Summary
Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.
Abstract
Epigenético regulamento tem um papel central na expressão gênica. Desde que a modificação do histone foi descoberta na década de 1960, suas funções fisiológicas e patológicas têm sido muito estudadas. Com efeito, o advento da próxima geração sequenciamento profundo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP) através de anticorpos de modificação de histona específico tem revolucionado o nosso ponto de vista do Regulamento epigenético através do genoma. Por outro lado, tecidos tipicamente consistem em tipos de diversas células, e sua mistura complexa coloca desafios analíticos para investigar a Epigenoma em um tipo específico de célula. Para resolver o estado de cromatina de tipo específico de célula em uma forma de todo o genoma, desenvolvemos recentemente em tandem da cromatina imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq), que se baseia a purificação seletiva da cromatina de proteínas de histona marcados do núcleo da célula tipos de interesse, seguido de ChIP-Seq O objetivo do presente protocolo é a introdução de melhores práticas de tChIP-Seq Esta técnica fornece uma ferramenta versátil para a investigação de tecido-específica Epigenoma em modificações do histone diversificada e organismos modelo.
Introduction
Tecidos de animais consistem em tipos de células diferentes. A regulação dos genes em cada célula define o tipo de célula. Modificações da cromatina - DNA metilação e histona modificação - fundamentam a especificidade do tipo de célula da expressão do gene. Assim, a medição do Regulamento epigenética em cada tipo de célula tem sido desejada, mas tem sido um desafio técnico.
Para investigar a epigenética em um tipo específico de célula, sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina em tandem (tChIP-Seq) foi recentemente desenvolvido (Figura 1)1. Em tChIP, proteína de núcleo com tag epítopo histona H2B é expressa de um promotor de célula tipo-específico. Este recurso permite o isolamento de chromatins partir de células de interesse, embora o material começa a partir de uma mistura de vários tipos de células. ChIP-Seq seguir — purificação da cromatina, através de um modificado-histona marca e geração de sequenciamento profundo de isolado DNA — pode monitorar o status epigenético o tipo de células alvo de forma todo o genoma.
Usando esta técnica, investigamos recentemente neurônio específico trimethylation de histona H3 proteína em lisina (H3K4me3) de 4 marcas. Nesse estudo, nós desenvolvemos um rato bate-no qual C-terminal bandeira-tag H2B proteína foi expressa sobre recombinação mediada por Cre (Rosa26Floxed-pA CAG H2B-bandeira). Por cruzamento com um rato, possuindo o Cre-endoplasmic gene endoplasmático (ER) sob o controle do promotor CamK2a, a linha obtidos rato induzido H2B-bandeira nos neurônios ativos sobre tamoxifeno injeção (Camk2aH2B-bandeira)1. A partir do cérebro da linha estabelecida rato, realizamos tChIP-Seq com anticorpo anti-H3K4me3. Desde que H3K4me3 marcas muitas vezes correspondem a regiões do promotor, poderia descobrir centenas de mRNAs especificamente expressados em neurônios1.
Aqui, descrevemos um método típico tChIP-Seq que cobre as etapas de dissecção de tecidos para a construção da biblioteca (Figura 1). O objetivo final do presente protocolo é compartilhar nossas melhores práticas para o desempenho de tChIP-Seq e a aplicação futura deste método para outros tipos de células e modificações do histone.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela divisão de segurança da RIKEN (H27-EP071) e conduzidos com normas e diretrizes relevantes.
1. dissecção de tecidos
- Dissecar os tecidos de interesse em pedaços pequenos (aproximadamente < 3 mm2) com uma tesoura de primavera.
Nota: Fragmentos de tecido maiores demoram mais para congelar, e pedaços menores vão transitar por maiores volumes de tampão, ambos os quais podem afetar os resultados. - Adicionar os fragmentos de tecido dissecado para um recipiente limpo com nitrogênio líquido e recolhê-los em tubos de 2 mL (1 parte por tubo) preenchido com nitrogênio líquido.
Nota: Os tubos com uma superfície hidrofílica são recomendados para esta etapa. - Coloque os tubos a-80 ° C para > 5 minutos com a tampa aberta para evaporar o nitrogênio líquido restante.
Nota: Depois de fechar a tampa, fragmentos de tecido podem ser armazenados a-80 ° C durante um mês antes do uso.
2. fixação da pilha
Nota: Usamos um moedor criogênico útil para esta etapa. Um aparelho alternativo pode ser usado.
- Tubos de ligação de baixo lugar a 2 mL-proteínas contendo as amostras de tecido em uma cremalheira do metal gelo refrigerados em nitrogênio líquido.
- Coloque uma bala de metal em um 1,5 mL-tubo e resfriado com nitrogênio líquido. Coloque-o na prateleira do gelo de metal.
- Abra o tubo 2 mL e coloque a bala de metal prechilled para dentro do tubo. Feche a tampa, definir os 2 mL-os tubos no suporte do tubo de um moedor criogênico útil e mergulhe imediatamente o titular tubo montado em nitrogênio líquido por 1 min.
- Encaixe o suporte de tubo congelado a gaveta exterior do moinho criogênico útil e agitar vigorosamente 60 vezes por 30 s.
- Desmontar o suporte de tubo, remover a bala de metal e coloque o 2 mL-o tubo numa amostra refrigerador prechilled a-20 ° C.
- Coloca a amostra mais frio a-20 º C por 15 min evitar o congelamento do fixador na próxima etapa.
- Levar a amostra mais fresca para o banco, abrir a tampa do tubo e imediatamente gotejamento 900 µ l de formol 1% disso. Após várias vezes de pipetagem, transferir a suspensão nova 2 mL-tubo contendo 900 µ l de formol 1% e correção para 10 min com suave rotação na incubadora, situado a 23 ° C.
Atenção: O formaldeído é tóxico e prejudicial. - Para parar a reação de fixação, adicionar 100 µ l de glicina de 2,5 M a cada tubo e centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Adicionar 1 mL de gelado fosfato salino (PBS), centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (3 lavagens no total).
Nota: Amostras fixas podem ser congelado por nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C. - Adicionar 500 µ l do Lysis Buffer 1 (ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 50mm 4 (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM de NaCl, 1 mM etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerol, 0,5% w/v NP-40, inibidor de protease 0,25% w/v Triton x X-100 e 0.1 coquetel) ao pellet, pipetar várias vezes e gire por 10 min a 4 ° C.
Nota: Lise 1 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso. - Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 1 mL de Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM de NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x coquetel de inibidor de protease) ao pellet, vórtice e gire por 10 min a 4 ° C.
Nota: Lise 2 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso. - Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 800 µ l de buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation com inibidor de protease 1x cocktail ao pellet e resuspenda o pellet pipetando.
- Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Adicione 500 µ l de buffer RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail.
- Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de tampão RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail. Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.
3. cromatina tosquia
- Transfira o lisado para um tubo de sonicador e em seguida, coloque o tubo em um ultrasonicator.
- A cromatina de cisalhamento com as seguintes configurações: temperatura: 4 ° C; pico de potência incidente: 175 W; factor de serviço: 10%; ciclos/explosão: 200; e tempo: 2.400 s.
- Transferir a amostra para um 1,5 mL-proteína baixa ligação tubo e centrifugar durante 5 min à 20.000 x g a 4 ° C.
- Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa proteína nova.
Nota: A amostra pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenada a-80 ° C.
4. seleção de qualidade do DNA (reticulação reversa)
- Mix 20 µ l do lisado e 180 µ l de tampão de eluição do ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v Dodecil sulfato de sódio (SDS)) em um tubo de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Incube a amostra a 65 ° C em um termociclador para 6 h com a tampa do termociclador aberta. Mantenha a tampa do termociclador aberta para evitar excesso de desnaturação.
Nota: O tampão de eluição de ChIP deve ser filtrado e armazenado à temperatura ambiente antes do uso. Esta incubação pode ser estendida para a noite. - Adicione 1 µ l de 10 mg/mL RNase A, vórtice e incubar a 37 ° C por 30 min.
- Adicione 6,5 µ l de 15 mg/mL proteinase K, vortex e incubar a 55 ° C por 60 min.
- A reação de um tubo de ligação baixa de DNA de transferência, adicione 4 µ l de glicogênio de 5 mg/mL e o vórtice. Em seguida, adicione 200 µ l de álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) e centrifugar por 5 min a 18.000 x g, à temperatura ambiente.
- Transferi o sobrenadante para um novo tubo de ligação baixa de DNA. Adicionar 200 µ l de tampão Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) para a solução de fenol/clorofórmio/isoamílico álcool restante e centrifugar durante 5 min à 18.000 x g, à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e misture com o sobrenadante primeiro.
- Adicionar 900 µ l de etanol gelado e incubar durante 1 h a-20 ° C.
Nota: Esta incubação pode ser estendida para 4 - 6 h. - Centrífuga para 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de etanol gelado de 75% para a pelota e centrifugar durante 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este passo (duas lavagens no total).
- Descartar o sobrenadante cuidadosamente e deixe secar naturalmente por 1 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 50 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e dissolver o DNA pela incubação à temperatura ambiente por 30 min ou a 4 ° C durante a noite. Evite a utilização do Vortex ou pipetagem. Manter este DNA como "entrada" e usá-lo para a preparação de biblioteca, se necessário.
- Medir a concentração de DNA com um dados de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais) e verificar a distribuição de tamanho com uma máquina de electroforese microfluidic (ver dados representativos, mostrados na figura de 2a). uso 10 ng ou menos DNA para este ensaio.
Nota: Fragmentos de 100 – 500 pares de bases (bp) a ter 50% ou mais do DNA.
5. purificação de afinidade pelo anticorpo anti-FLAG
Nota: Para o neurônio tChIP-Seq, tecidos cerebrais de 8 ratos são normalmente usados para obter um exemplo de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado pela purificação imunológico em tandem (ver passo 7.1). Em nossas mãos, 0,1 ng de DNA ainda fornecida bibliotecas de DNA de alta qualidade para ChIP-Seq (Janaina, não publicada). Assim, em teoria, um único rato pode ser suficiente para executar o neurônio tChIP-Seq A quantidade necessária deve ser otimizada para o tipo de tecidos e células de interesse. Para o controle negativo da experiência imumuno-purificação, tecido cerebral lisado de ratos sem qualquer expressão de H2B-bandeira deve ser preparado e usado.
- Pipete 200 µ l dos grânulos magnéticos conjugada com ovelhas anti-rato a imunoglobulina G (IgG) em um tubo de ligação de baixa proteína.
- Coloque o tubo sobre um suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e o vórtice. Repita este passo (duas lavagens no total).
- Adicionar 20 µ l de anticorpo antibandeira de 1 mg/mL e girar para 5 h a 4 ° C.
Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite. - Lave os grânulos seguindo passo 5.2. Coloque as contas em um tubo de 15 mL.
- Resuspenda os grânulos em 1110 µ l de tampão RIPA e em seguida, adicionar 900 µ l de 10x bloqueando reagente, 180 µ l de solução do Denhardt de 50x, 10 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 6,8 mL do lisado preparado no passo 3. Dividi essa mistura em 5 tubos de ligação de baixa proteína. Girar para 6 h a 4 ° C.
Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite. - Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita este passo 5 vezes (6 lavagens no total). Todas as contas do pool em um tubo de ligação de baixa proteína única.
- Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2B e C). Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.
6. afinidade purificação por anticorpo Anti-H3K4me3 e reticulação reversa
Nota: A seguinte do grânulo preparação que etapas (6,1-6,4) devem ser executadas antes passo 5.7.
- Pipete 40 µ l de grânulos magnéticos conjugada com anti-rato ovelhas IgG em um tubo de 2 mL-emperramento da proteína baixa.
- Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e misture suavemente. Repita este passo (duas lavagens no total).
- Adicione 4 µ l de anticorpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL e girar para 6 h a 4 ° C.
- Lave os grânulos 6.2 passo a seguir. Coloque as contas em um tubo de ligação de baixa 2 mL-proteína.
- Resuspenda as contas em 1558 µ l de tampão RIPA e adicione 200 µ l de 10x bloqueando reagente, 40 µ l de solução do Denhardt de 50x, 2 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 200 µ l do eluato preparado no passo 5.7. Rodar a noite a 4 ° C.
Nota: O SDS em tampão de eluição do ChIP foi diluído 10 vezes mais nesta incubação. - Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita essa etapa 4 vezes (5 lavagens no total). Após a última lavagem, transferir as contas para um tubo de ligação baixa de DNA e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi o eluato para um novo bindingTube baixa de DNA.
Nota: O eluato pode ser armazenado a-80 ° C. - Siga o passo 4 para decrosslinking do DNA. Resuspenda o DNA purificado em 20 µ l de tampão TE.
- Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2D). (opcional) Realizar análise de enriquecimento por PCR quantitativo conforme descrito anteriormente,2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.
7. Biblioteca construção
- Para cada entrada e ChIP de DNA, calcule a proporção de DNA na região de 100-500-bp, usando a função de análise do esfregaço do software para a máquina de electroforese microfluidic. Estimar o volume de amostra necessário para obter 2 ng de 100-500 bp DNA. Use 20 ng DNA na faixa de 100-500-bp como o exemplo de "entrada".
- Pipetar amostras de DNA polimerase 8-faixa e adicione H2O para trazer o volume total de 10 µ l. (opcional) se o volume de DNA excede 10 µ l, aumentar proporcionalmente a seguinte reação final-reparação e a seleção de tamanho.
- Preparar mistura de mestre final-reparação (ver Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l do mix mestre final-reparação do DNA e incube por 30 min a 20 ° C.
- Adicione 36 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 e 0,6 x volume (30 µ l) de sólido fase grânulos magnético reversível imobilização (SPRI) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
- Transferir o sobrenadante para um tubo novo, adicione 1,2 x volumes (60 µ l) de grânulos magnéticos SPRI e incubar 5 min à temperatura ambiente.
- Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
- Lave os grânulos duas vezes com 200 µ l de 80% EtOH, segurando o tubo ainda sobre o ímã.
- Brevemente, centrifugar o tubo para coletar o EtOH residual na parte inferior e colocá-lo de volta sobre o ímã. Remova o residual EtOH completamente.
- Deixe a tampa do tubo aberto para 1-2 min permitir que o EtOH evaporar.
- Feche a tampa e mantenha o tubo no gelo.
Nota: Agora você obteve DNA tamanho selecionado de 100-500 bp sobre os grânulos. Mais detalhes sobre a seleção de tamanho duplo podem ser encontrados no site do fabricante (www.beckman.com). - Preparar A-tailing mestre mistura (veja a Tabela de materiais).
- Resuspenda os grânulos (de passo 7.10) com 10 µ l de mistura de mestre A-tailing e incube por 30 minutos a 30 ° C.
- Adicionar 1,8 x volume (18 µ l) de polietileno glicol (PEG) / solução de NaCl e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Siga os passos 7,7-7.11 para purificar o DNA.
- Preparar a mistura de tampão de ligadura (ver Tabela de materiais).
- Pipetar 8 µ l de mistura de tampão da ligadura para os grânulos (de passo 7.14), adicione 1 µ l de 1 adaptador µM e ressuspender os grânulos. Use 1 µ l de adaptador de 5 µM para o exemplo de entrada. Considere o uso de adaptadores diferentes para cada amostra de multiplexação.
- Acrescente 1 µ l de DNA Ligase e incube por 15 min a 20 ° C.
- Adicionar 1,0 x volume (10 µ l) da solução de NaCl/PEG, resuspenda os grânulos e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
- Pipetar 25 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
- Adicionar 1,0 x volume (25 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
- Pipete 11 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
- Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
- Recolha o sobrenadante para um tubo de PCR 8-faixa novo.
- Preparar a mistura de mestre PCR em tempo real (ver materiais para obter detalhes).
- Pipete 8,5 µ l de mistura de mestre de PCR em tempo real em um prato PCR (qPCR) 384-bem quantitativa e adicionar 1,5 µ l do adaptador ligado DNA (da etapa 7.26).
- Pipete 10 µ l de cada padrão fluorescente em poços vazios.
- Realizar o PCR em tempo real com o seguinte programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, e (72 ° C por 60 s) x 1 ciclo.
- Determine o número de ciclos PCR necessária para atingir a intensidade de fluorescência da fluorescente padrão 2.
- Preparar o mestre PCR mistura (veja a Tabela de materiais).
- Pipetar 11,5 µ l do mix mestre PCR no DNA restante (da etapa 7.26) adaptador-ligados e realizar PCR conforme indicado no passo 7: 30h com os ciclos PCR determinados em 7.31 da etapa.
- Adicionar 1,0 x volume (20 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.
- Pipetar 20 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.
- Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.
- Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa 1,5 mL-DNA novo.
- Verifica a qualidade da biblioteca conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2E e F). Use 1 µ l de amostra de DNA da biblioteca. (opcional) Realizar análise de enriquecimento por qPCR conforme descrito anteriormente, 2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.
8. sequenciamento
- Sequenciar as bibliotecas em um sequenciador de próxima geração (ver dados representativos, mostrados na Figura 3).
Nota: A profundidade de sequência suficiente para a análise de dados pode variar dependendo do tamanho do genoma do organismo3. Para o ser humano e rato, nós recomendamos a obtenção de pelo menos 20 milhões de único-extremidade leituras. De acordo com o rendimento de leituras, multiplexação pode ser rentável.
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Representative Results
Aqui, descrevemos a dissecção de tecidos, fixação, lysis da pilha, purificação em tandem da cromatina e preparação de biblioteca de DNA por sequenciadores de última geração. Durante os procedimentos, pode-se testar a qualidade do DNA, que é a chave para o sequenciamento de sucesso, em várias etapas (Figura 2). Desde uma única nucleossoma é tipicamente rodeada por 147 bp DNA 4, DNA cortado não deve ser inferior esse tamanho. Imediatamente após ultrasonication, o DNA foi isolado e executado em uma máquina de electroforese microfluidic (Figura 2A). Apesar dos nossos esforços para otimizar a escala de tamanho, ainda tínhamos uma população de DNA (aproximadamente 2 kbp) que permaneceu unsheared. Neste passo, a fração de DNA variando de 100-500 bp deve ser 50% ou mais da população. Após a purificação da afinidade do anticorpo anti-FLAG (Figura 2B) e, depois, anticorpo anti-H3K4me3 (Figura 2D), a qualidade do DNA isolado foi verificada novamente usando a máquina de electroforese microfluídicos e a quantidade de DNA que variam de 100-500 bp foi estimado. Embora muitas vezes observamos um forte viés para 2 fragmentos kbp neste passo, dobro a seleção de tamanho de grânulos magnéticos SPRI removido dessa fração.
A especificidade da imune-purificação de DNA H2B-bandeira foi confirmada com as amostras de controlo negativo, no qual cérebro lisado de ratos sem H2B-bandeira expressão foi usada (Figura 2). Normalmente detectamos a presença de quantidades de DNA de amostras de controlo negativo.
Seguindo A-tailing, ligadura de adaptador e PCR, verificou-se a qualidade da biblioteca de sequenciamento (Figura 2E). Normalmente, 250-600 bp DNA foi obtido. O ChIP regular bem sucedida e tChIP foram evidenciado pela análise de enriquecimento com qPCR2 usando as primeiras demão alvejando a região promotora do gene da GAPDH (Figura 2F).
Representante ler distribuições ao longo de genes do neurônio (Camk2a, Slc17a7 e Gria1) pelo genoma-navegador são mostradas na Figura 3. Observou-se o enriquecimento de leituras na extremidade 5 ' de genes por neurônio tChIP-Seq ao longo de todo o cérebro tChIP-Seq.
Figura 1: representação esquemática de Seq. tChIP Esta figura foi modificada de Mito, M. et al. 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: verificação da qualidade DNA. (A, B, De) Electroferograma obtida usando uma máquina de electroforese microfluidic para cromatina cortada (A), de DNA DNA purificado com anticorpo anti-FLAG (B) e anticorpo anti-H3K4me3 (C) e a biblioteca final (D). Os picos destacados com números de verdes e roxos representam padrões de tamanho interno. Azuis linhas tracejadas indicam as regiões de tamanho de DNA consideradas para análise a jusante. FU: unidades fluorescência.
(C) a quantidade de DNA recuperado por anti-FLAG imune-purificação. Cada ponto representa uma replicação independente. (F) análise de enriquecimento por qPCR direcionamento GAPDH. Cada ponto representa uma replicação independente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ler distribuições no neurônio tChIP-Seq. (A-C) Distribuições de leitura ao longo de genes representativos de neurônio em neurônio tChIP-Seq e controle todo o cérebro tChIP-Seq são mostradas. RPM: leituras por milhões leituras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso protocolo foi otimizado para os neurônios do cérebro do rato, em que a expressão da bandeira-tag H2B é induzida pela injeção de tamoxifeno. Promotores utilizados para H2B expressão, matérias-primas tecido e a quantidade dos tecidos são parâmetros cruciais para sucesso tChIP-Seq Assim, a otimização desses fatores deve ser considerada para cada tipo de célula de interesse.
Um passo crítico entre os procedimentos utilizados neste protocolo é o DNA de tosquia para atingir um comprimento de cromatina de 100-500 bp5. Em geral, a padronização da etapa ultrasonication é um desafio desde que muito depende de uma variedade de fatores; condições de fixação, os tecidos utilizados, os equipamentos utilizados para ultra-sonication e o equipamento, definindo, entre outros. Portanto, otimização de tentativa e erro desta etapa de corte de DNA serão necessária para as experiências individuais. Em vez de ultra-sonication, tratamento de nuclease micrococcal deve ser uma opção para isolar o DNA nucleossoma tamanho único, como usado no ingênuo ChIP método6. Embora a homogênea distribuição de tamanho de DNA é ideal, cortado DNAs podem mostrar as várias populações, como mostrado na Figura 2A. A seleção de tamanho duplo de grânulos magnéticos SPRI, conforme descrito acima, ajuda a remover o mais longo de tamanho de fragmentos de DNA.
Normalmente, a preparação de biblioteca requer 1 ng de 100-500 bp DNA. Baseia-se esta exigência, nós dimensionado o material inicial do tecido do cérebro para os neurônios. No entanto, este procedimento pode ser desafiador para extremamente pequenas amostras dos tipos de células raras. Em tais casos, a atividade mental de ChIP, que é baseado no Tn5 transposase ao invés de ligase e requer menos material7, pode ser melhor alternativa.
No entanto, este protocolo atual é limitado para os tipos de células grandes no material. Em nossas mãos, ocupação de 10% das células alvo na população de célula original fornecido justa purificação da cromatina de alvo células1. No entanto, se destinam-se ainda mais tipos de células raras, melhor otimização de imunoprecipitação pela marca epítopo será garantida para distinguir o DNA isolado de DNA contaminado de células não-alvo. Por melhores práticas de análise dos dados, recomendamos comparar os dados para a análise do controle tChIP-Seq no tecido inteiro usado para iniciar o experimento. Desde que encontramos significativos preconceitos de forma exógena expressa proteína H2B-bandeira, a análise deve ser comparada e analisada pelo enriquecimento (ou redução) para o fundo1. Para este controle, na verdade criou uma linha de rato com H2B ubiquitously expressa-bandeira (RosaH2B-bandeira) e executada tChIP-Seq1. Uma interpretação mais detalhada dos dados tem sido discutido previamente1.
Com base em nossa análise, a tChIP-Seq H3K4me3 de neurônios fornecido comparável e/ou melhor deteção de genes conhecidos do neurônio-específico do RNA-Seq de neurônios FACS-classificados8 e traduzindo Ribossoma purificação da afinidade (armadilha)-Seq9. Por exemplo, genes conhecidos axônio/dendrito-localizada foram recuperados com eficiência usando neurônio tChIP-Seq.1. Notavelmente, nosso tChIP-Seq não é limitada para a marca do histone associado-promotor, mas também é aplicável a outros vários de modificações do histone10 se os anticorpos estão disponíveis. Além disso, a estratégia de isolar a cromatina por proteínas de histona etiquetado núcleo pode ser usada em outros organismos modelo. Embora aqui usamos o epítopo de bandeira para marcar a proteína histona do núcleo, podem ser aplicadas outras tags. Desde que a fixação de formaldeído a DNA ocorre mais comumente em resíduos de lisina de uma proteína11, uma marca com muitos lisina deve ser evitada para eliminar preconceitos marcando o epítopo. Assim, a abordagem tChIP-Seq deve ser versátil em diversos tecidos ao longo de muitos tipos de contextos em estudos epigenéticos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do laboratório Iwasaki para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26113005 # S.N. e JP17H05679 o S.I.); um subsídio para jovens cientistas (A) (JP17H04998 o S.I.) do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão (MEXT); e as pioneiras projetos "Evolução celular" e todo projeto RIKEN "Doença e Epigenoma" de RIKEN (para S.N. e S.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
