Summary
Aqui descrevemos um protocolo para a produção de colheita agulhas que podem ser usadas para coletar tecido cheio-espessura da pele sem causar o doador do site cicatrizes. As agulhas podem ser combinadas com um sistema de coleta simples para atingir alto volume de colheita.
Abstract
Este manuscrito descreve o processo de produção para um aparelho de laboratório, feito de componentes de prateleira, que podem ser usados para coletar a microcolumns dos tecidos da pele de espessura total. O tamanho pequeno da microcolumns permite aos doadores sites curar rapidamente sem causar local doador, cicatrizes, durante a colheita de tecidos da cheio-espessura permite a incorporação de todos os componentes celulares e extracelulares dos tecidos da pele, incluindo aqueles associados com regiões dérmicas profundas e as estruturas dos anexos da pele, que ainda precisa com sucesso ser reproduzido usando tecido convencional, técnicas de engenharia. O microcolumns pode ser aplicado diretamente em feridas de pele para aumentar a cura, ou podem ser usados como fonte de células/tecidos autólogos para outras abordagens de engenharia de tecidos. As agulhas de colheita são feitas, modificando o padrão de agulhas hipodérmicas, e podem ser usados sozinho para colheita de pequenas quantidades de tecido ou juntamente com um sistema simples baseado em sucção coleção (também feito de material de laboratório comumente disponíveis) para alto volume da colheita para facilitar os estudos em modelos animais grandes.
Introduction
Enxerto de pele autólogo é o esteio de reparação da ferida, mas é limitada pela escassez de sítio doador e morbidade, levando a esforços concertados nas últimas décadas para desenvolver novas opções terapêuticas para substituir o enxerto de pele convencional1,2 . Recentemente desenvolvemos um método alternativo de colheita da pele para aproveitar os benefícios do enxerto de pele de espessura total, minimizando a morbidade do sítio doador. Através da recolha de pele de espessura total na forma de pequenas (~0.5 mm de diâmetro) "microcolumns", locais de doadores são capazes de curar rapidamente e sem cicatrizes em circunstâncias normais (para possíveis exceções, consulte a seção de discussão abaixo)3. Microcolumns pode ser aplicado diretamente na ferida camas para acelerar o fechamento da ferida, reduzir a contração3e restaurar uma variada gama de tipos de células epidérmicas e dérmicas e estruturas funcionais dos anexos4, muitas das quais são carentes de enxerto de pele de espessura dividida convencional ou de substitutos de pele de bioengenharia atual5. A capacidade de microcolumns para aumentar a cura e de seus sites de doador para curar sem cicatriz ambos independentemente validados por outros grupos de pesquisa6,7.
Anteriormente, nós desenvolvemos um sistema de abate de laboratório para permitir que a coleção de microcolumns na escala8; no entanto, este sistema é composto de muitos componentes personalizados que não estão amplamente disponíveis. Aqui, descrevemos em detalhe o processo para produzir colheita agulhas, bem como sistemas de simples coleta, feita a partir principalmente componentes prontos para uso, que podem ser usados para atingir alto volume de colheita. Os aparelhos descritos neste manuscrito é apropriado para in vitro e em animal trabalho, mas não para uso em seres humanos. Um dispositivo clínico com autorização da FDA para a aplicação desta técnica em seres humanos é comercialmente disponível, mas não será discutido em detalhe aqui.
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Protocol
Todo o trabalho envolvendo animais vivos e amostras de tecido animal foram aprovadas pelo Comitê de uso (IACUC) e Massachusetts General Hospital institucional Cuidado Animal.
1. produção de colheita agulhas
- Instalação da fase de produção
- Fixar um conector luer fêmea bloqueio de um post e montar o post para um palco de rotação, de modo que o conector luer-lock é o centro do palco (Figura 1A).
- Nesta primeira fase de rotação uma posição verticalmente e montá-lo perpendicularmente sobre um palco de rotação horizontal, segunda (Figura 1B).
- Monte o palco de rotação horizontal sobre um estágio da tradução de dois eixos (Figura 1B).
- Aperte a combinação em uma superfície estável, como uma experimentação ótica.
- Separadamente, monte uma ferramenta rotativa para a mesma tábua de pão, com a ferramenta posicionada em paralelo com a experimentação e a aproximadamente a mesma altura que o conector de bloqueio luer na fase de combinação de rotação e tradução (Figura 1C).
- Instalar dois discos de corte concêntrica para a ferramenta rotativa (um grão menor, menor corte diamantado sobre um disco de corte de pedra de grão maior, maior) (Figura 1D).
Nota: Sobre uma 9 mm a diferença entre os diâmetros das duas rodas é geralmente suficiente. - Posição de uma luz a sobrecarga da fonte com um braço ajustável sobre a ferramenta rotativa, com a luz que visam as rodas de corte.
- Para melhorar a visualização, posicione um microscópio dissecação sobre a instalação de produção para que o ocular está focada sobre os discos de corte (Figura 1C).
Nota: Como alternativa, os usuários podem usar óculos de ampliação.
- Remodelando a ponta da agulha
- Use óculos de proteção e uma máscara cirúrgica para impedir que partículas finas de metal entre os olhos ou vias respiratórias.
- Escolha de agulhas hipodérmicas do apropriado medir o tamanho, com base nos requisitos experimentais.
- Marque o comprimento pretendido em cada colheita de agulha.
Nota: Para a colheita de pele suína, agulhas de 8 mm são normalmente suficientes; embora, o comprimento pode variar com base nas necessidades experimentais (EG., espessura do tecido-alvo da pele, tamanho do calibre de agulha). Geralmente, uma agulha de calibre 19 funciona bem para a pele de porco. - Abaixe a agulha perpendicularmente à ferramenta rotativa com o poder, usando a borda do disco externo de corte para cortar o excesso de comprimento da agulha, no ponto marcado no passo 1.2.3.
- Conecte a agulha romba, encurtada ao conector luer fêmea de bloqueio na fase de produção.
- Ajuste a fase de rotação horizontal, para que a agulha está em um ângulo de 12° paralelo para os discos de corte da ferramenta rotativa (mudando o ângulo impactará a força necessária para a inserção da agulha).
- Ligue a luz aérea e ajustar sua posição enquanto observa a agulha sob a ampliação, até que a luz é refletida fora da linha mediana (longitudinal) da agulha.
- Poder da ferramenta rotativa e, em seguida, uso o estágio da tradução para fazer avançar a agulha para o interior (diamante) corte disco(Figura 2).
- Continue avançando a agulha lentamente contra o disco de corte até que o disco de corte atinge aproximadamente a linha média da agulha (como visualizada pela reflexão da luz aérea ao longo da linha mediana).
- Mova lentamente a superfície de corte da agulha do disco de diamante interior sobre a roda exterior de pedra para terminar a superfície de corte da agulha com um esmalte mais fina (Figura 2B).
- Retire a agulha longe o disco de corte.
- Usando a fase de rotação vertical, gire a agulha de 180°.
- Repita as etapas 1.2.9-1.2.10 para reformatar o outro lado da agulha.
Nota: A agulha deve ter agora duas dicas de corte de comprimento aproximadamente igual (Figura 2 e 2D). - Remova a agulha da fase de produção.
- Limpo dentro do furo com um fio de metal que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha.
- Usando uma vara de madeira afiada (ex., encaixando a extremidade da vara de madeira pequena em um aplicador de ponta de algodão), remova quaisquer rebarbas que podem ainda ser anexadas às bordas da agulha recém formado.
Nota: Colheita de agulhas pode ser eletropolido e esterilizados em autoclave, se necessário.
2. colheita de tecido da pele
- Use as agulhas de colheita para coletar microcolumns pele de tecido ex vivo ou animais vivos.
- Para pele ex vivo , tecido que é fino (especialmente a partir de amostras onde a gordura subcutânea está faltando ou foi aparada fora), segure o tecido-alvo sobre a abertura de um tubo de centrífuga de 50 mL, ou empilhar dois pedaços de tecido em cima do outro, para não danificar o n Dicas de eedle batendo neles contra superfícies duras.
Nota: No vivo colhendo de animais vivos, é recomendável que a epinefrina e lidocaína local ser administrado por injeção intradérmica para analgesia e reduzir o sangramento. - Monte o aparelho de colheita de acordo com a quantidade de microcolumns necessária, conforme descrito abaixo.
- Opção de baixa e média de volume:
- Para colher pequenas a médias quantidades de microcolumns, basta encher uma seringa padrão (10-20 mL seringas geralmente funcionam bem) com solução salina normal e conectá-lo a uma agulha de colheita.
- Completamente, insira a agulha de colheita na pele do doador, em seguida, recolhê-la.
- Empurre o êmbolo da seringa para liberar solução salina através da agulha de colheita e expulsar o microcolumn que está alojado no furo da agulha.
- Para acelerar o processo de colheita, repita a etapa 2.4.2 3 a 5 vezes antes de expulsar o microcolumns no passo 2.4.3.
Nota: É conveniente geralmente expulsar o microcolumns em um coador de célula padrão para facilitar a coleção subsequente de microcolumns. - Se as agulhas ficarem entupidas, aumente a pressão sobre o pistão para expelir o tecido furado e remover a obstrução. Se simplesmente aumentando a pressão é insuficiente, inserir um fio de metal através da abertura de ponta de agulha para a desobstruir a agulha do furo.
- Manter o microcolumns submergida em salina ou médio até o uso para evitar a dessecação.
Nota: Com um operador experiente, o método descrito acima pode ser usado para colher microcolumns a uma taxa de aproximadamente 1 microcolumn por segundo.
- Opção de alto volume:
- Crie um dispositivo de sucção assistida simples que pode ser construído para facilitar a recolha de grandes quantidades de microcolumns.
Nota: O dispositivo consiste de uma agulha de colheita, seringa de 20 mL com bico de fechamento de luer, sucção adaptador normalmente usado para lipoaspiração(Figura 3)e o tubo de aspiração estéril. - Remova o êmbolo da seringa de 20 mL.
- Ligue a seringa a um adaptador de aspiração.
- Complete a montagem, anexando uma colheita agulha à seringa (Figura 3B).
- Use um pedaço de tubo de aspiração estéril para conectar o adaptador de aspiração para uma vasilha de aspiração estéril. Certifique-se de que aparato colheita está ligado a uma entrada de caixa que permite que o fluido a fluir para o cilindro desimpedido (que pode exigir a conexão a uma porta da vasilha que está marcada para a saída, ao invés de afluência).
- Ligue o aparelho a uma fonte de pressão negativa.
Nota: A pressão exigida depende de agulha de diâmetro e comprimento, como descrito anteriormente8. Para os aparelhos descritos neste manuscrito, o sistema de sucção encontrado em salas de operação típicas é geralmente suficiente. - Conecte uma colheita agulha à seringa.
- Colheita da microcolumns, inserindo a colheita da agulha na pele.
Nota: O microcolumns estará desenhado para a seringa de sucção, então liberado no tubo sucção. - Intermitentemente, mergulhe a colheita agulha em um recipiente de solução salina estéril durante o procedimento de colheita para lavar o sistema.
Nota: Esta salina facilita transporte da microcolumn e garante que eles manter-se hidratado. Alternativamente, um adaptador luer de QFP pode ser conectado ao conector luer lock da seringa e através de uma tubulação de conexão, também para um saco de soro de enforcamento. - Tenha à mão um fio de metal, ou menor medidor de agulha, que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha a colheita. Se a agulha ficar entupida, ela pode ser desmarcada inserindo o arame no furo da agulha.
- Quando a quantidade desejada de microcolumns acumuladas na vasilha, desligue o dispositivo de sucção, em seguida, despeje o conteúdo do tubo sucção para fora através de um filtro para recolher os microcolumns.
- Crie um dispositivo de sucção assistida simples que pode ser construído para facilitar a recolha de grandes quantidades de microcolumns.
- Após a colheita, aplica uma pomada antibiótica sobre os sites de doador.
Nota: Curativos adicionais geralmente não são necessários para sites de doador.
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Representative Results
As agulhas de colheita devem ser capazes de coletar microcolumns cheio-espessura dos tecidos da pele com aproximadamente uma taxa de sucesso de 80-90%, e cada microcolumn deve conter a epiderme, derme e alguma gordura subcutânea (Figura 4). Se a taxa de sucesso de colheita é baixa, ou se torna-se difícil inserir uma agulha no tecido, em seguida, uma agulha nova provavelmente é necessária. Se a taxa de sucesso para a colheita é consistentemente baixa, mesmo com agulhas de novas, então as agulhas são provavelmente muito curtas.
Se usado na vivo, sites de doador devem curar rapidamente, como re-epitelização normalmente ocorre dentro de alguns dias3. Microcolumns pode ser aplicado diretamente para ferir camas para aumentar3,4de cicatrização de feridas, ou eles podem ser combinados com materiais de diferente matriz para produzir construções de combinação. Microcolumns também podem ser mantidas em cultura por em vitro estudos9.
Figura 1 : Agulha fazendo aparelhos. (A) um conector luer macho conector de bloqueio garantido através de um post de montagem para um palco de rotação colocado verticalmente, para que o conector luer-lock é o centro do palco. (B) a fase de rotação vertical é montada perpendicularmente sobre um palco de rotação horizontal, segundo (seta preta). A fase de rotação horizontal é fixada um estágio da tradução de dois eixos (seta branca). (C) posicionamento da ferramenta rotativa paralela para a experimentação (seta branca) e o microscópio dissecação sobre o aparelho de fabricação de agulha (seta vermelha). (D) discos de corte concêntrico montagem na ferramenta rotativa, com um disco de diamante no interior (seta preta) e roda de pedra do lado de fora (seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Depois de cortar a agulha para o comprimento desejado, a ferramenta rotativa é usada para moer novas dicas de agulha. (A) primeiro, o disco de corte de diamante é usado para fazer cortes "duro" para formar as novas dicas de corte e superfícies. (B) após as novas dicas de corte são formadas com o disco de diamante, a agulha é movida para a roda de pedra para polimento fino. (C) acabou a colheita agulha vista de frente e (D) de lado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Assembly para colheita de alto volume. (A) individuais componentes da Assembleia, incluindo (esquerda para a direita) o adaptador de aspiração, seringa de 20 mL com bico de fechamento de luer e agulha de colheita. (B) mostrado é a montagem concluída, pronta para se conectar à fonte de pressão negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Microcolumns pele representativa colhida usando os aparelhos descritos neste manuscrito. Cada microcolumn contém (1) epiderme, derme completa (2) e alguma gordura subcutânea (3). Marcas de verificação na figura representam 1 mm. Esta figura foi modificada em Tam et al. 4 de acordo com os termos da licença creative commons correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos descritos aqui destinam-se para permitir que a coleção de tecido microcolumns em quantidades suficientes na vivo grandes estudos em animais, usando ferramentas feitas de suprimentos de laboratório disponíveis comercialmente. Este aparelho tem sido usado anteriormente na colheita do tecido da pele humana extirpado4,9 , bem como de pele suína ao vivo3. Os parâmetros específicos descritos são aqueles que foram encontrados para ser mais adequado para uso em suínos. Espera-se que o mesmo aparelho pode ser modificado e adaptado para a coleta de tecido de roedores e outros animais pequenos, mas isso não foi testado em nosso laboratório.
Passos críticos neste protocolo incluem assegurar que as colheita agulhas são de comprimento suficiente (colheita ineficiente é geralmente devido a agulhas sendo muito curta), manter o microcolumns submersa no líquido durante todo o processo de colheita para evitar dessecação e liberando o sistema com soro fisiológico pelo menos intermitentemente (caso contrário há uma probabilidade mais elevada de microcolumns entupimento do furo da agulha). A principal limitação dessa técnica é a velocidade; por exemplo, na nossa demonstração, o aparelho de sucção assistida pode colher geralmente 120 mg de tecido por minuto, o que é suficiente para tamanhos menores de ferida tipicamente usados em experimentos com animais. Provavelmente seria logisticamente desafiadora para usar essa abordagem para feridas muito grandes (ex., em grandes modelos de lesão de queimar). Calibre da agulha é outra limitação - quanto menor a agulha calibre, mais suscetíveis à flambagem, que é o modo de falha principal desta técnica (em contraste, a técnica é relativamente insensível para entorpecer durante o procedimento de agulha). Para a pele suína, que normalmente usamos agulhas de tamanho 19, que são mecanicamente robustas o suficiente para que eles raramente fivela. Além disso, cada experimento animal (normalmente envolvendo sobre 3.000-5.000 microcolumns) geralmente requer apenas 2 ou 3 agulhas. 25 gauge é o menor tamanho de agulha que usamos com esta técnica.
A capacidade de feridas cutâneas pequenas para estimular a regeneração dos tecidos é o princípio subjacente por trás de procedimentos clínicos, tais como laser fracionado resurfacing12 e microneedling13. Estes tratamentos são conhecidos para melhorar a aparência estética da pele photoaged e mais recentemente, mostrados para induzir a remodelação da cicatriz e melhorar a função e estética da pele cicatrizes14,15. A extensa experiência clínica com estas técnicas também fornece mais de validação que pele é capaz de curar sem cicatriz após estes microinjuries na maioria dos casos, com algumas excepções (resurfacing com laser fracionado supostamente tem uma incidência de 3,8% de cicatrizes, quase sempre como resultado de infecção16, destacando a importância do cuidado da pele pós-processual). Além disso, pessoas com histórico de queloides ou cicatrizes hipertróficas podem ser suscetíveis a cicatriz mesmo com estas lesões menores; assim, os tratamentos que envolvem a produção de microinjuries podem ser counterindicated.
Enquanto nossas investigações anteriores concentraram-se na aplicação diretamente microcolumns em feridas de pele para melhorar a cicatrização, a capacidade de coletar uma quantidade significativa de tecido sem causar outros podem, a longo prazo morbidades de sítio doador (cicatrizes, contratura, etc.) ser útil para uma ampla gama de outras aplicações. Microcolumns de pele pode servir como fonte de tecido para abordagens que envolvem a expansão da cultura ou dissociação e dispersão de células de pele autóloga10. Além disso, microcolumns fornecem os benefícios adicionais de minimizar a morbidade do sítio doador e incluindo os tipos de células dérmicas, tais como aqueles associados com estruturas anexial e as várias populações de células tronco/progenitoras que residem nas partes mais profundas da derme11 (que não estão disponíveis com os métodos convencionais que utilizam pele de espessura dividida como matérias-primas). Microcolumns autólogo pode também ser utilizado em ensaios de ex vivo para estudar a resposta do tecido à vários estímulos, tais como drogas ou produtos cosméticos em que, ao contrário de convencional de célula ensaios baseados em cultura, as estruturas celulares e extracelulares em cada microcolumn são mantidos em seus formatos respectivos organização natural. Mais geralmente, o microcolumn colheita abordagem pode também ser amplamente aplicável para fornecer células autólogas e tecidos para diversos fins de medicina regenerativa/engenharia de tecido (para a pele e outros órgãos), como o princípio subjacente de pequenos doadores passando por completo e scarless cicatrização de feridas é susceptíveis de ser generalizados para outros tipos de tecido.
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Disclosures
Os autores são co-inventores em patentes relacionadas com a tecnologia descrita neste artigo, do qual receberam licenciamento e receitas de royalties através da sua instituição, o Hospital Geral de Massachusetts. J. Tam também consulta para Medline Industries, Inc., que detém a licença comercial para esta tecnologia.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo exército, Marinha, NIH, força aérea, VA e assuntos de saúde para apoiar o esforço de contacto II, sob o n. º prêmio W81XWH-13-2-0054. Os E.U. Exército médico aquisição actividade de investigação, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 é o escritório de aquisição de premiação e administração. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são aqueles do autor e não são necessariamente endossadas pelo departamento de defesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
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