TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Summary

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

Abstract

Regulación epigenética juega un papel central en la expresión génica. Puesto que la modificación de las histonas se descubrió en la década de 1960, sus funciones fisiológicas y patológicas se han estudiado ampliamente. De hecho, la llegada de próxima generación secuenciación profunda e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante anticuerpos de modificación específica de la histona ha revolucionado nuestra visión de la regulación epigenética a través del genoma. Por el contrario, tejidos consisten en típicamente tipos celulares diferentes, y su mezcla compleja plantea desafíos analíticos a investigar el epigenoma en un tipo de célula particular. Para abordar el estado de cromatina tipo específico de célula en forma de genoma, recientemente desarrollamos tándem cromatina inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq), que se basa en la purificación selectiva de la cromatina por las proteínas de histona etiquetado núcleo de célula tipos de interés, seguido por ChIP-seq. El objetivo de este protocolo es la introducción de mejores prácticas de tChIP-SS. Esta técnica proporciona una herramienta versátil para la investigación de tejidos específicos epigenoma en modificaciones de las histonas diversas y organismos modelo.

Introduction

Los tejidos de los animales consisten en tipos de células diferentes. La regulación del gene en cada célula define el tipo de célula. Modificaciones de la cromatina - ADN metilación e histona modificación - ser la base de la especificidad del tipo de la célula de la expresión génica. Así, la medición de la regulación epigenética en cada tipo de célula ha sido deseada, pero ha sido un desafío técnico.

Para investigar la epigenética en un tipo de célula particular, la secuencia de inmunoprecipitación de cromatina tándem (tChIP-Seq) fue recientemente desarrollado ()figura 1)¹. En tChIP, proteína núcleo etiquetado del epítopo de histona H2B se expresa de un promotor de la célula-tipo-específico. Esta característica permite el aislamiento del chromatins de las células de interés, aunque el material comienza a partir de una mezcla de diversos tipos celulares. Siguiente ChIP-Seq, purificación de la cromatina a través de una marca de histonas modificadas y secuenciación profunda generación de aislado ADN, podemos monitorear el estado epigenético del tipo objetivo de la célula en forma de todo el genoma.

Usando esta técnica, hemos investigado recientemente la trimetilación de neurona-específica de la histona H3 proteína en lisina 4 (H3K4me3) marcas. En ese estudio, desarrollamos un ratón knock-in en que C-terminal H2B tagged bandera proteína se expresó sobre recombinación mediada por la Cre (Rosa26^{CAG floxed pA H2B-bandera}). Por cruce con un ratón que poseen el gen Cre-endoplasmic del endoplásmico (ER) bajo el control del promotor CamK2a, la línea de ratón obtenidos induce H2B-bandera en neuronas activas sobre tamoxifeno inyección (Camk2a^H2B-bandera)¹. A partir de cerebro de la línea de ratón establecido, realizamos tChIP-Seq con anticuerpo anti-H3K4me3. Desde marcas H3K4me3 corresponden a menudo a regiones promotoras, podríamos descubrir cientos de mRNAs expresado específicamente en las neuronas¹.

Aquí, describimos un método típico tChIP-Seq que cubre los pasos de la disección del tejido a la construcción de la biblioteca ()figura 1). El objetivo final de este protocolo es compartir nuestras mejores prácticas para la ejecución de tChIP-Seq y la futura aplicación de este método a otros tipos celulares y modificaciones de las histonas.

Protocol

Todos los métodos descritos han sido aprobados por la división de seguridad de RIKEN (H27-EP071) y llevado a cabo con reglamentos y directrices pertinentes.

1. disección del tejido

1. Disecar los tejidos de interés en pequeños pedazos (aproximadamente < 3 mm²) con unas tijeras finas primavera.
   Nota: Fragmentos de tejidos más grandes tardan más tiempo en congelarse, y piezas más pequeñas se transportan a mayores volúmenes de buffer, que pueden afectar los resultados.
2. Añadir los fragmentos de tejido disecado a un recipiente limpio llenado de nitrógeno líquido y recogerlas en tubos con 2 mL (1 pieza por tubo) lleno de nitrógeno líquido.
   Nota: Los tubos con una superficie hidrofílica se recomiendan para este paso.
3. Colocar los tubos a-80 º C durante > 5 min con la tapa abierta para evaporar nitrógeno líquido restante.
   Nota: Después de cerrar la tapa, fragmentos de tejido pueden almacenarse a-80 ° C durante un mes antes de su uso.

2. fijación de la célula

Nota: Para este paso utilizamos un práctico molino criogénico. Puede utilizarse un aparato alternativo.

1. Lugar los 2 mL-proteínas baja de Unión tubos con las muestras de tejido en un estante del hielo de metal enfriada en nitrógeno líquido.
2. Coloque una bala de metal en un 1,5 mL-tubo y frío con nitrógeno líquido. Coloque en el estante del hielo de metal.
3. Abrir el tubo de 2 mL y colocar la bala metal prechilled en el tubo. Cierre la tapa, coloque los tubos de 2 mL en el sostenedor del tubo de un práctico molino criogénico e inmediatamente sumerja el soporte del tubo montado en nitrógeno líquido durante 1 minuto.
4. Inserte el soporte de tubo congelado en el casete externo del práctico molino criogénico y agite vigorosamente 60 veces durante 30 s.
5. Desmontar el soporte del tubo, quitar la bala de metal y prechilled mL tubo lugar el 2 en una muestra de refrigerador a-20 ° C.
6. Coloque la muestra en frío a-20 ° C por 15 min evitar la congelación de fijador en el paso siguiente.
7. Traer la muestra más fresca en el Banco, abra la tapa del tubo y goteo inmediatamente 900 μl de formaldehído al 1% en él. Después de haber efectuado varias veces, transfiera la suspensión a nuevo 2 mL tubo con 900 μl de formaldehído al 1% y solución para 10 min. con rotación suave en una incubadora a 23 º C.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y nocivo.
8. Para detener la reacción de fijación, añada 100 μl de glicina de 2,5 M a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
9. Añadir 1 mL de helado salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces (3 lavados en total).
   Nota: Muestras fijadas pueden ser flash-congelado por nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C.
10. Agregar 500 μl de tampón de lisis 1 (ácido de-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 50 mM 4 (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), w/v glicerol al de 10%, 0.5% w/v NP-40, inhibidor de la proteasa de 0.25% w/v Triton X-100 y 0.1 x cóctel) para la pelotilla, pipeta varias veces y rotar durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Tampón de lisis 1 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.
11. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
12. Añadir 1 mL de tampón de lisis 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA y 0.1 x inhibidor de la proteasa cóctel) para la pelotilla, vortex y rotar durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Tampón de lisis 2 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.
13. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
14. Añadir 800 μl de tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación con inhibidor de la proteasa de la 1 x cóctel a la pastilla y resuspender el precipitado mediante pipeteo.
15. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
16. Añadir 500 μl de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel.
17. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
18. Añadir 1 mL de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel. Proceder inmediatamente al siguiente paso.

3. cromatina de corte

1. Transferir el lisado a un tubo del sonicador y coloque el tubo en un ultrasonicador.
2. Distorsionar la cromatina con los siguientes valores: temperatura: 4 ° C; energía incidente máxima: 175 W; factor de servicio: 10%; ciclos/ráfaga: 200; y tiempo: 2.400 s.
3. Transferir la muestra a un 1,5 mL-proteína vinculante bajo tubo y centrifugar durante 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.
4. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de unión baja de proteína.
   Nota: La muestra puede ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenada a-80 ° C.

4. cheque de calidad de ADN (reticulación inversa)

1. Mezcla 20 μl del lisado y 180 μl de tampón de elución de ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) y 1% w/v sodio dodecil sulfato (SDS)) en un tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Incubar la muestra a 65 ° C en un termociclador durante 6 h con la tapa de Termociclador abierta. Mantenga la tapa del termociclador abierto para evitar excesiva desnaturalización.
   Nota: El tampón de elución de ChIP debe ser filtrado y almacenado a temperatura ambiente antes de usar. Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
2. Añadir 1 μl de 10 mg/mL Rnasa, vortex e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
3. Añadir 6,5 μl de 15 mg/mL proteinasa K, vortex e incubar a 55 ° C durante 60 minutos.
4. Transferencia de la reacción a un tubo de unión baja de ADN, añadir 4 μL de glucógeno de 5 mg/mL y agitar. Luego, añada 200 μL de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de baja obligatoria de ADN. Agregar 200 μL de tampón Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8.0) y 200 mM NaCl) a la solución de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol restante y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante de la primera.
6. Agregar 900 μl de etanol helada e incubar 1 h a-20 ° C.
   Nota: La incubación puede prolongarse hasta 4 - 6 h.
7. Centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
8. Deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de etanol 75% helada a la pelotilla y centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este paso (dos lavados en total).
9. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y secar al aire durante 1 min a temperatura ambiente.
10. Agregar 50 μl de tampón Tris-EDTA (TE) y disolver el ADN por incubar a temperatura ambiente durante 30 min o a 4 ° C durante la noche. Evite un vórtex o pipeteando. Mantenga este ADN como "entrada" y utilizar para la preparación de la biblioteca, si es necesario.
11. Medir la concentración de ADN con un fluorómetro según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales) y la distribución de tamaño con un equipo de electroforesis de microfluidos (ver datos representativos se muestra en la figura de 2A). uso 10 ng o menos ADN para este ensayo.
    Nota: Fragmentos de 100 a 500 pares de bases (bp) deben ser 50% o más de la DNA.

5. purificación de afinidad por los anticuerpos de anti-FLAG

Nota: Para la neurona tChIP-Seq, los tejidos del cerebro de 8 ratones se utilizan típicamente para una muestra de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado por tándem inmune-purificación (ver paso 7.1). En nuestras manos, 0,1 ng de DNA todavía proporcionado alta calidad bibliotecas de ADN para ChIP-Seq (peores, inédito). Así, en teoría, un ratón puede ser suficiente para llevar a cabo la neurona tChIP-SS. La cantidad necesaria debe ser optimizada para el tipo de tejidos y células de interés. Para el control negativo del experimento de imumuno-purificación, lisado de ratones sin ninguna expresión de H2B-bandera de tejido cerebral debe ser preparado y utilizado.

1. Pipetee 200 μL de las bolas magnéticas conjugado con inmunoglobulinas de anti-ratón ovejas G (IgG) en un tubo de unión baja a proteínas.
2. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y vortex. Repita este paso (dos lavados en total).
3. Añadir 20 μl del anticuerpo de anti-FLAG 1 mg/mL y rotarla durante 5 h a 4 ° C.
   Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
4. Lavar los granos tras paso 5.2. Coloque los granos en un tubo de 15 mL.
5. Resuspender los granos en 1110 μl de tampón de RIPA y luego agregar 900 μl de 10 x bloqueo reactivo 180 μl de 50 x solución de Denhardt, 10 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 6,8 mL de lisado elaborado en el paso 3. Dividir esta mezcla en 5 tubos de unión baja de proteína. Gire durante 6 h a 4 ° C.
   Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
6. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repita este paso 5 veces (6 lavados en total). Piscina, todos los granos en un tubo de unión baja proteína sola.
7. Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la figura 2B y C). Proceder inmediatamente al siguiente paso.

6. afinidad purificación por anticuerpos Anti-H3K4me3 y reticulación inversa

Nota: El siguiente grano preparación que pasos (6.1-6.4) deben realizarse antes de paso 5.7.

1. Pipeta de 40 μl de bolas magnéticas conjugado anti-ratón ovejas IgG en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.
2. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y mezclar suavemente. Repita este paso (dos lavados en total).
3. Añadir 4 μL del anticuerpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL y rotarla durante 6 h a 4 ° C.
4. Lavar los granos tras paso 6.2. Coloque los granos en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.
5. Suspender los granos en 1558 μl de tampón de RIPA y luego añadir 200 μL de 10 x bloqueo reactivo, 40 μl de 50 x solución de Denhardt, 2 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 200 μL de eluido en paso 5.7. Gire durante la noche a 4 ° C.
   Nota: El SDS en el tampón de elución de la viruta se diluyó más de 10 veces en la incubación.
6. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repetir este paso 4 veces (5 lavados en total). Después del último lavado, transferencia de los granos en un tubo de unión baja de ADN y descarte el sobrenadante.
7. Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir el efluente a un nuevo bindingTube baja de la DNA.
   Nota: El efluente puede ser almacenado a-80 ° C.
8. Siga el paso 4 para decrosslinking de la DNA. Resuspender el DNA purificado en 20 μl de tampón TE.
9. Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2D). (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por PCR cuantitativa como se describió anteriormente². Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.

7. Biblioteca construcción

1. Para cada entrada y ChIP DNA muestra, calcular la proporción de DNA en la región de 100-500-bp usando la función de análisis del borrón de transferencia del software de la máquina de electroforesis de microfluidos. Estimar el volumen de muestra requerido para obtener 2 ng de 100 – 500 bp DNA. Utilice 20 ng de ADN en el rango de 100 – 500-bp como muestra "entrada".
2. Pipetear las muestras de ADN en tiras de 8 tubos PCR y agregar H₂O para llevar el volumen total a 10 μl. (opcional) si el volumen de ADN excede 10 μl, escalado proporcionalmente la siguiente reacción de reparación final y la selección de tamaño.
3. Preparar mezcla master final-reparación (véase Tabla de materiales). Añadir 4 μL de la mezcla principal final de reparación del ADN e incubar 30 min a 20 ° C.
4. Añadir 36 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 y 0,6 x volumen (30 μL) del sólido fase granos magnéticos inmovilización reversible (SPRI) e incube durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, añadir 1,2 volúmenes de x (60 μL) de granos magnéticos de SPRI e incubar 5 min a temperatura ambiente.
7. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
8. Lavar los granos dos veces con 200 μL de 80% EtOH, sujetando el tubo en el imán.
9. Centrifugar brevemente el tubo para recoger el EtOH residual en la parte inferior y coloque en el imán. Extraiga cuidadosamente el EtOH residual.
10. Deje la tapa de tubo abierta durante 1-2 minutos permitir que el EtOH se evapore.
11. Cierre la tapa y mantenga el tubo en hielo.
    Nota: Ahora han obtenido ADN seleccionado de tamaño de 100-500 bp en los granos. Pueden encontrar más detalles acerca de la selección de tamaño doble en la web del fabricante (www.beckman.com).
12. Preparar A tizón master mix (véase Tabla de materiales).
13. Resuspender los granos (de paso 7.10) con 10 μl de la mezcla principal A tizón e incubar 30 min a 30 ° C.
14. Añadir volumen x 1.8 (18 μL) de polietilenglicol (PEG) / solución de NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
15. Siga los pasos 7.7-7.11 para purificar el DNA.
16. Preparar mezcla de tampón de ligadura (véase Tabla de materiales).
17. Pipeta 8 μl de mezcla de tampón de ligadura en los granos (de paso 7.14), añadir 1 μl de adaptador de 1 μm y suspender las cuentas. Use 1 μl de adaptador μm 5 para la muestra de entrada. Considere el uso de adaptadores diferentes para cada muestra de multiplexación.
18. Añadir 1 μl de ADN ligasa e incubar por 15 min a 20 ° C.
19. Añadir 1,0 x volumen (10 μl) de solución de PEG/NaCl, suspender los granos e incubar 5 min a temperatura ambiente.
20. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
21. Pipetear 25 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
22. Añadir 1,0 x volumen (25 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
23. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
24. Pipeta de 11 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
25. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
26. Recoger el sobrenadante en un tubo PCR de nuevo 8-tira.
27. Preparar la mezcla principal de PCR en tiempo real (ver materiales para más detalles).
28. Pipetee 8,5 μl de mezcla principal en tiempo real de PCR en una placa PCR (qPCR) 384-bien cuantitativa y añadir 1,5 μl del adaptador ligarse DNA (de paso 7,26).
29. Pipetear 10 μl de cada norma fluorescente en los pocillos vacíos.
30. Realizar PCR en tiempo real con el siguiente programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, y (72 ° C durante 60 s) x 1 ciclo.
31. Determinar el número de ciclos PCR necesarios para alcanzar la intensidad de fluorescencia de los fluorescentes estándar 2.
32. Preparar al maestro de la PCR (véase Tabla de materiales) de la mezcla.
33. Pipetee 11.5 μl de la mezcla principal de PCR en el restante ADN ligada adaptador (de paso 7,26) y realizar la PCR como se indica en el paso de las 7: 30 con los ciclos PCR en paso 7.31.
34. Añadir 1,0 x volumen (20 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
35. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
36. Pipetear 20 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
37. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
38. Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL-DNA obligatorio bajo nuevo.
39. Compruebe la calidad de la biblioteca como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2E y F). Use 1 μl de la muestra de ADN de la biblioteca. (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por qPCR como se describió anteriormente ². Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.

8. la secuencia

1. Las bibliotecas en un secuenciador de última generación de la secuencia (ver datos representativos se muestra en la figura 3).
   Nota: La profundidad de secuencia suficiente para el análisis de datos variará dependiendo del tamaño del genoma del organismo³. Para el ser humano y ratón, se recomienda obtener al menos 20 millones de solo-fin Lee. Según la producción de Lee, multiplexación puede ser rentable.

Representative Results

Aquí, describimos la disección del tejido, fijación, lisis celular, purificación del tándem de cromatina y preparación de biblioteca de DNA para secuenciadores de última generación. Durante los procedimientos, uno puede probar la calidad de la DNA, que es la clave para la secuencia del éxito, en varios pasos (figura 2). Puesto que un nucleosoma solo es rodeada típicamente por 147 bp DNA ⁴, esquilado ADN no debe ser menor que el tamaño. Inmediatamente después de ultrasonidos, el ADN fue aislado y ejecutar en un equipo de electroforesis de microfluidos (figura 2A). A pesar de nuestros esfuerzos para optimizar el rango de tamaño, todavía teníamos una población de ADN (aproximadamente 2 kbp) que permaneció sin esquilar. En este paso, la fracción de ADN que van desde 100-500 bp debe ser 50% o más de la población. Después de la purificación de la afinidad de anticuerpos de anti-FLAG (figura 2B) y anticuerpo anti-H3K4me3 (Figura 2D), se comprobó la calidad del ADN aislado otra vez con la máquina de electroforesis de microfluidos y la cantidad de ADN que van desde 100-500 bp estimó. Aunque a menudo se observa un fuerte sesgo hacia 2 fragmentos de kbp en este paso, doble la selección del tamaño de granos magnéticos SPRI había quitado esta fracción.

La especificidad de inmune-purificación de la DNA en H2B-bandera fue confirmada con las muestras control negativo, en que cerebro lisado de ratones sin bandera H2B expresión fue utilizada (figura 2). Por lo general detectamos insignificantes cantidades de ADN de las muestras control negativo.

Siguiendo A tizón, ligadura de adaptador y PCR, se verificó la calidad de la biblioteca de la secuencia (Figura 2E). Por lo general, 250-600 bp DNA fue obtenido. El ChIP regular éxito y tChIP fueron evidenciados por el análisis del enriquecimiento con qPCR² usando las cartillas dirigidas a la región promotora del gen GAPDH (figura 2F).

Representante Lea distribuciones a lo largo de los genes de la neurona (Camk2a, Slc17a7 y Gria1) por genoma-browser se muestran en la figura 3. Se observó el enriquecimiento de Lee en el extremo 5′ de genes por neurona tChIP-Seq sobre todo el cerebro tChIP-Seq.

Figura 1: representación esquemática de los tChIP-siguientes Esta figura ha sido modificada desde el Mito, M. et al. ¹. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: control de calidad de ADN. (A, B, Dy E) Electroferograma obtenido usando una máquina de electroforesis de microfluidos para esquilado cromatina ADN (A), ADN purificado con anticuerpo anti-FLAG (B) y anticuerpo anti-H3K4me3 (C) y la biblioteca final (D). Los picos con números verdes y morados representan estándares del tamaño interno. Las líneas punteadas azules indican las regiones del tamaño de ADN consideradas para análisis posterior. FU: unidades de fluorescencia.
(C) la cantidad de ADN recuperado por inmune anti-FLAG-purificación. Cada punto representa una repetición independiente. (F) análisis de enriquecimiento por qPCR a GAPDH. Cada punto representa una repetición independiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: leer las distribuciones en neurona tChIP-siguientes (A-C) Se muestran distribuciones de lectura a lo largo de genes representativos de neurona en neurona tChIP-Seq y control total del cerebro tChIP-Seq. RPM: Lee por millones Lee. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Nuestro protocolo se ha optimizado para las neuronas del cerebro de ratón, en el que la expresión de tagged bandera H2B es inducida por inyección de tamoxifeno. Promotores para expresión H2B, partida materiales de tejido y la cantidad de los tejidos son parámetros fundamentales para éxito tChIP-SS. Por lo tanto, la optimización de estos factores debe considerarse para cada tipo de célula de interés.

Un paso fundamental entre los procedimientos utilizados en el presente Protocolo es el ADN de corte para lograr una longitud de cromatina de 100-500 bp⁵. En general, la normalización del paso de ultrasonidos es difícil ya que depende altamente de una variedad de factores; condiciones de fijación, los tejidos utilizados, el equipo usado para ultra-sonicación y el equipo de ajuste, entre otros. Por lo tanto, ensayo y error optimización de este paso de corte de ADN será necesario para los experimentos individuales. En lugar de ultra-sonicación, nucleasa micrococcal tratamiento debe ser una opción para aislar ADN nucleosoma-tamaño único, según lo utilizado en el ChIP ingenuo método⁶. Aunque la homogénea distribución del tamaño de ADN es ideal, esquilada DNAs pueden mostrar varias poblaciones, como se muestra en la figura 2A. La selección de tamaño doble de bolas magnéticas de SPRI, como se describe anteriormente, ayuda a eliminar el mayor tamaño de fragmentos de ADN.

Por lo general, preparación de la biblioteca requiere 1 ng de 100-500 bp DNA. Basándose en este requisito, hemos aumentado el material inicial del tejido cerebral de las neuronas. Sin embargo, este procedimiento puede ser un reto para las muestras extremadamente pequeñas de tipos raros de la célula. En tales casos, sensorio de la viruta, que se basa en Tn5 transposasa en vez de ligasa y requiere menos material⁷, puede ser la mejor alternativa.

Sin embargo, este protocolo actual se limita a los tipos de células principales en el material. En nuestras manos, 10% de ocupación de células específicas en la población de la célula original había proporcionado justa purificación de la cromatina de las células de destino¹. Sin embargo, si se apuntan incluso más tipos raros de la célula, entonces optimización fina de inmunoprecipitación de la etiqueta del epítopo estará garantizada para distinguir el ADN aislado de ADN contaminado de orientada a no células. Para las mejores prácticas del análisis de datos, le recomendamos comparar los datos para el análisis de control tChIP-Seq del tejido entero utilizado para iniciar el experimento. Puesto que encontramos sesgos significativos de proteína exógena expresada H2B-bandera, el análisis debe en comparación y analizado por el enriquecimiento (o agotamiento) para el fondo¹. Para este control, de hecho creó una línea de ratón ubicuo expresada H2B-bandera (Rosa^{Bandera H2B}) y realiza tChIP-Seq¹. Una interpretación más detallada de los datos ha sido discutido previamente¹.

Basado en nuestro análisis, el H3K4me3 tChIP-Seq de neuronas siempre comparable o mejor detección de genes conocidos de neurona-específica de RNA-Seq de neuronas ordenadas FACS⁸ y la traducción de purificación afinidad del ribosoma (trampa)-Seq⁹. Por ejemplo, genes conocidos de axon/dendrita-localizados fueron recuperados eficientemente usando la neurona tChIP-Seq¹. Notable, nuestro tChIP-Seq no es limitada para la marca de las histonas asociadas promotor pero también es aplicable a otros varios histona modificaciones¹⁰ si los anticuerpos están disponibles. Además, la estrategia de aislar la cromatina por las proteínas de las histonas core etiquetado puede utilizarse en otros organismos modelo. Aunque aquí utilizamos el epitopo de bandera para la proteína de histonas de la base de la etiqueta, se pueden aplicar otras etiquetas. Desde fijación formaldehído al ADN ocurre más comúnmente en los residuos de lisina de una proteína¹¹, debe evitarse una etiqueta con muchos lisina para eliminar sesgos por el epitope tagging. Así, el enfoque tChIP-Seq debe ser versátil en diversos tejidos a lo largo de muchas clases de contextos en los estudios epigenéticos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region