Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la production de la récolte du site aiguilles qui peuvent servir à recueillir des tissus de la peau pleine épaisseur sans causer de donateurs cicatrices. Les aiguilles peuvent être combinés avec un système de collecte simple pour atteindre de gros volumes de récolte.
Abstract
Ce manuscrit décrit le processus de production pour un appareil de laboratoire, fabriqué à partir de composants sur étagère, qui peuvent être utilisés pour recueillir des microcolumns du tissu cutané de pleine épaisseur. La petite taille de le microcolumns permet aux donateurs sites guérir rapidement sans provoquer de donneuse, cicatrices, alors que la récolte pleine épaisseur tissulaire permet l’incorporation de tous les composants cellulaires et extracellulaires du tissu cutané, y compris ceux liée avec les régions cutanées plus profondes et les structures cutanées annexielle, qui doivent encore être reproduit avec succès en utilisant des tissus classiques, techniques d’ingénierie. Le microcolumns peut être appliqué directement sur les plaies de la peau pour augmenter la guérison, ou ils utilisable comme source de cellules/tissus autologues pour autres approches d’ingénierie tissulaire. Les aiguilles de récolte sont faites en modifiant les aiguilles hypodermiques standards et ils peuvent être utilisés seuls pour la récolte de petites quantités de tissu ou couplés à un système de collection axée sur l’aspiration simple (également fait partir de fournitures de laboratoire couramment disponibles) pour grand volume de récolte pour faciliter les études sur des modèles animaux grands.
Introduction
Une greffe de peau autologue est le pilier de cicatrisation, mais il est limité par la rareté du site donneur et de la morbidité, conduisant à des efforts concertés au cours des dernières décennies pour développer de nouvelles options thérapeutiques pour remplacer une greffe de peau classique1,2 . Nous avons récemment mis au point une autre méthode de récolte de la peau afin de valoriser les avantages d’une greffe de peau pleine épaisseur tout en réduisant la morbidité du site donneur. En recueillant la pleine épaisseur peau sous la forme de petites (~0.5 mm de diamètre) « microcolumns », les sites donneurs sont en mesure de guérir rapidement et sans laisser de cicatrices dans des circonstances normales (pour les exceptions possibles, voir la section débat ci-dessous)3. Microcolumns peut être appliqué directement sur la plaie lits pour accélérer la fermeture de la plaie, réduire la contraction3et de restaurer une gamme variée de types de cellules épidermiques et dermiques et des structures fonctionnelles annexielle4, dont la plupart ne manquent pas dans une greffe de peau split-épaisseur classique ou actuelle bioengineered peau substituts5. La capacité de microcolumns pour augmenter la guérison et de leurs sites donneurs pour guérir sans laisser de cicatrices ont tous deux été indépendamment validés par d’autres groupes de recherche6,7.
Nous avons déjà développé un système de récolte de laboratoire pour permettre le regroupement des microcolumns à échelle8; Cependant, ce système est composé de nombreux composants personnalisés qui ne sont pas largement disponibles. Ici, nous décrivons en détail le processus car produisant récolte des aiguilles, ainsi que des systèmes de collecte simple, issus pour la plupart des composants sur étagère, qui peuvent être utilisés pour réaliser de grands volumes de récolte. L’appareil décrit dans ce manuscrit est adapté pour in vitro et travail animale, mais pas pour une utilisation chez l’homme. Un appareil clinique avec autorisation de la FDA pour l’application de cette technique chez l’homme est disponible dans le commerce mais n’est pas abordé en détail ici.
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Protocol
Tous les travaux impliquant des animaux vivants et des échantillons de tissus d’origine animale ont été approuvés par le Massachusetts général hôpital institutionnels et animalier utilisation Comité (IACUC).
1. production de la récolte des aiguilles
- Programme d’installation de la phase de production
- Fixez un connecteur luer lock femelle sur un poste et monter le post sur une platine de rotation jusqu'à ce que le raccord luer lock au centre de la scène (Figure 1A).
- Positionner cette première étape de rotation verticale et montez-la perpendiculairement sur une étape de la deuxième rotation horizontale (Figure 1B).
- Monter la platine de rotation horizontale sur une scène de la traduction de deux axes (Figure 1B).
- Fixer la combinaison sur une surface stable, comme une carte de test optique.
- Séparément, monter un outil rotatif sur la même maquette, avec l’outil positionné en parallèle avec la maquette et à environ la même hauteur que le raccord luer lock sur la scène de combinaison de rotation/translation (Figure 1C).
- Installer deux disques à tronçonner concentriquement sur l’outil rotatif (un grain plus petit, plus faible diamant disque à tronçonner sur un disque à tronçonner Pierre grain plus gros, plus haut) (Figure 1D).
Remarque : Sur un 9 mm, différence entre les diamètres des deux roues est généralement suffisant. - Position une imposte d’origine avec un bras réglable l’outil rotatif, avec la lumière qui vise les molettes.
- Pour améliorer la visualisation, placez un microscope à dissection sur le paramétrage de la production pour que l’oculaire se concentre sur les plaques de coupe (Figure 1C).
NOTE : Alternativement, utilisateurs peuvent porter lunettes loupe.
- Remodelage de la pointe de l’aiguille
- Portez des lunettes de protection et un masque chirurgical évitant de fines particules métalliques dans les yeux ou des voies respiratoires.
- Choisissez des aiguilles hypodermiques de la jauge de grosseur, basé sur les conditions expérimentales.
- Marquez la longueur prévue sur chaque aiguille récolte.
Remarque : Pour la récolte de peau de porc, les aiguilles de 8 mm sont généralement suffisantes ; Bien que, la durée peut varier en fonction des besoins expérimentaux (e.g., épaisseur des tissus de la peau cible, calibre de l’aiguille). Généralement, une aiguille de calibre 19 fonctionne bien pour la peau de porc. - Abaisser l’aiguille perpendiculairement à l’outil rotatif sous tension, à l’aide du bord du disque à découper extérieure à couper l’excédent de longueur de l’aiguille, au point marqué à l’étape 1.2.3.
- Connectez l’aiguille raccourcie et arrondi pour le connecteur luer lock femelle sur le stade de la production.
- Ajuster l’étape de rotation horizontale pour que l’aiguille soit à un angle de 12° parallèle pour les plaques de coupe sur l’outil rotatif (en changeant l’angle affectera la force nécessaire à l’insertion de l’aiguille).
- Allumez l’imposte et ajuster sa position tout en observant l’aiguille sous grossissement, jusqu'à ce que la lumière est réfléchie de la ligne médiane (dans la longueur) de l’aiguille.
- Mettez l’outil rotatif, puis utilisez l’étape de traduction pour faire avancer l’aiguille vers l’intérieur (diamant) coupe disque (Figure 2A).
- Garder, avançant l’aiguille doucement contre le disque de coupe jusqu'à ce que le disque a TRONCONNER atteigne environ la ligne médiane de l’aiguille (comme visualisées par réflexion de la lumière zénithale le long de la ligne médiane).
- Déplacez lentement la surface coupée de l’aiguille de la roue intérieure de diamant sur la roue extérieure de pierre à aiguille coupe la surface avec un vernis plus fin (Figure 2B).
- Retirer l’aiguille du disque à découper.
- L’étape de rotation verticale, faire tourner l’aiguille de 180°.
- Répétez les étapes 1.2.9-1.2.10 pour remodeler l’autre côté de l’aiguille.
Remarque : L’aiguille doit maintenant avoir deux pointes de longueur approximativement égale (Figure 2 et 2D). - Retirez l’aiguille du stade de la production.
- Nettoyer l’intérieur ennuyer avec un fil métallique qui est légèrement plus petit que le diamètre intérieur de l’aiguille.
- À l’aide d’un bâton de bois pointu (e.g., en brisant la fin du petit bâton en bois sur un coton-tige), éliminer les bavures qui peuvent être encore attachés aux bords de l’aiguille nouvellement formé.
NOTE : Les aiguilles de récolte peut être électropoli et stérilisé par autoclave, si nécessaire.
2. récolte de tissus de peau
- Utiliser les aiguilles de récolte pour recueillir des microcolumns de peau de ex vivo des tissus ou des animaux vivants.
- Pour ex vivo peau tissulaire qui est mince (surtout des échantillons où la graisse sous-cutanée est manquant ou a été réglée de suite), placez le tissu cible sur l’ouverture d’un tube à centrifuger 50 mL ou empiler deux morceaux de tissu sur le dessus de l’autre, pour éviter d’endommager le n eedle conseils en les frappant contre des surfaces dures.
Remarque : En vivo récolte d’animaux vivants, il est recommandé que l’épinéphrine et lidocaïne locale administré par injection intradermique d’analgésie et de réduire les saignements. - Assembler le dispositif récolte selon la quantité de microcolumns nécessaire, tel que décrit ci-dessous.
- Option de volume faible-moyen :
- Pour récolter des petites et moyennes quantités de microcolumns, il suffit de remplir une seringue standard (10 à 20 mL seringues fonctionnent généralement bien) avec un soluté physiologique et branchez-le à une aiguille de récolte.
- Complètement Insérez l’aiguille récolte dans la peau du donneur, puis se rétracter.
- Pousser sur le piston de la seringue pour vider une solution saline à travers l’aiguille récolte et expulser la microcolonne qui se loge dans le trou de l’aiguille.
- Pour accélérer le processus de récolte, répétez l’étape 2.4.2 3 à 5 fois avant d’expulser le microcolumns à l’étape 2.4.3.
Remarque : Il est souvent commode d’expulser le microcolumns dans une crépine de cellule standard pour faciliter la collecte ultérieure des microcolumns. - Si les aiguilles sont encrassés, augmenter la pression sur le piston d’expulser le tissu collé et de retirer le sabot. Si tout simplement une pression croissante est insuffisante, insérer un fil métallique à travers l’ouverture de pointe de l’aiguille pour effacer le sabot dans l’aiguille alésage.
- Garder la microcolumns immergé dans salin ou moyenne avant utilisation pour éviter la dessiccation.
Remarque : Avec un opérateur expérimenté, la méthode décrite ci-dessus peut servir à récolter des microcolumns à un taux d’environ 1 microcolonne par seconde.
- Option gros volumes :
- Créer un simple dispositif d’aspiration assistée qui peut être construits pour faciliter la collecte de grandes quantités de microcolumns.
Remarque : Le dispositif se compose d’une récolte aiguille, seringue de 20 mL avec embout de luer lock, adaptateur d’aspiration généralement utilisé pour la liposuccion (Figure 3A) et le flacon d’aspiration stérile. - Retirer le piston de la seringue de 20 mL.
- Connecter la seringue à l’adaptateur d’aspiration.
- Terminer l’assemblage en attachant une récolte aiguille sur la seringue (Figure 3B).
- Utilisez un morceau de tuyau d’aspiration stérile pour brancher l’adaptateur d’aspiration sur un flacon d’aspiration stérile. Assurez-vous que l’appareil de récolte est connecté à une entrée de boîte métallique qui permet au liquide de s’écouler dans le bac sans entrave (qui peut nécessitent une connexion à un port cartouche est marqué pour la sortie plutôt que d’apport).
- Connectez l’appareil à une source de pression négative.
Remarque : La pression nécessaire dépend à l’aiguille diamètre et longueur, comme décrit précédemment8. Pour l’appareil décrit dans ce manuscrit, le système d’aspiration dans les salles d’opération typiques est généralement suffisant. - Connecter une récolte aiguille sur la seringue.
- Récolter le microcolumns en insérant la récolte de l’aiguille dans la peau.
Remarque : Le microcolumns sera aspiré la seringue par aspiration, puis déversés dans la cuve d’aspiration. - Par intermittence, trempez l’aiguille récolte dans un récipient de sérum physiologique stérile pendant la procédure de récolte pour purger le système.
Remarque : Cette chasse d’eau saline facilite le transport de la microcolonne et veille à ce qu’ils vous hydrater. Par ailleurs, un adaptateur luer de CFP raccordable au raccord luer lock de la seringue et à travers un tube de connexion, également à un sac de goutte à goutte saline de pendaison. - Garder sous la main un fil métallique ou aiguille, qui est légèrement plus petit que le diamètre intérieur de l’aiguille de la récolte de calibre plus petit. Si l’aiguille est bouché, il peut être effacée en insérant le fil métallique dans le trou de l’aiguille.
- Lorsque la quantité désirée de microcolumns ont accumulé dans la cuve, débranchez l’appareil de succion, puis versez le contenu de la cuve d’aspiration dehors à travers un filtre pour recueillir les microcolumns.
- Créer un simple dispositif d’aspiration assistée qui peut être construits pour faciliter la collecte de grandes quantités de microcolumns.
- Après la récolte, appliquer un onguent antibiotique topique sur les sites donneurs.
NOTE : Pansements supplémentaires ne sont généralement pas nécessaires pour les sites donneurs.
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Representative Results
Les aiguilles récolte devraient être en mesure de recueillir des microcolumns des tissus de la peau pleine épaisseur avec environ un taux de réussite de 80 à 90 %, et chaque microcolonne devrait contenir, épiderme, derme et quelques graisse sous-cutanée (Figure 4). Si le taux de réussite de la récolte est faible, ou s’il devient difficile d’insérer une aiguille dans le tissu, puis une nouvelle aiguille est probablement nécessaire. Si le taux de réussite pour la récolte est toujours faible, même avec les nouvelles aiguilles, les aiguilles sont probablement trop courts.
Si utilisé en vivo, sites donneurs devraient guérir rapidement, comme ré-épithélialisation survient généralement dans les quelques jours3. Microcolumns peut être appliqué directement pour blesser les lits afin d’augmenter la cicatrisation3,4, ou ils peuvent être combinés avec les matériaux de matrice différente pour obtenir des constructions de la combinaison. Microcolumns peut également être maintenues en culture in vitro études9.
Figure 1 : Aiguille appareil générant. (A) un connecteur de verrouillage luer mâle sécurisé par un pieu sur une platine de rotation placé verticalement, pour que le raccord luer lock est au centre de la scène. (B) l’étape de rotation verticale est monté verticalement sur une scène de la deuxième rotation horizontale (flèche noire). L’étape de rotation horizontale est attachée à une étape de la traduction de deux axes (flèche blanche). (C) positionnement de l’outil rotatif parallèle à la maquette (flèche blanche) et le microscope à dissection sur l’appareil de fabrication de l’aiguille (flèche rouge). (D) disques à tronçonner concentriques monté sur un outil rotatif, avec une meule diamantée à l’intérieur (flèche noire) et Pierre roue à l’extérieur (flèche blanche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Après avoir coupé l’aiguille jusqu'à la longueur désirée, l’outil rotatif est utilisé pour moudre les nouvelles astuces d’aiguille. (A) tout d’abord, la meule diamant est utilisée pour faire des coupes « rugueux » pour former les nouvelles pointes et les surfaces. (B) après que les nouvelles pointes sont forment avec la meule diamantée, l’aiguille est placé dans la meule de pierre à polir fine. (C) terminé aiguille vu de l’avant et (D) du côté de la récolte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’Assemblée pour la récolte de gros volumes. (A) différents composants de l’Assemblée, notamment (de gauche à droite) l’adaptateur d’aspiration, la seringue de 20 mL avec embout de luer lock et l’aiguille de la récolte. (B) montré est assemblé, prêt à vous connecter à la source de pression négative. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Peau représentant microcolumns récolté à l’aide de l’appareil décrit dans ce manuscrit. Chaque microcolonne contient l’épiderme (1), derme complet (2) et certains graisse sous-cutanée (3). Coches la figure représentent 1 mm. Ce chiffre a été modifié par Tam et al. 4 conformément aux termes de la licence creative commons correspondante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les méthodes décrites ici sont destinées à permettre le regroupement des tissus microcolumns en quantité suffisante pour en vivo grandes études animales, utilisant des outils faits de fournitures de laboratoire disponibles dans le commerce. Cet appareil a été utilisé précédemment dans la récolte de tissus excisés de peau humaine4,9 , mais aussi de peau de porcs sur pied3. Les paramètres spécifiques décrits sont ceux qui se sont révélés plus adapté pour une utilisation chez le porc. Il est prévu que le même appareillage peut être modifié et adapté pour le ramassage des tissus de rongeurs et autres petits animaux, mais cela n’a pas été testée dans notre laboratoire.
Des étapes cruciales dans ce protocole comprennent assurant que les récolte les aiguilles sont d’une longueur suffisante (récolte inefficace est généralement due à des aiguilles étant trop court), gardant la microcolumns submergés dans un liquide pendant tout le processus de récolte pour éviter la dessiccation et purger le système avec une solution saline au moins par intermittence (sinon il y a une probabilité plus élevée de microcolumns Boucher le trou de l’aiguille). La principale limite de cette technique est la vitesse ; par exemple, dans notre démonstration, l’appareil d’aspiration assistée peut récolter généralement 120 mg de tissu par minute, ce qui est suffisant pour les plus petites tailles de plaie généralement utilisés dans l’expérimentation animale. Il serait probablement logistiquement difficile d’utiliser cette approche pour les très grandes plaies (e.g., en major font des modèles de lésion). Mesure d’aiguille est une autre limite - le plus petit l’aiguille jauge, plus sensibles au flambement, ce qui est le mode de défaillance principale de cette technique (en revanche, la technique est relativement insensible aux aiguilles dépolir au cours de la procédure). Pour les peaux de porcs, nous utilisons normalement des aiguilles de calibre 19, qui sont mécaniquement robustes assez qu’ils ont rarement la boucle. En outre, chaque expérimentation animale (impliquant généralement sur 3 000-5 000 microcolumns) exige habituellement que 2 ou 3 aiguilles. calibre 25 est la plus petite taille de l’aiguille, nous avons utilisé avec cette technique.
La capacité des plaies cutanées petits pour stimuler la régénération des tissus est le principe sous-jacent derrière des procédures cliniques comme le laser fractionnel resurfaçage12 et microneedling13. Ces traitements sont connus pour améliorer l’aspect cosmétique de la peau de la technologie et plus récemment, montrés pour induire la retouche de la cicatrice et améliorer la fonction et l’esthétique de la peau cicatrices14,15. La vaste expérience clinique avec ces techniques fournit également plus validation que la peau est capable de guérir sans laisser de cicatrices après ces microinjuries dans la grande majorité des cas, avec certaines exceptions (resurfaçage au laser fractionnel a aurait été un 3,8 % d’incidence de cicatrices, presque toujours à la suite de l’infection16, soulignant l’importance des soins de la peau après procédure). En outre, les personnes ayant des antécédents de chéloïdes ou de cicatrices hypertrophiques peuvent être sensibles à cicatrices même avec ces petites blessures ; ainsi, les traitements impliquant la production de microinjuries peuvent être counterindicated.
Alors que nos enquêtes précédentes ont mis l’accent sur l’application directement microcolumns dans les plaies cutanées afin d’améliorer la guérison, la capacité de recueillir des quantités importantes de tissus sans causer d’autres à long terme morbidités du site donneur (cicatrices, contracture, etc.) peuvent être utile pour un large éventail d’autres applications. Peau microcolumns peut être la source de tissu d’approches impliquant l’expansion de la culture ou de dissociation et de dispersion des cellules de peau autologue10. En outre, microcolumns fournir les avantages supplémentaires de réduire au minimum la morbidité du site donneur et y compris les types de cellules dermiques, tels que ceux associés à structures annexielles et les diverses populations de cellules souches/progénitrices qui résident dans les parties plus profondes de la derme11 (qui ne sont pas disponibles avec les méthodes classiques qui utilisent des split-épaisseur peau comme produit de départ). Microcolumns autologue peut également être utilisé lors d’essais de ex vivo pour étudier la réponse tissulaire à divers stimuli tels que les médicaments ou produits cosmétiques où, contrairement aux classiques de cellules tests fondés sur la culture, les structures cellulaires et extracellulaires dans chacun microcolonne sont maintenues dans leurs formats respectifs organisation naturelle. Plus généralement, la microcolonne récolte approche peut également être largement applicable à fournir des cellules autologues et les tissus à des fins de médecine régénératrice/génie tissulaire diverses (pour la peau et d’autres organes), le principe sous-jacent de petits donateurs blessures en cours de guérison complète et minimalement sont susceptibles d’être généralisables à d’autres types de tissus.
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Disclosures
Les auteurs sont des coïnventeurs sur les brevets concernant la technologie décrite dans cet article, de qui ils ont reçu un octroi de licences et les redevances auprès de leur institution, Massachusetts General Hospital. J. Tam consulte également de Medline Industries, Inc., qui détient la licence commerciale pour cette technologie.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par l’armée, marine, NIH, armée de l’Air, VA et Health Affairs pour soutenir l’effort de l’AFIRM II, sous le no Award. W81XWH-13-2-0054. L’activité médicale Acquisition de recherche de l’armée d’États-Unis, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 est le Bureau d’acquisition attribution et l’administration. Opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la défense.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
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