bruke apparatet beskrevet i dette manuskriptet. Hver microcolumn inneholder overhuden (1), full dermis (2) og noen subkutant fett (3). Merkene i figuren representerer 1 mm. Dette tallet er endret fra Tam et al. ⁴ i samsvar med tilsvarende creative commons license. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Metodene som er beskrevet her er ment å aktiverer innsamling av vev microcolumns i tilstrekkelig antall for i vivo store dyrestudier, bruker verktøy laget av kommersielt tilgjengelig laboratorium forsyninger. Dette apparatet er brukt tidligere i høsting vev fra forbrukeravgift menneskehud^4,9 , samt live svin huden³. De spesifikke parameterne beskrevet er de som ble funnet for å være mest egnet for bruk i svin. Det forventes at samme apparatet kan endres og tilpasset for å samle vev fra gnagere og andre små dyr, men dette har ikke blitt testet i vårt laboratorium.

Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere høsting nålene er lang nok (ineffektiv høsting skyldes vanligvis nåler er for kort), holder microcolumns senkes ned i væske gjennom høstingen prosessen å hindre uttørking og rødme systemet med saltvann minst midlertidig (ellers er det en høyere sannsynlighet for microcolumns tilstopping nål bar). Den største begrensningen for denne teknikken er hastighet; for eksempel i vår demonstrasjon kan inntaks-assistert apparater vanligvis høste 120 mg av vev per minutt, som er tilstrekkelig for mindre sår størrelser brukes vanligvis i forbindelse med dyreforsøk. Det ville sikkert være logistisk utfordrende å bruke denne løsningen for stor sår (f.eks., i store brenne skade modeller). Nål måling er en annen begrensning - jo mindre nålen måle mer utsatt til knekking, som er den viktigste feilmodus av denne teknikken (derimot teknikken er relativt ufølsom til p sløver under prosedyren). For svin hud bruker vi vanligvis 19-gauge nåler, som er mekanisk robuste nok at de sjelden spenne. Videre hvert dyr eksperiment (vanligvis involverer om 3,000-5,000 microcolumns) krever bare 2 til 3 pinner. 25-gauge er den minste p vi har brukt med denne teknikken.

Muligheten for små hudpleie sår å stimulere vev gjenfødelse er underliggende prinsippet bak kliniske prosedyrer som delvis laser resurfacing¹² og microneedling¹³. Disse behandlingene er kjent for å forbedre kosmetisk utseendet på photoaged hud, og mer nylig vist å indusere arr remodeling og forbedre funksjonen og cosmesis av huden arr^14,15. Det omfattende kliniske erfaring med disse teknikkene også gir ytterligere validering som huden kan leges uten arrdannelse etter disse microinjuries i de aller fleste tilfeller med visse unntak (delvis laser resurfacing angivelig har en 3.8% forekomsten av arr, nesten alltid som følge av infeksjon¹⁶, fremheve betydningen av etter fremgangsmåter for hudpleie). Dessuten, kan folk med en historie med keloids eller hypertrophic arr være utsatt for arrdannelse selv med disse mindre skader; Dermed kan behandlinger som involverer produksjonen av microinjuries være counterindicated.

Mens våre tidligere undersøkelser har fokusert på direkte bruke microcolumns i huden sår å forbedre healing, muligheten til å samle betydelige mengder vev uten å forårsake andre kan langsiktige donor nettstedet morbidities (arr, contracture, etc.) være nyttig for et bredt spekter av andre programmer. Huden microcolumns kan tjene som vev kilden for tilnærminger kultur utvidelse eller avstandtagen og spredning av autologous hud celler¹⁰. Videre microcolumns gir ekstra fordeler å minimere donor området sykelighet og inkludert dermal celletyper, for eksempel de som er knyttet til adnexal strukturer og ulike stem/stamfar celle populasjoner i dypere deler av den dermis¹¹ (som ikke er tilgjengelig med konvensjonelle metoder som bruker split-tykkelse huden som utgangsmaterialet). Autologous microcolumns kan også brukes i ex vivo analyser for å studere vev respons på ulike stimuli som narkotika eller kosmetiske produkter som, i motsetning til konvensjonelle celle kultur-baserte analyser, mobilnettet og ekstracellulære strukturer i hver microcolumn vedlikeholdes i deres respektive naturlig organisasjon formater. Mer generelt kan microcolumn høsting tilnærming også være bredt aktuelt å gi autologous celler og vev for ulike vev engineering/regenerativ medisin formål (for huden og andre organer), som underliggende prinsippet om små donor sår gjennomgår komplett og scarless healing er trolig bli generalizable til andre vev-typer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diamond wheel	Dremel	545
Hypodermic needle (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Other needle sizes could be used, depending on experimental needs
Stone wheel	Dremel	540
Syringe (20mL with luer lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Suction adapter	Tulip Medical	PA20BD	Optional, for high volume harvesting
Suction canister	Fisher Scientific	19-898-212	Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use.
Suction tubing	Medline	DYND50216H	Optional, for high volume harvesting