TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Summary

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

Abstract

Epigenetischen Regulation spielt zentrale Rolle in der Genexpression. Da Histon Änderungen in den 1960er Jahren entdeckt wurde, haben seine physiologischen und pathologischen Funktionen ausgiebig studiert. Das Aufkommen der Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) über spezifische Histon Modifikation Antikörper hat in der Tat, unsere Sicht der epigenetischen Regulation über das Genom revolutioniert. Umgekehrt Gewebe bestehen typischerweise aus verschiedenen Zelltypen und ihre komplexe Mischung stellt analytische Herausforderungen an das Epigenom in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen. Um den Zellstatus typspezifische Chromatin in einer genomweiten Weise zu begegnen, haben wir vor kurzem entwickelt Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), basiert auf die selektive Reinigung von Chromatin von tagged Kern Histonproteine von Zelle Arten von Interesse, gefolgt von ChIP-seq. Das Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von best Practices der tChIP-seq. Diese Technik bietet ein vielseitiges Werkzeug für gewebespezifischen Epigenom Untersuchung in verschiedenen Histon-Modifikationen und Modellorganismen.

Introduction

Gewebe von Tieren bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen. Die Genregulation in jeder Zelle definiert die Zelltyp. Chromatin Modifikationen - DNA-Methylierung und Histon Modifikation - unterliegen die Zelltyp Spezifität der Genexpression. So, die Messung der epigenetischen Regulation in jeden Zelltyp wurde gewünscht, aber es war eine technische Herausforderung.

Um die Epigenetik in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen, war Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq) neu entwickelte ()Abbildung 1()¹. In tChIP drückt sich Epitop-Tags Kern Histon Protein H2B aus einer Zelle-Typ-spezifischen Promotor. Dieses Feature ermöglicht die Isolierung des Chromatins aus den Zellen von Interesse, obwohl das Material aus einer Mischung von verschiedenen Zelltypen beginnt. Folgende ChIP-Seq-Chromatin Reinigung über einen geändert-Histon Mark und Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation der isolierten DNA – wir können den epigenetischen Status des gezielten Zelltyps in einer genomweiten Weise überwachen.

Mit dieser Technik, untersuchten wir vor kurzem Neuron-spezifische Trimethylation von Histon H3-Proteins an Lysin 4 (H3K4me3) markiert. In dieser Studie entwickelten wir eine Knock-in-Maus in die C-unheilbar Flagge markiert H2B Protein bei der Cre-vermittelten Rekombination (Rosa26^{CAG Floxed-pA H2B-FLAG}) zum Ausdruck kam. Durch Kreuzung mit einer Maus besitzen das Cre-endoplasmic Reticulum (ER)-gen unter der Kontrolle des CamK2a-Promotors induziert der erhaltenen Mauslinie H2B-FLAG in aktiven Neuronen auf Tamoxifen Injektion (Camk2a^H2B-FLAG)¹. Das Gehirn der etablierten Mauslinie ab, führten wir tChIP-Seq mit Anti-H3K4me3 Antikörper. Da H3K4me3 Marken oft Förderer Regionen entsprechen, konnten wir Hunderte von mRNAs konkret ausgedrückt in Neuronen¹entdecken.

Hier beschreiben wir eine typische tChIP-Seq-Methode, die die Schritte vom Gewebe Dissektion bis Bibliotheksbau ()Abbildung 1() umfasst. Das Endziel dieses Protokolls ist, unsere best Practices für die Leistung der tChIP-Seq und die künftige Anwendung dieser Methode zu anderen Zelltypen und Histon-Modifikationen zu teilen.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Abteilung Sicherheit des RIKEN (H27-EP071) genehmigt und mit entsprechenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

(1) Gewebe Dissektion

1. Sezieren das Gewebe von Interesse in kleine Stücke (ca. < 3 mm²) mit einer feinen Feder Schere.
   Hinweis: Größere Gewebefragmente länger zu frieren, und kleinere Stücke tragen über größere Mengen des Puffers, die die Ergebnisse beeinflussen können.
2. Einen sauberen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt seziert Gewebefragmente hinzu und sammle sie in 2 mL Röhrchen (1 Stück pro Röhre) mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
   Hinweis: Für diesen Schritt sind Rohre mit einer hydrophilen Oberfläche empfohlen.
3. Legen Sie die Rohre bei-80 ° C > 5 min. mit dem Deckel offen für den restlichen flüssigen Stickstoff verdampft.
   Hinweis: Nach dem Schließen der Kappe, können Gewebefragmente bei-80 ° C für einen Monat vor dem Gebrauch gespeichert werden.

(2) Zelle Fixierung

Hinweis: Wir ein handliches kryogenen Wandler benutzt, für diesen Schritt. Eine alternative Vorrichtung kann verwendet werden.

1. Statt der 2 mL-Proteinbindung niedrigen Röhren die Gewebeproben auf einem Gestell Metall Eis in flüssigem Stickstoff gekühlt.
2. Legen Sie eine Metall-Kugel in eine 1,5 mL-Tube und Chill mit flüssigem Stickstoff. Legen Sie es auf das Metall Eis-Rack.
3. Öffnen Sie der 2-mL-Tube und legen Sie die prechilled Metall-Kugel in die Röhre. Schließen Sie den Deckel, Schlauchhalter ein handliches kryogenen Mühle eingelassen Sie 2 mL-Röhrchen und sofort Tauchen Sie die montierten Rohrhalter in flüssigem Stickstoff für 1 min.
4. Legen Sie die gefrorenen Rohrhalter in die äußere Kassette der handliche kryogenen Mühle und kräftig schütteln 60mal für 30 s.
5. Zerlegen Sie der Rohrhalter, entfernen Sie die Metall Kugel, und statt der 2 mL-Tube auf einer Stichprobe Kühler prechilled bei-20 ° C.
6. Legen Sie die Probe Kühler bei-20 ° C für 15 min zum Einfrieren von das Fixiermittel im nächsten Schritt zu verhindern.
7. Bringen Sie die Probe Kühler auf die Bank, öffnen Sie den Deckel des Rohres und sofort Tropfen Sie 900 µL 1 % Formaldehyd hinein. Nach dem Pipettieren mehrmals, übertragen Sie die Aussetzung in neuen 2 mL-Röhrchen mit 900 µL 1 % Formaldehyd und Fix für 10 min mit sanften Drehung in einem Inkubator gesetzt bei 23 ° C.
   Achtung: Formaldehyd ist giftig und schädlich.
8. Um die Fixierung Reaktion zu stoppen, hinzu kommen 100 µL 2,5 M Glycin jedes Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
9. Fügen Sie 1 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C und verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (3 Wäschen insgesamt).
   Hinweis: Feste Proben können Blitz von flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c gelagert werden
10. Hinzufügen von 500 µL Lysis Puffer 1 (50 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) (pH 8,0), 10 % w/V Glycerin, 0,5 % w/V NP-40, 0,25 % w/V Triton X-100 und 0,1 X Protease-Inhibitor Cocktail), Pellets, Pipettieren mehrmals, und drehen für 10 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Lysis Puffer 1 sollte gefiltert und bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.
11. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
12. Fügen Sie 1 mL Lyse Puffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA, und 0,1 x Proteaseinhibitor cocktail) zum Pellet, Wirbel, und drehen für 10 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Lysis Puffer 2 sollte gefiltert und bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.
13. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
14. Das Pellet 800 µL des Tests (RIPA) Testpuffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen und Aufschwemmen der Pellets durch pipettieren.
15. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
16. 500 µL RIPA Puffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.
17. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
18. Fügen Sie 1 mL RIPA Puffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.

(3) Chromatin Scheren

1. Auf einem Sonikator Rohr übertragen Sie der lysate und dann legen Sie das Rohr auf einer Ultrasonicator.
2. Scheren Sie das Chromatin mit den folgenden Einstellungen: Temperatur: 4 ° C; einfallende Spitzenleistung: 175 W; Einschaltdauer: 10 %; Zyklen/Burst: 200; und Zeit: 2.400 s.
3. Übertragen der Probenmaterials auf eine 1,5 mL-Protein niedrig Bindung Rohr- und Zentrifuge für 5 min bei 20.000 x g bei 4 ° C.
4. Den Überstand in ein neues Protein niedrig Bindung Rohr zu sammeln.
   Hinweis: Die Probe kann Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c gelagert

(4) Qualitätsprüfung von DNA (Reverse Vernetzung)

1. Mix-20 µL der lysate und 180 µL ChIP Elution Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) und 1 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat (SDS)) in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhre. Inkubation der Probe bei 65 ° C in einem Thermocycler für 6 h mit dem Thermocycler Deckel geöffnet. Halten Sie den Deckel des geöffneter Thermocycler, übermäßige Denaturierung zu vermeiden.
   Hinweis: Sollte der ChIP Elution Buffer gefiltert und vor Gebrauch bei Raumtemperatur gelagert. Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
2. Fügen Sie 1 µL von 10 mg/mL RNase A, Wirbel, und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
3. Fügen Sie 6,5 µL von 15 mg/mL Proteinase K, Wirbel, und bei 55 ° C für 60 min inkubieren.
4. Übertragen Sie die Reaktion auf eine niedrige DNA-Bindung-Röhre zu, fügen Sie 4 µL von 5 mg/mL Glykogen und Wirbel. Fügen Sie 200 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol (25:24:1) und Zentrifuge für 5 min bei 18.000 x g bei Raumtemperatur.
5. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue DNA niedrige Bindung Rohr. Fügen Sie 200 µL Tris-EDTA-NaCl-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) und 200 mM NaCl), die restlichen Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohollösung und Zentrifuge für 5 min bei 18.000 x g bei Raumtemperatur. Den Überstand zu sammeln und mischen mit der ersten überstand.
6. Fügen Sie 900 µL eiskaltes Ethanol und 1 h bei-20 ° c inkubieren
   Hinweis: Diese Inkubation kann auf 4 - 6 h verlängert werden.
7. Zentrifuge für 30 min bei 18.000 x g bei 4 ° C.
8. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 1 mL eiskaltem 75 % Ethanol in die Pellet und Zentrifuge für 30 min bei 18.000 x g bei 4 ° c Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
9. Den Überstand gänzlich zu verwerfen und für 1 min bei Raumtemperatur trocknen.
10. Fügen Sie 50 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer und lösen Sie die DNA durch Inkubation es bei Raumtemperatur für 30 min oder bei 4 ° C über Nacht auf. Vermeiden Sie aufschütteln oder pipettieren. Halten Sie diese DNA als "Input" und Vorbereitung der Bibliothek zu verwenden Sie, wenn nötig.
11. Die DNA-Konzentration zu messen, mit einem Fluorometer nach Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) und überprüfen Sie die Größenverteilung mit einer mikrofluidischen Elektrophorese-Maschine (siehe repräsentative Daten in Abbildung gezeigt 2a). Verwendung 10 ng oder weniger DNA für diesen Test.
    Hinweis: Fragmente von 100 – 500 Basenpaaren (bp) sollte mindestens 50 % der DNA bilden.

5. Affinitätsreinigung von Anti-FLAG Antikörper

Hinweis: Für Neuron tChIP-Seq, Hirngewebe aus 8 Mäuse sind in der Regel verwendet für eine Probe von tChIP-Seq 2 vorbereiten ng gereinigte DNA durch Tandem immun-Reinigung (siehe Schritt 7.1). In unseren Händen 0,1 ng DNA noch zur Verfügung gestellt qualitativ hochwertige DNA-Bibliotheken für ChIP-Seq (Kadota, unveröffentlicht). So kann theoretisch ein einziger Mausklick durchzuführen Neuron tChIP-FF ausreichen Die erforderliche Menge sollte für die Gewebe- und Art des Interesses optimiert werden. Für die negativ-Kontrolle des Experiments Imumuno-Reinigung sollte Hirngewebe lysate von Mäusen ohne jede H2B-FLAG Ausdruck vorbereitet und verwendet werden.

1. Die magnetische Beads konjugiert, Schafe Anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) in eine geringe Proteinbindung Rohr 200 µL Pipette.
2. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS und Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
3. Fügen Sie 20 µL 1 mg/mL Anti-FLAG Antikörper und drehen für 5 h bei 4 ° C.
   Hinweis: Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
4. Waschen Sie die Perlen nach Schritt 5.2. Legen Sie die Perlen in eine 15-mL-Tube.
5. Aufschwemmen Sie die Perlen in 1110 µL RIPA Puffer und fügen Sie dann 900 µL 10 x blocking Reagenz, 180 µL 50 x Denhardt Lösung 10 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail und 6,8 mL lysate in Schritt 3 erstellt. Diese Mischung in 5 Protein niedrig Bindung Rohre aufgeteilt. 6 h bei 4 ° c drehen
   Hinweis: Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
6. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL RIPA Puffer und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal (6 Wäschen insgesamt). Bündeln Sie alle Perlen in ein einziges Protein niedrig Bindung Rohr.
7. Fügen Sie 200 µL ChIP Elution Buffer und drehen für 15 min bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die Qualität der DNA, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten, dargestellt in Abbildung 2 b und C). Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.

6. Affinitätsreinigung von Anti-H3K4me3-Antikörper und umgekehrte Vernetzung

Hinweis: Die folgenden Wulst Vorbereitung, die Schritte (6.1-6.4) vor Schritt 5.7 durchgeführt werden sollte.

1. Magnetische Beads konjugiert, Schafe Anti-Maus IgG in einer 2 mL-geringe Proteinbindung Rohr 40 µL Pipette.
2. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
3. Fügen Sie 4 µL 1 mg/mL Anti-H3K4me3 Antikörper und drehen für 6 h bei 4 ° C.
4. Waschen Sie die Perlen nach Schritt 6.2. Legen Sie die Perlen in einer 2 mL-geringe Proteinbindung Röhre.
5. Aufschwemmen Sie die Perlen in 1558 µL RIPA Puffer und fügen Sie dann 200 µL 10 x blocking Reagenz, 40 µL 50 x Denhardt Lösung 2 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail und 200 µL das Eluat in Schritt 5.7 vorbereitet. Drehen Sie über Nacht bei 4 ° C.
   Hinweis: Die SDS im ChIP Elution Puffer wurde mehr als 10 Mal in diese Inkubation verdünnt.
6. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL RIPA Puffer und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal (5 Wäschen insgesamt). Übertragen Sie nach der letzten Wäsche die Perlen in einer DNA niedrige Bindung Röhre, und verwerfen Sie den überstand.
7. Fügen Sie 200 µL ChIP Elution Buffer und drehen für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Eluat auf eine neue DNA niedrige BindingTube.
   Hinweis: Das Eluat kann bei-80 ° c aufbewahrt werden
8. Folgen Sie Schritt 4 für Decrosslinking der DNA. Die gereinigte DNA in 20 µL TE-Puffer aufzuwirbeln.
9. Überprüfen Sie die Qualität der DNA, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten gezeigt in Abb. 2D). (optional) Anreicherung Analyse mittels quantitativer PCR durchführen wie zuvor beschrieben². Um das Zehnfache oder mehr Bereicherung beachtet werden.

(7) Bibliotheksbau

1. Berechnen Sie für jeden Eingang und ChIP DNA-Probe des Anteils der DNA im Bereich von 100 – 500-bp mit Abstrich-Analyse-Funktion der Software für die Mikrofluidik Elektrophorese Maschine. Schätzen das Probenvolumen erforderlich 2 ng von 100 – 500 bp DNA. Verwenden Sie 20 ng DNA im Bereich von 100 – 500-bp als "input" Probe.
2. Pipette DNA-Proben in 8 Streifen PCR Tubes und H₂O, das Gesamtvolumen auf 10 µL. (optional) zu bringen, übersteigt die Menge an DNA 10 µL, proportional skalieren die folgende Reparatur-Ende-Reaktion und die Größenauswahl.
3. Ende-Reparatur-master-Mix vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien). Die DNA 4 µL Ende-Reparatur-master-Mix hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei 20 ° C.
4. Fügen Sie 36 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 und 0,6 X Volumen (30 µL) der festen phase reversible Immobilisierung (SPRI) magnetische Beads und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
6. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch, fügen Sie 1,2 X Mengen (60 µL) des SPRI magnetische Beads und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
7. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
8. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 µL von 80 % EtOH, hält das Rohr noch auf den Magneten.
9. Zentrifugieren Sie kurz den Schlauch zu sammeln den Rest EtOH unten und legen Sie es zurück auf den Magneten. Entfernen Sie der Rest EtOH gründlich.
10. Lassen Sie den Schlauch Deckel offen für 1-2 min erlauben die EtOH zu verdampfen.
11. Schließen Sie den Deckel und halten Sie das Rohr auf dem Eis.
    Hinweis: Jetzt haben Sie Bildgröße DNA von 100 – 500 bp an den Perlen erhalten. Weitere Details zu doppelter Größenauswahl finden Sie auf der Website des Herstellers (www.beckman.com).
12. Vorbereitung A-Tailing Meister mischen (siehe Tabelle der Materialien).
13. Aufschwemmen der Perlen (aus Schritt 7.10) mit 10 µL des A-Tailing-master-Mix und inkubieren Sie für 30 min bei 30 ° C.
14. Volumen 1,8 X (18 µL) von Polyethylenglykol (PEG) / NaCl-Lösung und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Führen Sie die Schritte 7,7-7.11 um die DNA zu reinigen.
16. Ligatur Puffer Mischung vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien).
17. Pipette 8 µL Ligatur-Puffer-Mix auf die Perlen (aus Schritt 7,14), 1 µL 1 µM-Adapter hinzufügen und erneut die Perlen. Verwenden Sie 1 µL 5 µM-Adapter für das Eingabesample. Verwenden Sie verschiedene Adapter für jede Probe für multiplexing.
18. 1 µL DNA Ligase hinzufügen und 15 min. bei 20 ° c inkubieren
19. 1,0 X Volumen (10 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen, die Perlen Aufschwemmen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
20. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
21. Pipette 25 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
22. 1,0 X Volumen (25 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
23. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
24. Pipette 11 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
25. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
26. Sammeln des Überstands in ein neues 8-Streifen PCR-Röhrchen.
27. Bereiten Sie Echtzeit-PCR-master-Mix (siehe Materialien für Details).
28. Pipette 8,5 µL des Real-Time PCR-master-Mix in einem 384-Well quantitative PCR (qPCR) Teller und fügen Sie 1,5 µL des Adapters DNA (aus Schritt 7,26) ligiert.
29. Pipette 10 µL jeder fluoreszierende Norm in leeren Brunnen.
30. Real-Time PCR mit dem folgenden Programm ausführen: (98 ° C für 45 s) x 1 Zyklus (98 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s) x 20 Zyklen und (72 ° C für 60 s) x 1 Zyklus.
31. Bestimmen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen benötigt, um die Fluoreszenzintensität der Fluoreszenz Standard 2 zu erreichen.
32. Vorbereiten den PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien).
33. Pipette 11,5 µL des PCR-master-Mix in die verbleibenden Adapter ligiert DNA (aus Schritt 7,26) und PCR durchzuführen, wie in Schritt 7.30 Uhr mit der PCR-Zyklen im Schritt 7.31 bestimmt.
34. 1,0 X Volumen (20 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
35. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
36. Pipette 20 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
37. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
38. Sammeln Sie den Überstand in einen neuen Schlauch 1,5 mL-DNA niedrige Bindung.
39. Überprüfen Sie die Qualität der Bibliothek, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten, dargestellt in Abbildung 2E und F). Verwenden Sie 1 µL der Bibliothek DNA Probe. (optional) Durchführen Sie Anreicherung Analyse durch qPCR wie zuvor beschrieben ². Um das Zehnfache oder mehr Bereicherung beachtet werden.

(8) Sequenzierung

1. Reihenfolge der Bibliotheken in einer nächsten Generation Sequenzer (siehe repräsentative Daten, siehe Abbildung 3).
   Hinweis: Die Reihenfolge Tiefe ausreichend für die Datenanalyse variieren je nach der Genomgröße des Organismus³. Für Mensch und Maus, wir empfehlen eine mindestens 20 Millionen Einend-mal gelesen. Nach der Ausbeute an liest könnte Multiplexen kostengünstig sein.

Representative Results

Hier beschreiben wir Gewebe Dissektion, Fixierung, Zelle Lysis Tandem Reinigung von Chromatin und DNA-Bibliothek Vorbereitung für nächste Generation Sequenzer. Im Verlauf der Verfahren kann man die Qualität der DNA, testen, das ist der Schlüssel für erfolgreiche Sequenzierung in mehreren Schritten (Abbildung 2). Da ein einzelnes Nukleosom in der Regel 147 bp DNA ^{4 umgeben ist}sollte geschert DNA nicht kürzer als dieser Größe sein. Sofort nach dem Ultraschall wurde die DNA isoliert und führen auf einem mikrofluidischen Elektrophorese Computer (Abbildung 2A). Trotz unserer Bemühungen um den Größenbereich zu optimieren hatten wir noch eine Bevölkerung von DNA (ca. 2 Kbp), die ungescherten blieb. Bei diesem Schritt sollte der Anteil der DNA von 100-500 bp bis 50 % oder mehr der Bevölkerung. Nach der Affinitätsreinigung von Anti-FLAG Antikörper (Abb. 2 b) und dann Anti-H3K4me3 Antikörper (Abb. 2D) wurde die Qualität der isolierten DNA überprüft erneut mit der Mikrofluidik-Elektrophorese-Maschine und die Menge an DNA von 100-500 bp wurde geschätzt. Obwohl wir oft eine stärkere Tendenz zur 2 Kbp Fragmente bei diesem Schritt beobachtet, entfernt doppelte die Größenauswahl von SPRI magnetische Beads dieser Fraktion.

Die Besonderheit des immun-Reinigung der DNA auf H2B-Flagge wurde bestätigt mit der Negativkontrolle Proben, in welche Gehirn von Mäusen ohne H2B-FLAG lysate Ausdruck verwendet wurde (Abbildung 2). Wir haben in der Regel geringfügige Mengen von DNA von den negativen Kontrollproben festgestellt.

Nach A-Tailing, Adapter Ligatur und PCR, die Qualität der Sequenzierung Bibliothek überprüft wurde (Abb. 2E). In der Regel wurde 250-600 bp DNA erhalten. Die erfolgreiche regelmäßige ChIP und tChIP wurden durch die Anreicherung Analyse mit qPCR² unter Verwendung von Primern targeting Promotor-Region des Gens GAPDH (Abb. 2F) belegt.

Vertreter lesen Sie Distributionen entlang Neuron-Gene (Camk2a, Slc17a7 und Gria1) von Genom-Browser in Abbildung 3dargestellt sind. Die Anreicherung von liest am 5 ' Ende Gene durch Neuron tChIP-Seq über ganze Gehirn tChIP-Seq wurde beobachtet.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der tChIP-f Diese Zahl verändert wurde, von Mito, M. Et Al. ¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: DNA-Qualitäts-Check. (A, B, Dund E) Electropherogram erreicht man eine mikrofluidischen Elektrophorese Maschine geschoren Chromatin DNA (A), DNA mit Anti-FLAG Antikörper (B) und dann Antikörper Anti-H3K4me3 (C) und die endgültige Bibliothek (D) gereinigt. Die Gipfel markiert mit grünen und violetten Zahlen stellen interne Größe Standards. Blaue gestrichelte Linien zeigen die DNA Größe Regionen für nachgelagerte Analyse berücksichtigt. FU: Fluoreszenz-Einheiten.
(C) die Menge an DNA erholt von Anti-FLAG immun-Reinigung. Jeder Punkt entspricht einer unabhängigen replizieren. (F) Anreicherung Analyse von qPCR targeting GAPDH. Jeder Punkt entspricht einer unabhängigen replizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Verteilungen in Neuron tChIP-FF zu lesen (A-C) Lesen Sie Ausschüttungen an repräsentativen Neuron Gene in Neuron tChIP-Seq und Kontrolle ganze Gehirn tChIP-Seq werden angezeigt. U/min: Lesevorgänge pro million mal gelesen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Unser Protokoll wurde für die Nervenzellen des Mausgehirns optimiert, der Ausdruck der Flagge markiert H2B durch Tamoxifen Injektion induziert wird. Promotoren verwendet für H2B Ausdruck, Ausgangsstoffe Gewebe und die Menge des Gewebes sind entscheidende Parameter für erfolgreiche tChIP-seq. Die Optimierung dieser Faktoren sollte somit für jeden Zelltyp des Interesses betrachtet werden.

Ein entscheidender Schritt zu den Verfahren, die in diesem Protokoll verwendeten ist die DNA Scheren um eine Chromatin-Länge von 100-500 bp⁵zu erreichen. Die Standardisierung der Ultraschall-Schritt ist im Allgemeinen schwierig, da es stark von einer Vielzahl von Faktoren abhängt; Fixierung Bedingungen, das Gewebe verwendet, die Ausrüstung für Ultra-Beschallung und das Gerät einstellen, unter anderem. Daher werden Trial-and-Error-Optimierung dieses DNA-Scheren Schrittes für die einzelnen Experimente erforderlich. Anstelle von Ultra-Beschallung muss micrococcal Nuklease Behandlung eine Option, um einzelne Nukleosom-Größe DNA, wie in der naiven ChIP Methode⁶zu isolieren. Obwohl die homogene Größenverteilung der DNA ist ideal, geschoren können DNAs die mehrere Populationen zeigen, wie in Abbildung 2Adargestellt. Die doppelte Größenauswahl von SPRI magnetische Beads, hilft wie oben beschrieben, die längere mittlere DNA-Fragmente entfernen.

In der Regel Bibliothek Vorbereitung erfordert 1 ng von 100-500 bp DNA. Basierend auf diese Anforderung, skalieren wir das Ausgangsmaterial für die Neuronen des Hirngewebes. Dieses Verfahren möglicherweise jedoch eine Herausforderung für extrem kleine Kostproben aus seltenen Zelltypen. In solchen Fällen kann ChIP-Dokumentation, die basiert auf Tn5 Transposase statt Ligase und erfordert weniger Material⁷, bessere Alternative sein.

Dennoch ist dieses aktuellen Protokoll beschränkt sich auf die wichtigsten Zelltypen im Material. In unseren Händen 10 % Belegung von Zellen in der ursprünglichen Zellenbevölkerung zielgerichtet zur Verfügung gestellt fair Reinigung von Chromatin von Ziel-Zellen-¹. Aber wenn noch mehr seltene Zelltypen gezielt eingesetzt werden, wird dann feinere Optimierung der Immunopräzipitation durch das Epitop Tag gerechtfertigt sein, um die isolierte DNA aus kontaminierten DNA aus nicht zweckgebundenen Zellen zu unterscheiden. Best Practices der Datenanalyse empfehlen wir dringend, die Daten im Vergleich zu der Kontrolle tChIP-Seq-Analyse aus dem gesamten Gewebe verwendet, um das Experiment zu initiieren. Da wir erhebliche Verzerrungen von EXOGEN ausgedrückt H2B-FLAG Protein gefunden, sollte die Analyse verglichen und analysiert durch Anreicherung (oder Erschöpfung) auf dem Hintergrund¹. Für dieses Steuerelement wir in der Tat eine Mauslinie mit ubiquitär ausgedrückt H2B-FLAG (Rosa^H2B-FLAG) erstellt und tChIP-Seq¹durchgeführt. Eine genauere Interpretation der Daten wurde zuvor¹besprochen.

Auf der Grundlage unserer Analyse der H3K4me3 tChIP-Seq von Neuronen zur Verfügung gestellt/vergleichbare oder bessere Erkennung von bekannten Neuron-spezifische Gene als RNA-Seq von FACS sortiert Neuronen⁸ und übersetzen Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP)-Seq-⁹. Beispielsweise wurden bekannten Axon, Dendriten-lokalisierten Gene effizient mit Neuron tChIP-Seq¹wiederhergestellt. Bemerkenswert ist, unsere tChIP-Seq beschränkt sich nicht nur für die Veranstalter-assoziierten Histon-Mark aber gilt auch für andere verschiedene Histon-Modifikationen-¹⁰ wenn die Antikörper vorhanden sind. Darüber hinaus kann die Strategie der Isolierung Chromatin von tagged Kern Histonproteine in anderen Modellorganismen verwendet werden. Obwohl hier wir Flagge Epitop verwendet, um die Core-Histon-Protein zu markieren, können andere Tags angewendet werden. Da Formaldehyd Fixierung an DNA am häufigsten bei Lysin Rückstände von einem Protein-^{11 tritt}, sollte ein Tag mit vielen Lysin um Vorurteile zu beseitigen durch das Epitop tagging vermieden werden. Daher sollte der tChIP-Seq-Ansatz vielseitig in verschiedenen Geweben entlang viele Arten von Kontexten in epigenetische Studien sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region