Summary
我们描述了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq) 的分步协议, 该协议可分析细胞类型特异性基因组蛋白的全组蛋白修饰。
Abstract
表观遗传调控在基因表达中起着核心作用。自20世纪60年代发现组蛋白修饰以来, 其生理和病理功能得到了广泛的研究。事实上, 下一代深度测序和染色质免疫沉淀 (chip) 通过特异性组蛋白修饰抗体的出现, 已经彻底改变了我们对整个基因组表观遗传调控的看法。相反, 组织通常由不同的细胞类型组成, 其复杂的混合物对研究特定细胞类型的表观基因组提出了分析挑战。为了以全基因组的方式解决细胞类型特异性染色质状态, 我们最近开发了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq), 它是基于从细胞标记的核心组蛋白纯化染色质的选择类型的兴趣, 其次是 chip-seq。该协议的目标是引入 tchip-seq 的最佳实践。该技术为组织特异性表观基因组研究提供了一种通用工具, 用于不同组蛋白修饰和模型生物的研究。
Introduction
动物的组织由不同的细胞类型组成。每个细胞的基因调控定义了细胞类型。染色质修饰-dna 甲基化和组蛋白修饰-是基因表达的细胞类型特异性的基础。因此, 每种细胞类型的表观遗传调控的测量都是人们所希望的, 但这一直是一个技术挑战。
为了研究特定细胞类型的表观遗传学, 最近开发了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq)( 图 1)1。在 tchip 中, 表位标记的核心组蛋白 h2b 是从细胞类型特异性启动子中表达的。此功能允许从感兴趣的细胞中分离色谱素, 尽管这种材料从各种细胞类型的混合物开始。在 chip-seq--通过修饰组蛋白标记和下一代分离 dna 深度测序进行纯化之后, 我们可以以全基因组的方式监测目标细胞类型的表观遗传状态。
利用这项技术, 我们最近研究了在赖氨酸 4 (h3k4me3) 标记组蛋白 h3 蛋白的神经元特异性三甲基化。在这项研究中, 我们开发了一个敲门砖, 其中 c 端结标记的 h2b 蛋白表达后, cre-acid 介导重组 (rosa26cag 浮法 h2b-flag)。在 camk2a 启动子的控制下, 利用具有 cre-内质网 (er) 基因的小鼠杂交, 得到的小鼠线在他莫西芬注射液 (camk2ah2b-flag)1 后诱导活性神经元 h22-flag。从已建立的小鼠线的大脑开始, 我们用抗 h3k4me3 抗体进行了 tchip-seq。由于 h3k4me3 标记通常对应于启动子区域, 我们可以发现在神经元1中特别表达的数百个 mrna。
在这里, 我们描述了一个典型的 tchip-seq 方法, 它涵盖了从组织解剖到库构造的步骤(图 1)。本协议的最终目标是分享我们在 tchip-seq 性能方面的最佳实践, 以及此方法今后在其他单元格类型和组蛋白修饰中的应用。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得 riken (h27-ep071) 安全部门的批准, 并遵循相关的准则和法规。
1. 组织解剖
- 使用精细的弹簧剪刀将感兴趣的组织分解成小块 (约 lt;3 毫米2)。
注意: 较大的组织碎片需要更长的时间来冻结, 较小的碎片将携带较大体积的缓冲液, 这两者都可能影响结果。 - 将解剖的组织碎片加入一个充满液氮的清洁容器中, 收集到2毫升充满液氮的管 (每管1片) 中。
注: 此步骤建议使用具有亲水表面的管材。 - 将管置于-80°c > 5分钟, 盖打开以蒸发剩余的液氮。
注意: 关闭瓶盖后, 组织碎片可在-80°c 下储存一个月后再使用。
2. 细胞固定
注意: 我们在此步骤中使用了方便的低温磨床。可以使用另一种设备。
- 将含有组织样本的 2个 ml 蛋白低结合管放在用液氮冷却的金属冰架上。
- 将金属子弹放入 1.5 ml 管中, 用液氮冷却。把它放在金属冰架上。
- 打开 2 ml 管, 将预冷的金属子弹放入管中。合上瓶盖, 将 2个 ml 管放入方便的低温磨床的管座上, 并立即将组装好的管架浸入液氮中1分钟。
- 将冷冻管支架插入方便的低温磨床的外盒盒, 并用力摇晃 60次, 共30秒。
- 拆卸管支架, 取出金属子弹, 并将 2 ml 管放在样品冷却器上, 在-20°c 预冷。
- 将样品冷却器置于-20°c 15分钟, 以防止在下一步冻结固定剂。
- 将样品冷却器放到工作台上, 打开管子的盖子, 并立即将900μl 的1% 甲醛滴入其中。移液多次后, 将悬浮液转移到含有 900μl 1% 甲醛的新的 2 ml 管中, 并在23°c 的孵化器中轻轻旋转10分钟。
注意: 甲醛是有毒和有害的。 - 为了停止固定反应, 在4°c 的 3, 000 x g 的情况下, 在每个管和离心机中加入100μl 的 2.5 m 甘氨酸5分钟。放弃上清液。
- 加入1毫升冰凉磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 在4°c 下, 在 3, 000 x 克的温度下离心 5分钟, 并丢弃上清液。重复此步骤两次 (共3次清洗)。
注: 固定样品可通过液氮冷冻, 并储存在-80°c。 - 加入500μl 裂解缓冲液 1 (50 mm 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪磺酸 (hepes)-koh (ph 7.5), 140 mm 氯化萘、1 mm 乙二胺四乙酸 (edta) (ph 值 8.0)、10% w/v 甘油、0.5% w\ v np-40、0.25% w\ v triton x-100 和0.1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒) 到颗粒, 管道几次, 并旋转10分钟在4°c。
注: 在使用前, 应将裂解缓冲区1过滤并存放在4°c。 - 在4°c 下, 在 3, 000 x 克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
- 在颗粒、涡流和0.1 蛋白酶抑制剂中加入1毫升裂解缓冲区 2 (10 mm Tris-HCl (ph 8.0)、200 mm nocl、1 mm edta (ph 8.0)、0.5 mm egta 和0.1x 蛋白酶抑制剂), 并在4°c 下旋转10分钟。
注: 在使用前, 应将裂解缓冲区2过滤并存放在4°c。 - 在4°c 下, 在 3, 000 x 克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
- 加入800μl 的放射免疫沉淀测定 (ripa) 缓冲液, 并在颗粒上添加1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 然后通过移液重新悬浮颗粒。
- 在4°c 下, 在 3, 000 x 克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
- 加入500μl 的 ripa 缓冲液与1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
- 在4°c 下, 在 3, 000 x 克离心 5分钟, 并丢弃上清液。
- 加入1毫升的 ripa 缓冲液与1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒。立即继续下一步。
3. 染色质剪切
- 将裂解液转移到超声管, 然后将管放在超声检查器上。
- 用以下设置剪切染色质: 温度: 4°c;峰值入射功率: 175 w;占空比: 10%;旋流: 200;和时间: 2400秒。
- 将样品转移到 1.5 ml 蛋白低结合管和离心机 5分钟, 在 20, 000 x 克的4°c 下。
- 将上清液收集到一种新的蛋白质低结合管中。
注: 样品可在液氮中冷冻, 并储存在-80°c。
4. dna 质量检查 (反向交联)
- 混合20μl 的裂解液和180μl 的 chip 洗脱缓冲液 (10 mm tris-hcl (ph 值 8.0), 聚合酶链反应 (pcr) 管中 300 mm 氯化钠、5 mm edta (ph 8.0) 和 1% w% wv 十二烷基硫酸钠 (sds)。在热循环器中, 在高温循环器中将样品在65°c 下培养 6小时, 并打开热循环器盖。保持热循环器盖打开, 以避免过度变性。
注意: chip 洗脱缓冲器在使用前应在室温下进行过滤和储存。这种孵化可以延长到夜间。 - 加入1μl 的 10mgml rnase a, 涡流, 并在37°c 孵育30分钟。
- 加入6.5μl 的 15 mgml 蛋白酶 k, 涡旋, 并在55°c 孵育60分钟。
- 将反应转移到 dna 低结合管中, 加入4μl 的 5 mgl 糖原和涡旋。然后, 在 18, 000 x 克的室温下加入200μl 的酚氯甲醇 (25:24/1) 和离心机5分钟。
- 将上清液转移到新的 dna 低结合管。在室温下, 在 18, 000 克的情况下, 将 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液 (10 mm tris-hcl (ph 8.0)、1 mm edta (ph 8.0) 和 200 mm ncl) 加入剩余的 cool/clusfap9/isoaml 醇溶液和离心机5分钟。收集上清液, 与第一剂混合。
- 加入900μl 的冰凉乙醇, 在-20°c 孵育1小时。
注意: 此孵育可延长至4-6小时。 - 在 18, 000 x g 的4°c 下离心30分钟。
- 放弃上清液。在颗粒和离心机中加入1毫升冰凉75% 乙醇, 在 18, 000 x 克的4°c 下, 在30分钟内加入。重复此步骤 (总共两次清洗)。
- 在室温下彻底丢弃上清液, 风干1分钟。
- 加入50μl 的 tris-edta (te) 缓冲液, 并在室温下孵育30分钟或在4°c 过夜, 溶解 dna。避免涡流或移液。保留此 dna 作为 "输入", 并在必要时将其用于库准备。
- 根据制造商的指令 (见材料表 ) 用荧光计测量 dna 浓度, 并用微流控电泳机检查大小分布 (见图所示的代表性数据) 2a). 使用10纳克或更少的 dna 进行此检测。
注: 100–500碱基对 (bp) 的片段应占 dna 的50% 或更多。
5. 抗 flag 抗体的亲和力纯化
注: 对于神经元 tchip-seq, 来自8只小鼠的脑组织通常用于一个 tchip-seq 样本, 通过串联免疫净化制备 2 ng 纯化 dna (见步骤 7.1)。在我们手中, 0.1 纳克的 dna 仍然为 chip-seq 提供了高质量的 dna 库 (卡多塔, 未出版)。因此, 从理论上讲, 一只老鼠可能足以执行神经元 tchip-seq。所需的数量应针对感兴趣的组织和细胞类型进行优化。为了对免疫净化实验进行负控制, 应制备和使用无 h2b-flag 表达的小鼠脑组织裂解物。
- 将磁珠与绵羊抗小鼠免疫球蛋白 g (igg) 结合成蛋白质低结合管的移液器200μl。
- 将管子放在磁性支架上, 等待 1分钟, 上清液才会变得清晰。丢弃上清液, 加入1毫升的冰凉 pbs, 并与涡旋。重复此步骤 (总共两次清洗)。
- 加入20μl 的 1 mgml 抗 flag 抗体, 在4°c 下旋转5小时。
注意: 此孵化可以延长到隔夜。 - 按照步骤5.2 清洗珠子。将珠子放入15毫升的管中。
- 在1110μl 的 ripa 缓冲液中重新注入珠子, 然后加入900μl 的10倍阻止试剂, 180μl 50x denhardt 的溶液, 10μl 的100x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 并在步骤3中制备的6.8ml 裂解液。将这种混合物分成5个蛋白质低结合管。在4°c 下旋转6小时。
注意: 此孵化可以延长到隔夜。 - 将管子放在磁性支架上, 等待 1分钟, 上清液才会变得清晰。丢弃上清液, 加入1毫升的 ripa 缓冲液, 然后轻轻混合。重复此步骤 5次 (共6次清洗)。将所有的珠子放入一个单一的蛋白质低结合管中。
- 加入200μl 的 chip 洗脱缓冲器, 并在室温下旋转15分钟。如步骤4.11 中所述, 检查 dna 的质量 (参见图2b 和 c 中显示的代表性数据)。立即继续下一步。
6. 抗 h3k4me3 抗体和反向交联的亲和纯化
注意: 以下珠子准备步骤 (6.1–6.4) 应在步骤5.7 之前执行。
- 将40μl 磁珠结合到羊抗小鼠 igg 中, 形成 2 ml 蛋白低结合管。
- 将管子放在磁性支架上, 等待 1分钟, 上清液才会变得清晰。丢弃上清液, 加入1毫升冰凉 pbs, 轻轻混合。重复此步骤 (总共两次清洗)。
- 加入4μl 的 1 mgml 抗 h3k4me3 抗体, 在4°c 下旋转6小时。
- 按照步骤6.2 清洗珠子。将珠子放入 2 ml 蛋白低结合管中。
- 在1558μl 的 ripa 缓冲液中重新拔粒珠子, 然后添加200μl 的10倍阻断试剂, 40μl 50x denhardt 的溶液, 2μl 的100x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 并在步骤5.7 中制备的200μl 洗脱液。在4°c 下连夜旋转。
注: chip 洗脱缓冲液中的 sds 在此孵育过程中被稀释了10倍以上。 - 将管子放在磁性支架上, 等待 1分钟, 上清液才会变得清晰。丢弃上清液, 加入1毫升的 ripa 缓冲液, 然后轻轻混合。重复此步骤 4次 (共5次清洗)。最后清洗后, 将珠子转移到 dna 低结合管中, 并丢弃上清液。
- 加入200μl 的 chip 洗脱缓冲器, 并在室温下旋转15分钟。将洗脱液转移到一个新的 dna 低绑定管。
注意: 洗脱液可储存在-80°c。 - 按照步骤4进行 dna 的解链。在20μl 的 te 缓冲液中重新纯化纯化 dna。
- 如步骤4.11 中所述, 检查 dna 的质量 (参见图2d 中所示的代表性数据)。(可选)如前面所述, 通过定量 pcr 进行富集分析。应观察10倍或更大的浓缩。
7. 图书馆建设
- 对于每个输入和 chip dna 样本, 使用微流控电泳软件的涂片分析功能计算100–800-bp 区域中 dna 的比例。估计获得 200–500 bp dna 的2纳克所需的样本量。使用200–500-bp 范围内的20纳克 dna 作为 "输入" 样本。
- 移液器 dna 样品进入8带 pcr 管, 并添加h2o, 使总体积达到 10μl (可选) 如果 dna 体积超过 10μl, 按比例扩大以下端修复反应和尺寸选择。
- 准备最终维修主混合物 (见材料表)。在 dna 中加入4μl 的最终修复主混合物, 在20°c 下孵育30分钟。
- 加入10mm 的 10 mm tris-cl、ph 8.5 和0.6倍体积 (30μl) 的固相可逆固定化 (spri) 磁珠, 在室温下孵育5分钟。
- 将管子放在磁性支架上, 等待上清液变清。
- 将上清液转移到新管中, 加入1.2倍体积 (60μl) 的 spri 磁珠, 并在室温下孵育5分钟。
- 将管子放在磁性支架上, 等待上清液变清。
- 用200μl 的 80% etoh 清洗两次珠子, 将管子仍固定在磁铁上。
- 简单地离心管, 收集底部的残余 etoh, 并将其放回磁铁上。彻底取出残留的 etoh。
- 将管盖打开 1-2分钟, 使 etoh 蒸发。
- 合上盖子, 把管子放在冰上。
注意: 现在您已经在珠子上获得了 100–500 bp 的大小选择 dna。有关双尺寸选择的更多详细信息, 请参阅制造商的网站 (www.beckman.com)。 - 准备 a 尾矿主组合 (见材料表)。
- 用10μl 的 a 尾矿主混合重新将珠子 (从步骤7.10 开始) 重新拔插, 并在30°c 下孵育30分钟。
- 加入1.8倍体积 (18μl) 聚乙二醇 (peg)/氯化碳溶液, 在室温下孵育5分钟。
- 按照步骤7.7-7.11 净化 dna。
- 准备结扎缓冲液混合物 (见材料表)。
- 移液器8μl 的结扎缓冲液混合到珠子上 (从步骤 7.14), 加入1μl 的1μm 适配器, 然后重新悬挂珠子。输入样品使用 1μl 5μm 适配器。考虑对每个示例使用不同的适配器进行多路复用。
- 加入1μl 的 dna 连接酶, 在20°c 孵育15分钟。
- 加入 peg/ncl 溶液的 1.0 x 体积 (10μl), 重新悬浮珠子, 并在室温下孵育5分钟。
- 按照步骤7.7-7.10 净化 dna。
- 移液器25μl 的 10 mm 磁升-cl, ph 8.5 进入管并重新悬浮珠子。
- 加入 peg/ncl 溶液 1.0 x 体积 (25μl), 在室温下孵育5分钟。
- 按照步骤7.7-7.10 净化 dna。
- 移液器11μl 的 10 mm 磁升-cl, ph 8.5 进入管并重新悬浮珠子。
- 将管子放在磁性支架上, 等待上清液变清。
- 将上清液收集到一个新的8带 pcr 管中。
- 准备实时 pcr 主混音 (有关详细信息, 请参阅材料)。
- 在384井定量 pcr (qpcr) 板中添加1.5μl 的适配器连接 dna (从步骤 7.26) 中的实时 pcr 主混合。
- 在空井中, 每个荧光标准的移液器10μl。
- 使用以下程序执行实时 pcr: (45秒 98°c) x 1个周期, (15秒 98°c, 30秒 60°c, 30秒 72°c) x 20个周期, (60秒为 72°c) x 1个周期。
- 确定达到荧光标准2的荧光强度所需的 pcr 周期数。
- 准备 pcr 主混合物 (参见材料表)。
- pcr 主混合到剩余的适应辅助 dna 中 (从步骤 7.26) 中的移液器 11.5μl, 并按照步骤7.26 中所示执行 pcr, pcr 周期在步骤7.26 中确定。
- 加入 peg/ncl 溶液 1.0 x 体积 (20μl), 在室温下孵育5分钟。
- 按照步骤7.7-7.10 净化 dna。
- 移液器20μl 的 10 mm 磁升-cl, ph 8.5 进入管并重新悬浮珠子。
- 将管子放在磁性支架上, 等待上清液变清。
- 收集上清液到一个新的 1.5 ml-dna 低结合管。
- 检查步骤4.11 中所述的库的质量 (参见图2e 和 f 中所示的代表性数据)。使用库 dna 样本的1μl。(可选)如前2所述, 用 qpcr 进行富集分析。应观察10倍或更大的浓缩。
8. 测序
- 对下一代排序器中的库进行排序 (参见图 3所示的代表性数据)。
注: 足够用于数据分析的序列深度将根据生物体的基因组大小3而有所不同.对于人类和鼠标, 我们建议获得至少 2, 000万部端的单端读取。根据读取的结果, 多路复用可能具有成本效益。
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Representative Results
在这里, 我们描述了组织解剖, 固定, 细胞裂解, 染色质的串联纯化, 以及 dna 文库准备下一代测序。在过程中, 可以在多个步骤中测试 dna 的质量, 这是成功测序的关键 (图 2)。由于单个核糖体通常被 147 bp dna 4包围, 剪切的 dna 不应短于该大小。超声检查后, 立即分离 dna 并在微流式电泳机上运行 (图 2a)。尽管我们尽了最大努力优化大小范围, 但我们仍然有大量的 dna (约 2 kbp) 没有被剪掉。在这一步中, 从 100-500 bp 到 100 bp 的 dna 比例应该是人口的50% 或更多。在抗 flag 抗体 (图 2b) 和抗 h3k4me3 抗体 (图 2d) 进行亲和力纯化后, 使用微流控电泳机再次检测分离 dna 的质量, dna 的含量从估计为 100-500 bp。虽然我们经常观察到在这一步中对2kbp 片段有更强的偏差, 但 spri 磁珠的尺寸选择增加了一倍, 消除了这一分数。
用阴性对照样本证实了 dna 免疫纯化对 h2b-flag 的特异性, 在该样本中, 使用了无 h2b-flag 表达的小鼠脑裂解物 (图 2c)。我们通常从阴性对照样本中检测到可以忽略不计的 dna 量。
在 a-尾矿、适配器结扎和 pcr 之后, 验证了测序库的质量 (图 2e)。通常情况下, 获得 250-600 bp dna。利用针对 gapdh 基因启动子区域的引物进行了 qpcr 2 浓缩分析, 证明了成功的常规 chip 和 tchip (图 2f).
图 3显示了按基因组浏览器读取神经元基因 (camk2a、slc17a7 和 gria1) 的代表性分布。观察了神经元 tchip-seq 在整个大脑 tchip-seq 上的基因 5 ' 端读数。
图 1: tchip-seq 的原理图表示.这一数字已从 myto ,m. 等人修改。1.请点击此处查看此图的较大版本.
图 2: dna 质量检查.(a、 b、 d和e)利用微流控电泳机获得的电泳图谱, 用于剪切染色质 dna (a), 用抗 flag 抗体 (b) 纯化 dna, 然后使用抗 h3k4me3 抗体 (c), 以及最终的文库 (d)。绿色和紫色数字突出显示的峰值表示内部大小标准。蓝色虚线表示考虑进行下游分析的 dna 大小区域。fu: 荧光单位。
(c) 抗 flag 免疫纯化回收的 dna 量。每个点表示独立的复制。(f) qpcr 针对 gapdh 进行浓缩分析。每个点表示独立的复制。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 读取神经元 tchip-seq 中的分布.(A-C)在神经元 tchip-seq 中, 沿着具有代表性的神经元基因读取分布, 并控制整个大脑 tchip-seq。rpm: 每百万次读取读取。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们的协议针对小鼠大脑的神经元进行了优化, 其中 FLAG-tagged 的 h2b 的表达是由他莫西芬注射液诱导的。用于 h2b 表达的促进剂、起始组织材料和组织量是 tchip-seq 成功的关键参数。因此, 应考虑对每个细胞类型感兴趣的因素进行优化。
在本协议中使用的程序中, 一个关键的步骤是 dna 剪切, 以实现 200-500 bp5的染色质长度。一般来说, 超声检查步骤的标准化具有挑战性, 因为它在很大程度上取决于多种因素;固定条件、使用的组织、用于超超声的设备以及设备设置等。因此, 单个实验需要对这一 dna 剪切步骤进行试错优化。微核核酸酶治疗不是超超声, 而是分离单个核糖体大小 dna 的一种选择, 就像天真的 chip 方法6中使用的那样。尽管 dna 的同质大小分布是理想的, 但剪切的 dna 可能显示多个群体, 如图 2 a 所示。如上文所述, spri 磁珠的双重尺寸选择有助于去除较长尺寸的 dna 片段。
通常情况下, 库准备需要1纳克的 100-500 bp dna。基于这一要求, 我们扩大了神经元脑组织的初始材料。然而, 对于来自稀有细胞类型的极小样本, 此过程可能具有挑战性。在这种情况下, chip 结构, 这是基于 tn5 转相酶, 而不是连接酶, 需要较少的材料7, 可能是更好的选择。
然而, 该目前的协议仅限于材料中的主要细胞类型。在我们手中, 在原始细胞群中, 10% 的目标细胞占用率提供了从目标细胞1中公平纯化染色质的机会。然而, 如果更罕见的细胞类型是有针对性的, 那么更精细的优化免疫沉淀的表位标签将有必要区分分离的 dna 从被污染的 dna 和非靶向细胞。对于数据分析的最佳实践, 我们强烈建议将数据与用于启动实验的整个组织的计算机分析进行比较。由于我们发现了来自外源表达的 h2b-flag 蛋白的显著偏见, 因此应通过浓缩 (或损耗) 将分析结果与背景1进行比较和分析。对于此控件, 我们确实创建了一个鼠标行, 其中普遍表示为 h2b-flag (rosa h2b-flag), 并执行了 tchip-seq1。以前已经讨论过对数据的更详细的解释。
根据我们的分析, 来自神经元的 h3k4me3 tchip-seq 提供了比 facs-8 的 rna-seq 更能检测已知神经元特异性基因的方法, 并翻译核糖体亲和力纯化 (trap)-seq 9.例如, 已知的轴突定位基因是有效地恢复使用神经元 tchip-seq 1.值得注意的是, 我们的 tchip-seq 不限于启动子相关的组蛋白标记,但也适用于其他各种组蛋白修饰 10, 如果有抗体可用。此外, 标记核组蛋白分离染色质的策略可用于其他模型生物。虽然在这里, 我们使用 flag 表位标记核心组蛋白蛋白, 其他标签可以应用。由于甲醛固定 dna 最常见的是在赖氨酸残基的蛋白质11, 应避免与许多赖氨酸的标签, 以消除偏见的表位标记。因此, 在表观遗传研究中, tchip-seq 方法应在不同的组织中具有通用性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢岩崎实验室的所有成员对手稿的批判性阅读。这项工作得到了创新领域科学研究补助金 (#26113005 s. n. 和 jp17h05679 至 s. i.) 的部分支持;a 日本教育、科学、体育和文化部为青年科学家提供补助金 (a) (jp17h04998 至 s. i.);和创业项目 "细胞进化" 和所有 riken 项目 "疾病和表观体" 从 riken (到 s. n. 和 s. i.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L.
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
