Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

मॉडलिंग तपेदिक में माइकोबैक्टीरियम marinum संक्रमित वयस्क Zebrafish

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

यहां, हम एक वयस्क अपने प्राकृतिक रोगज़नक़ माइकोबैक्टीरियम marinumका उपयोग कर zebrafish में मॉडल मानव तपेदिक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । संक्रमित zebrafish के आंतरिक अंगों से निकाले गए डीएनए और आरएनए मछली में कुल माइक्रोबैक्टीरियल भार और qPCR के साथ मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक वर्तमान में घातक मानव रोगज़नक़ के कारण १,७००,००० मौतें और १०,४००,००० संक्रमण हर साल है । इस जीवाणु के लिए जोखिम एक निष्फल संक्रमण से एक सक्रिय रूप से प्रगति घातक रोग को लेकर मनुष्यों में एक व्यापक रोग स्पेक्ट्रम का कारण बनता है । सबसे सामांय रूप अव्यक्त तपेदिक है, जो स्पर्शोन्मुख है, लेकिन एक अचानक रोग में पुनः सक्रिय करने की क्षमता है । वयस्क zebrafish और उसके प्राकृतिक रोगज़नक़ माइकोबैक्टीरियम marinum हाल ही में तपेदिक के व्यापक रोग स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए एक लागू मॉडल साबित हो गया है । महत्वपूर्ण बात, सहज विलंबता और reactivation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के संदर्भ में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं इस मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम वयस्क zebrafish के प्रयोगात्मक संक्रमण के लिए तरीकों का वर्णन, माइक्रोबैक्टीरियल भार की माप के लिए न्यूक्लिक एसिड की निकासी के लिए आंतरिक अंगों के संग्रह और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की मेजबानी । घर में विकसित, एम marinum-विशिष्ट qPCR परख पारंपरिक चढ़ाना तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील है क्योंकि यह भी गैर विभाजन, निष्क्रिय या हाल ही में मृत आइसोलेटों से डीएनए का पता लगाता है । के रूप में दोनों डीएनए और आरएनए एक ही व्यक्ति से निकाले जाते हैं, यह रोगग्रस्त राज्य के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए संभव है, और मेजबान और रोगज़नक़ जीन-अभिव्यक्ति. तपेदिक के लिए वयस्क zebrafish मॉडल इस प्रकार एक अत्यधिक लागू, गैर स्तनधारी vivo प्रणाली में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रस्तुत करता है ।

Introduction

Zebrafish (ढाणियो rerio) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पशु मॉडल है और यह आम हड्डीवाला जीवविज्ञान के लिए एक स्वीकृत मॉडल है । zebrafish के कई क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया गया है अनुसंधान मॉडलिंग मानव रोगों और कैंसर से लेकर विकारों1 और हृदय रोग2 से संक्रमण और प्रतिरक्षा अध्ययन के कई बैक्टीरियल 3 और वायरल संक्रमण4 , 5. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण के पूर्व utero विकास zebrafish6 और विषविज्ञान7,8में एक लोकप्रिय मॉडल बना दिया है ।

संक्रमण जीव विज्ञान सहित अनुसंधान के कई क्षेत्रों में, ऑप्टिकली पारदर्शी zebrafish लार्वा सामांयतः उपयोग किया जाता है । पहली प्रतिरक्षा कोशिकाओं 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf), जब आदिम मैक्रोफेज9का पता चला रहे है के भीतर दिखाई देते हैं । न्यूट्रोफिल अगले प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ३३ hpf10के आसपास प्रदर्शित कर रहे हैं । Zebrafish लार्वा संक्रमण की प्रारंभिक अवस्था और अनुकूल प्रतिरक्षा कोशिकाओं11के अभाव में जन्मजात उन्मुक्ति की भूमिका के अध्ययन के लिए इस प्रकार व्यवहार्य हैं । हालांकि, अपनी पूरी तरह कार्यात्मक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ वयस्क zebrafish संक्रमण प्रयोगों के लिए जटिलता की एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है । टी कोशिकाओं के आसपास का पता लगाया जा सकता है 3 दिन बाद निषेचन12, और बी कोशिकाओं को 4 सप्ताह के बाद निषेचन13कार्यात्मक एंटीबॉडी का उत्पादन कर रहे हैं । वयस्क zebrafish स्तनधारी सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के सभी मुख्य समकक्षों है । मछली और मनुष्यों की प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मुख्य अंतर एंटीबॉडी isotypes में पाया जाता है और साथ ही लसीकावत् ऊतकों के शरीर रचना विज्ञान में । zebrafish केवल तीन एंटीबॉडी कक्षाएं14है, जबकि मनुष्य पांच15है । अस्थि मज्जा और लिम्फ नोड्स के अभाव में, मछली में प्राथमिक लसीकावत् अंगों गुर्दे और थाइमस16 और तिल्ली, गुर्दे और पेट माध्यमिक लसीकावत् अंगों17के रूप में सेवा कर रहे हैं । इन मतभेदों के बावजूद, अपनी जंमजात और अनुकूली कोशिकाओं के पूर्ण प्रतिरक्षा शस्त्रागार के साथ, वयस्क zebrafish एक उच्च लागू है, आसान करने के लिए उपयोग करते हैं, गैर स्तनधारी मॉडल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत अध्ययन के लिए ।

zebrafish हाल ही में तपेदिक के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है18,19,20,21,22। तपेदिक माइकोबैक्टीरियम तपेदिककी वजह से एक हवाई रोग है । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, तपेदिक २०१६ में१.७ लाख लोगों की मृत्यु हुई और एक भी रोगज़नक़ दुनिया भर में23द्वारा मौत का प्रमुख कारण है । 24चूहों,25, खरगोशों26 और गैर मानव रहनुमाओं27 तपेदिक अनुसंधान में सबसे प्रसिद्ध पशु मॉडल हैं, लेकिन प्रत्येक अपनी सीमाओं का सामना । गैर एम तपेदिक संक्रमण के मानव रहनुमा मॉडल मानव रोग सबसे निकट जैसा दिखता है, लेकिन इस मॉडल का उपयोग कर गंभीर नैतिक विचारों के कारण सीमित है । अन्य पशु मॉडल रोग विकृति को प्रभावित करता है कि एम. तपेदिक की मेजबान विशिष्टता द्वारा रुकावट हैं । शायद मॉडलिंग तपेदिक में सबसे बड़ा मुद्दा मानव रोग में संक्रमण और रोग के परिणामों की व्यापक स्पेक्ट्रम है: तपेदिक एक बहुत ही विषम रोग से लेकर अव्यक्त, सक्रिय और सक्रिय संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा है28 , जो पुन: पेश करने के लिए और मॉडल प्रयोग मुश्किल हो सकता है ।

माइकोबैक्टीरियम marinum M. तपेदिक के एक करीबी रिश्तेदार ८५% एमिनो एसिड पहचान29के साथ ~ ३,००० orthologous प्रोटीन के साथ है । M. marinum स्वाभाविक रूप से संक्रमित zebrafish उत्पादन granulomas, तपेदिक की पहचान, अपने आंतरिक अंगों में19,30. अन्य पशु मॉडलों के विपरीत तपेदिक अनुसंधान में इस्तेमाल किया, zebrafish कई वंश पैदा करता है, यह केवल एक सीमित स्थान की आवश्यकता है और महत्वपूर्ण बात, यह neurophysiologically है सबसे कम विकसित हड्डीवाला तपेदिक मॉडल उपलब्ध है । इसके अतिरिक्त, एम. marinum संक्रमण अव्यक्त संक्रमण का कारण बनता है, सक्रिय रोग या वयस्क zebrafish में माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण की भी नसबंदी बारीकी से मानव क्षय रोग के परिणामों के स्पेक्ट्रम की नकल उतार19, 31 , ३२. यहां, हम पेट गुहा में एम marinum इंजेक्शन द्वारा वयस्क zebrafish के प्रायोगिक तपेदिक मॉडल के लिए तरीकों का वर्णन और मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करने के लिए माइक्रोबैक्टीरियल भार और zebrafish से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मापने ऊतक के नमूने ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

फिनलैंड (ESAVI/8245/04.10.07/2015) में पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा सभी zebrafish प्रयोगों को अनुमोदित किया गया है । विधि अधिनियम (497/2013) और फिनलैंड में वैज्ञानिक या शैक्षिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर सरकार डिक्री (564/2013) के अनुसार किया जाता है ।

1. संवर्धन की माइकोबैक्टीरियम marinum

नोट: चूंकि माइकोबैक्टीरियम marinum एक रोगज़नक़ मनुष्यों में सतही संक्रमण पैदा करने में सक्षम है, इस जीवाणु के साथ काम शुरू करने से पहले निजी सुरक्षा और जोखिम अपशिष्ट निपटान के लिए स्थानीय दिशा निर्देशों का पता लगाएं ।

  1. संस्कृति एम. marinum एक 7H10 प्लेट पर 10% OADC (ओलिक एसिड, एल्ब्युमिन, डेक्सट्रोज, catalase) संवर्धन और ०.५% वी/वी के साथ पूरक के रूप में 29 डिग्री सेल्सियस से कम 5 दिनों के लिए ग्लिसरॉल । हर दो सप्ताह फ्रीजर से ताजा जीवाणु लेने और एक नई थाली पर स्थानांतरित करके एम marinum संस्कृतियों को बनाए रखने के हर दूसरे सप्ताह ।
    नोट: M. marinum एक प्राकृतिक मछली रोगज़नक़ जलीय प्रजातियों को संक्रमित है और यह जीवाणुओं के साथ zebrafish स्टॉक दूषित करने के लिए नहीं सावधानियों लेने के लिए महत्वपूर्ण है । जीवाणुओं से प्रदूषित संक्रमित zebrafish और वस्तुओं को प्रजनन सुविधाओं से पृथक रखना होगा ।
  2. एक बाँझ 1-µ l टीका पाश का उपयोग aseptically के एक looped हस्तांतरण करने के लिए एम. एक कोशिका संस्कृति कुप्पी में marinum बैक्टीरियल जन 10% ADC (एल्ब्युमिन, डेक्सट्रोज, catalase) संवर्धन के साथ 7H9 मध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त, ०.२% वी/वी polysorbate ८० और ०.२% v/ ग्लिसरॉल. 3 के लिए संस्कृति-4 दिन लगभग एक आयुध डिपो६०० (०.७ की ऑप्टिकल घनत्व) 29 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में मिलाते हुए बिना । ढीला टोपी छोड़ दो, या एक फिल्टर कैप का उपयोग करने के लिए, गैसों के पर्याप्त आदान प्रदान के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: Polysorbate ८० बैक्टीरिया के एकत्रीकरण को रोकने के लिए माध्यम में जोड़ा जाता है । इसके अलावा, प्रकाश के लिए जोखिम बैक्टीरियल कालोनियों में phenotypic परिवर्तन की ओर जाता है (जैसे, सफेद से पीले रंग में परिवर्तन) । इससे बचने के लिए संस्कृतियों को अंधेरे में रखें ।
  3. एक spectrophotometer के साथ आयुध डिपो६००मूल्य को मापने । तरल संस्कृति को पतला करने के लिए एक आयुध डिपो६०० 0.07-0.09 और 2 दिनों के लिए जारी संवर्धन 29 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में मिलाते हुए बिना । टोपी ढीला छोड़ दें ।
    नोट: इन दो दिनों के दौरान, बैक्टीरियल सस्पेंशन लगभग ०.५ के एक प्रारंभिक लॉग-चरण के लिए इसी के एक आयुध डिपो६००तक पहुंच जाएगा ।

2. वयस्क Zebrafish को संक्रमित करने के लिए बैक्टीरियल सॉल्यूशन तैयार करना

  1. एक बड़ा बाँझ cuvette या एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में बैक्टीरियल निलंबन हस्तांतरण और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में यह जगह सबसे बड़े झुरमुट बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. एक साफ ट्यूब या एक cuvette में निलंबन के शीर्ष 5 – 7 मिलीलीटर स्थानांतरण और आयुध डिपो६००को मापने । संक्रमण के लिए निलंबन के इस शीर्ष चरण का उपयोग करें ।
  3. एक ताजा ट्यूब में एम. marinum संस्कृति के 1 मिलीलीटर लीजिए और १०,००० x gपर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक supernatant निकालें और बाँझ 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  4. एक अनुरेखक के रूप में ०.३ मिलीग्राम/एमएल phenol लाल के साथ बाँझ 1x पंजाबियों का उपयोग करके वांछित बैक्टीरियल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पतला । पतला सस्पेंशन को तीन aliquots में बांट लें ।
    नोट: 5 µ एल इंजेक्शन मात्रा३४में बैक्टीरिया की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने का अनुमान लगाने के लिए एक पूर्व निर्धारित आयुध डिपो६०० बनाम CFU (कॉलोनी बनाने इकाइयों)/µ l वक्र का उपयोग करें । ओडी६०० और बैक्टीरियल सस्पेंशन की एकाग्रता के बीच सहसंबंध वास्तविक संक्रमण प्रयोगों को शुरू करने से पहले मान्य किया जा करने के लिए की जरूरत है । इस मांयता डेटा को एकत्रित करने के लिए दो सप्ताह आरक्षित रखें ।
  5. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, धीरे एक 27 जी सुई 3x के माध्यम से निलंबन खींच. प्रत्येक aliquot के लिए, केवल उपयोग करने से पहले यह चरण निष्पादित करें ।
    नोट: 2 से अधिक एच के लिए एक ही जीवाणु समाधान का उपयोग न करें ।

3. प्रायोगिक एम. marinum Intraperitoneal इंजेक्शन के साथ संक्रमण

  1. parafilm फिल्म के एक टुकड़े पर पतला बैक्टीरियल समाधान की एक 5 µ एल छोटी बूंद पिपेट और एक 30 ग्राम इंसुलिन सुई में छोटी बूंद खींचो ।
  2. प्रयोग के लिए 5-8 माह की पुरानी जंगली किस्म की मछली और rag1 −/− hu1999 उत्परिवर्ती मछली का प्रयोग करें । Anesthetize ०.०२% 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (पीएच ७.०) के साथ टैंक पानी में वयस्क zebrafish । एक नम फोम प्लास्टिक पर एक भट्ठा में मछली ventral पक्ष की स्थिति ।
    नोट: चीर-/ उत्परिवर्ती मछली दैहिक पुनर्संयोजन से गुजरना और कार्यात्मक टी और बी कोशिकाओं का उत्पादन करने में सक्षम नहीं हैं ।
  3. एक लगभग ४५ डिग्री कोण पर श्रोणि पंख के बीच सुई इंजेक्षन । ऊपर की ओर खोल सुई रखने के लिए निरीक्षण है कि पूरे खोलने उदर गुहा के अंदर है । धीरे बैक्टीरियल सस्पेंशन इंजेक्षन और ध्यान से सुई हटा दें ।
    नोट: मामले में लाल अनुरेखक इंजेक्शन पर मछली के बाहर लीक कर रहा है, प्रयोग से मछली को बाहर.
  4. इंजेक्शन के तुरंत बाद, ताजा टैंक पानी के साथ एक वसूली टैंक में मछली हस्तांतरण ।
  5. बैक्टीरियल aliquot से 7H10 प्लेटों पर बैक्टीरियल सस्पेंशन के नमूने का उपयोग में ले लो और 5 दिनों के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया की मशीन और प्लेटों पर कालोनियों गिनती द्वारा संक्रमण खुराक सत्यापित करें ।
  6. अच्छी तरह से मछली की जा रही नियमित रूप से जांच करें और 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (पीएच ७.०) के ०.०२% एकाग्रता के साथ संक्रमण के लक्षणों के साथ किसी भी मछली euthanize ।
    नोट: लगभग, वयस्क zebrafish के 7% ३४ ± 15 CFU और २०२९ ± ७०९ CFU से संक्रमित zebrafish के 30% से संक्रमित 8 सप्ताह19द्वारा लक्षण था होगा । लक्षण असामांय तैराकी शामिल हो सकते हैं, प्रतिक्रिया की कमी को छूने के लिए, हांफते, सूजन या चौकस बर्बाद कर ।
  7. ३५आम मानकों के अनुसार zebrafish बनाए रखें ।

4. आंतरिक अंगों का संग्रह

  1. Euthanize 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर की अधिक मात्रा के साथ zebrafish टैंक पानी में (०.०२% एकाग्रता, पीएच ७.०) ।
  2. डालें एक branchiostegal किरणों के पीछे पिन और एक और पूंछ के माध्यम से मंच पर मछली हमले के लिए ।
  3. एक स्केलपेल के साथ पूरे उदर गुहा खोलें और एक छोटी चंमच और तेज समाप्त चिमटी का उपयोग करके आंतरिक अंगों को इकट्ठा । दिल से शुरू करो और एक ब्लॉक में सभी आंतरिक अंगों को अलग करने के लिए पूंछ की ओर रीढ़ के साथ काम करते हैं ।
    नोट: चंमच के साथ रीढ़ की हड्डी के साथ परिमार्जन द्वारा सभी गुर्दे के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  4. अंत में, क्लोअका के बगल में आंत अलग और छह २.८ मिमी सिरेमिक मोतियों के साथ एक १.५ मिलीलीटर homogenization ट्यूब में अंगों हस्तांतरण करने के लिए चिमटी का उपयोग करें । तुरंत सूखी बर्फ पर जगह के लिए नमूना फ्रीज । नमूना-८० ° c homogenized तक संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. व्यक्तियों के बीच ७०% इथेनॉल के साथ उपकरणों कुल्ला ।

5. एक अंग ब्लॉक से Homogenization और आरएनए निष्कर्षण ।

नोट: विधि स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय प्रोटोकॉल३६से संशोधित किया गया है ।

  1. जोड़ें guanidine thiocyanate-phenol न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (सामग्री तालिका) के नमूने के शीर्ष पर १,५०० µ की कुल मात्रा के लिए इस्तेमाल किया समाधान सुनिश्चित करें कि नमूना कुल मात्रा का अधिकतम 10% शामिल है ।
    चेतावनी: फसल ऊतक की उंमीद की मात्रा १०० µ एल Guanidine thiocyanate-phenol समाधान विषाक्त और परेशान यौगिकों शामिल है और सुरक्षात्मक कपड़े, nitrile दस्ताने की आवश्यकता है और एक धुएं डाकू में काम कर रहे । इस विषाक्त गैसों के गठन के कारण होगा के रूप में ब्लीच के साथ गठबंधन नहीं है । उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) पढ़ें ।
  2. Homogenize एक मनका-पिटाई homogenizer ४० के लिए 3 बार का उपयोग कर नमूने ३,२०० rpm पर एस । साइकिल के बीच 30 एस के लिए बर्फ पर ठंडा । Sonicate 9 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में homogenized नमूने ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x जी पर नमूने केंद्रापसारक और एक ताजा microcentrifuge ट्यूब में हाे homogenate के १,००० µ l ले जाएं ।
  4. क्लोरोफॉर्म के २०० µ एल जोड़ें, तुरंत 15 एस और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए गर्मी के लिए भंवर से मिश्रण ।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक विषाक्त और अड़चन यौगिक अगर सांस, निगल लिया या त्वचा या आंखों के साथ संपर्क किया है । एक धुएं डाकू में व्यक्तिगत सुरक्षा और काम के लिए आवश्यक सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें । उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) पढ़ें ।
  5. 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए जलीय और कार्बनिक चरणों अलग करने के लिए केंद्रापसारक ।
  6. ध्यान से, एक ताजा ट्यूब के लिए शीर्ष चरण के ५०० µ एल स्थानांतरण आरएनए प्रदूषित से बचने के लिए. निकालें और जलीय चरण (~ १०० µ एल) के बाकी त्यागें और डीएनए निष्कर्षण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चरण और कार्बनिक चरण की दुकान ।
    नोट: शीर्ष चरण आरएनए शामिल हैं.
  7. जोड़ें ५०० µ एल के 2-propanol और तुरंत मिश्रण के लिए भंवर द्वारा 15 एस. मशीन के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शाही सेना हाला ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x जी पर केंद्रापसारक आरएनए गोली । supernatant को pipetting करके निकाल दें ।
  9. 10 एस के लिए ७५% इथेनॉल और भंवर की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है, और नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रखा ।
  10. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ७,५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को pipetting करके निकाल दें ।
  11. वाश स्टेप 5.9-5.10 दोहराएं । pipetting द्वारा ध्यान से supernatant निकालें और गोली हवा एक धुएं हुड में सूखा ।
  12. nuclease-मुक्त पानी के ५०० µ एल में आरएनए गोली भंग और बर्फ पर नमूने रखने. एक microvolume spectrophotometer के साथ या समकक्ष उपकरणों के साथ सांद्रता को मापने । -८० ° c पर आरएनए की दुकान ।

6. सह निकाली Zebrafish और माइक्रोबैक्टीरियल डीएनए की शुद्धि

  1. एक वापस निष्कर्षण बफर (बेऐब) guanidine thiocyanate के ११८.२ g भंग करके (अंतिम एकाग्रता 4 एम), सोडियम साइट्रेट के ३.६८ ग्राम (अंतिम एकाग्रता ५० मिमी) और Tris मुक्त आधार के ३०.२९ ग्राम (अंतिम एकाग्रता 1 एम) में nuclease के १२० मिलीलीटर-मुक्त पानी (यह मई रात भर सरगर्मी की आवश्यकता) । २५० मिलीलीटर की एक अंतिम कुल मात्रा के लिए nuclease मुक्त पानी जोड़ें और समाधान निष्फल करने के लिए फिल्टर ।
    नोट: यह बफर कमरे के तापमान पर 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । वे हाइड्रोजन क्लोराइड और हाइड्रोजन साइनाइड जैसे विषाक्त गैसों का उत्पादन करने के लिए प्रतिक्रिया के रूप में ब्लीच के साथ बेऐब गठबंधन मत करो ।
  2. माइक्रोबैक्टीरियल डीएनए निकालने के लिए नमूना के चरण और कार्बनिक चरण का उपयोग करें । प्रत्येक ट्यूब के लिए बेऐब के ५०० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर उलटा करके 10 मिनट के लिए बड़े पैमाने पर मिश्रण ।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १२,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और ध्यान से ५०० µ एल स्थानांतरण ऊपरी जलीय चरण एक नई ट्यूब के लिए डीएनए युक्त ।
  4. जोड़ें ४०० μL के 2-propanol । उल्टे और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गर्मी से मिश्रण ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । डीएनए युक्त एक गोली इस बिंदु पर दिखाई जानी चाहिए । सावधानी से supernatant को pipetting से हटा दें ।
  6. ७०% इथेनॉल के ८०० μL जोड़ें । उलटा करके गोली धो लो । इस बिंदु पर नमूने भंवर मत करो, के रूप में जीनोमिक डीएनए आसानी से टूट जाता है ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक और pipetting द्वारा supernatant हटा दें । इथेनॉल धो दोहराएं (६.६ कदम और ६.७) ।
  8. सावधानी से इथेनॉल निकालें pipetting । चलो नमूने हवा के लिए शुष्क 5 – 10 मिनट nuclease के २०० μL में गोली भंग-मुक्त पानी ।
  9. एक microvolume spectrophotometer के साथ या समकक्ष उपकरणों के साथ डीएनए सांद्रता उपाय । डीएनए लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या पर-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

7. मात्रात्मक पीसीआर माइक्रोबैक्टीरियल भार मापने के लिए

  1. marinum प्राइमरों (तालिका 1) के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एम. 16S आंतरिक लिखित स्पेसर के बीच (इसके) के खिलाफ कोई ROX (carboxy-एक्स-rhodamine) के साथ qPCR प्रतिक्रिया घोला जा सकता है तैयार । पिपेट qPCR के लिए उपयुक्त एक ९६-well प्लेट पर डुप्लिकेट के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण और नमूना कमजोर पड़ने. प्रत्येक चलाने में बैक्टीरिया की एक ज्ञात राशि का डीएनए मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला शामिल हैं ।
    नोट: मछली प्रति M. marinum लोड 4 wpi पर १,०००,००० CFU करने के लिए 0 CFU से रेंज कर सकते हैं । qPCR परख भी अंय qPCR किट के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है लेकिन प्राइमरों के लिए एनीलिंग तापमान को फिर से अनुकूलित किया जाना है ।
  2. एक ऑप्टिकली पारदर्शी फिल्म के साथ प्लेट सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २,००० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
  3. तालिका 2में दिखाए गए qPCR प्रोग्राम चलाएं ।
  4. मानक वक्र का उपयोग कर, पूरे मछली के नमूने में बैक्टीरिया की संख्या की गणना ।

8. आरएनए के नमूनों का DNase उपचार

  1. आरएनए से जीनोमिक डीएनए के किसी भी संभावित शेष निशान को दूर करने के लिए, मैं उपचार DNase बाहर ले । आरएनए के नमूने बर्फ पर गल जाते हैं ।
    नोट: केवल RNase मुक्त उपकरण और समाधान का उपयोग करें और काम करने के लिए शुरू करने से पहले एक संदूषण reagent नष्ट करने RNases (सामग्री की तालिका) के साथ काम कर रहे सतह और पोंछ यकीन है । अपने नमूनों की रक्षा के लिए एक लंबी बाजू की लैब कोट और दस्ताने पहनें ।
  2. तैयार 10 μL DNase मैं प्रतिक्रिया निर्माता के निर्देशों के अनुसार बर्फ पर घोला जा सकता है । DNase I का 1 μL, 10x DNase बफर के 1 μL और आरएनए के 1 μL की एक अधिकतम सहित आरएनए नमूना के 8 μg मिश्रण.
  3. धीरे प्रतिक्रियाओं (कोई भंवर) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गर्मी मिश्रण ।
  4. गर्मी-निष्क्रियता से पहले, प्रत्येक 10 µ एल नमूना करने के लिए ५० mM EDTA के 1 µ एल जोड़ें । यदि EDTA नहीं जोड़ा गया है, आरएनए गर्म जब रासायनिक क्षरण से गुजरना होगा ।
  5. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी निष्क्रिय करने के लिए DNase I. सीडीएनए संश्लेषण के लिए सीधे जारी रखें या-८० डिग्री सेल्सियस पर DNase-इलाज आरएनए की दुकान.

9. सीडीएनए संश्लेषण

  1. बर्फ पर सभी रिएजेंट और नमूने रखें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिक्रिया घोला जा सकता है तैयार करते हैं । एक 5 μL प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण के 1 μL, nuclease के 3 μL-मुफ्त पानी और μL इलाज आरएनए के 1 DNase शामिल हैं ।
  2. धीरे उल्टा प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं मिश्रण और संक्षेप में ट्यूब स्पिन, अगर जरूरत है ।
  3. एक पीसीआर मशीन में नमूने प्लेस और 3 तालिकामें दिखाए गए कार्यक्रम का उपयोग करें ।
  4. nuclease में सीडीएनए पतला-qPCR के लिए नि: शुल्क पानी की अधिकतम एकाग्रता के लिए २.५ एनजी/μL, अगर जरूरत है । सीडीएनए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

10. मात्रात्मक पीसीआर द्वारा Zebrafish जीन अभिव्यक्ति को मापने

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बर्फ पर एक qPCR मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रकाश से रक्षा । 1 तालिकामें शुरू की प्राइमरों का प्रयोग करें ।
    नोट: प्रत्येक जीन के लिए प्रेरण की तह की गणना करने के लिए, एक परित की आधारभूत नमूना 6 स्वस्थ zebrafish से निकाले से भी अभिव्यक्ति को मापने ।
  2. प्रत्येक नमूने की प्रतिकृति तैयार करें और प्रतिक्रिया पिपेट एक qPCR प्लेट पर घोला जा सकता है । एक ऑप्टिकली पारदर्शी फिल्म के साथ प्लेट सील और रन शुरू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २,००० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
  3. qPCR (तालिका 1) का उपयोग प्राइमरी जोड़ी के आधार पर एनीलिंग तापमान के साथ तालिका 4 में दिखाया गया प्रोग्राम चलाएँ.
  4. जीन अभिव्यक्ति अनुपात का विश्लेषण एक घर की तुलना में रखने के जीन (loopern4३७) ΔCt समीकरण का उपयोग कर विधि के साथ:
    Equation

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्राकृतिक मछली रोगज़नक़ माइकोबैक्टीरियम marinum zebrafish के आंतरिक अंगों को संक्रमित और19granulomas दिखाई histologically के साथ एक प्रणालीगत संक्रमण पैदा करता है । वयस्क zebrafish एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एम. marinum से संक्रमित हैं । डीएनए और आरएनए निकाले जाते हैं, और माइक्रोबैक्टीरियल लोड मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) द्वारा टेंपलेट के रूप में डीएनए का उपयोग करके मापा जाता है । पद्धति की बाह्यरेखा आरेख 1में दिखाई गई है ।

मछली को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया आइसोलेटों की प्रारंभिक संख्या संक्रमण के परिणाम के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है । एम marinum (~ २,००० CFU) की एक उच्च संक्रमण खुराक एक प्रगतिशील रोग है जिसमें माइक्रोबैक्टीरियल लोड को बढ़ाने के लिए जारी है जब तक औसत बैक्टीरियल लोड ५,०००,००० बैक्टीरिया (आंकड़ा 2a) अंततः मछली की हत्या के आसपास तक पहुंच जाता है । एम. marinum के एक कम खुराक (~ 20-90 CFU) एक रोग स्पेक्ट्रम है कि मानव तपेदिक (चित्रा बी) में देखा के समान के विकास की ओर जाता है । बैक्टीरियल लोड करने के लिए चारों ओर जब तक वृद्धि जारी है 4-7 सप्ताह (चित्रा 2a और 3ए), जिसके बाद मछली के बहुमत में रोग एक स्थिर राज्य तक पहुंचता है । 2 बी चित्रा एक कम खुराक संक्रमण के साथ रोग के परिणामों के वितरण का एक उदाहरण से पता चलता है: संक्रमित zebrafish के बारे में 7% जीवाणु विकास को प्रतिबंधित करने में असमर्थ थे. इन व्यक्तियों को एक प्राथमिक प्रगतिशील बीमारी विकसित की है और वे संक्रमण के बाद दो महीने के भीतर मर गया । व्यक्तियों के लगभग 10% 4 सप्ताह से माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण को मंजूरी दे दी । मछली की आबादी का शेष ६५% स्थिर बैक्टीरियल बोझ के साथ एक अव्यक्त माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण विकसित । हालांकि, संक्रमण के 8 और ३२ सप्ताह के बीच, 18% में, अव्यक्त संक्रमण अनायास रोग की प्रगति के लिए अग्रणी सक्रिय ।

चीर का उपयोग करके -/ उत्परिवर्ती मछली, यह वयस्क मछली में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए संभव है । चीर-/ उत्परिवर्ती मछली पर्याप्त रूप से उच्च बैक्टीरियल लोड करने के लिए अग्रणी आइसोलेटों के विकास को सीमित नहीं कर सकते (आंकड़ा 3ए) और बढ़ी हुई रुग्णता (चित्र बी), स्पष्ट रूप से अनुकूली उन्मुक्ति के महत्व का प्रदर्शन माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण को नियंत्रित. इसके अलावा, माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण में कुछ cytokine प्रतिक्रियाओं पैदा करने में अनुकूली प्रतिक्रियाओं का महत्व इस मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है । यहां, हम बताते है कि अनुकूली प्रतिक्रिया interleukin 4 (IL4) (चित्रा3 सी) के कुशल प्रेरण के लिए आवश्यक है, लेकिन इंटरफेरॉन के प्रेरण के लिए औषधालय है-γ (IFNγ) पर 4 wpi (चित्रा 3d) । इंटरफेरॉन-γ एक cytokine intracellular रोगजनकों के खिलाफ प्रतिक्रिया ड्राइविंग जबकि interleukin 4 extracellular रोगजनकों के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक आम मध्यस्थ है । चीर की तुलना में जंगली प्रकार के समूह में il4 के काफी उच्च अभिव्यक्ति का स्तर -/ उत्परिवर्ती मछली माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण (आंकड़ा 3सी) में महत्वपूर्ण अनुकूली विनोदी प्रतिक्रियाओं को संदर्भित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क zebrafish में माइक्रोबैक्टीरियल भार के विकास का अध्ययन करने के कार्यप्रवाह । वयस्क zebrafish एम. marinumके एक intraperitoneal इंजेक्शन से संक्रमित हैं । डीएनए और आरएनए मछली के आंतरिक अंगों और एम. marinum लोड और मेजबान है प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से निकाला जाता है मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क zebrafish में एम marinum के इंजेक्शन रोग राज्यों की एक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है । (क) Zebrafish को कम (३४ ± १५ CFU) या एम. marinumके उच्च खुराक (२०२९ ± ७०९ CFU) के साथ इंजेक्ट किया गया । 5 मछली के लिए औसत भार (३२ सप्ताह उच्च खुराक को छोड़कर, n = 2) एसडी के साथ दिखाए जाते हैं. कम खुराक आँकड़े: * p < 0.05 1 सप्ताह के साथ तुलना में 1 और 2 सप्ताह के साथ * * p < 0.05. उच्च-खुराक आँकड़े: * * * p < 0.05 की तुलना में 1, 2, 8, 11 और 20 wk. ¤ कम खुराक बनाम उच्च खुराक p < 0.05. Parikka एट अल से संशोधित । २०१२19. (ख) एक जंगली प्रकार zebrafish एम. marinumकी एक कम खुराक से संक्रमित आबादी के भीतर रोग परिणामों की विशिष्ट वितरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अनुकूली प्रतिरक्षा वयस्क zebrafish में माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के पाठ्यक्रम को प्रभावित करता है । वयस्क वाइल्ड-टाइप (wt) और rag1 (−/−) zebrafish कम खुराक से संक्रमित थे (n = 30) of M. marinum. (A) qPCR द्वारा 2, 4 और 7 सप्ताह के बाद संक्रमण (wpi) (n = 10) * P < 0.05 पर औसत माइक्रोबैक्टीरियल लोड मापा गया । (ख) मछली रोग के लक्षण और अस्तित्व के भूखंडों के विकास पर euthanized थे बनाया गया । (C). il4 के व्यंजक स्तरों को 4 wpi पर मापा गया था. (घ) IFNγ के व्यंजक स्तरों को ४ wpi पर मापा गया. (A और B) Parikka एट al. २०१२19से संशोधित । (सी और डी) Hammarén एट अल. २०१४३८से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीन प्राइमरी सीक्वेंस एनीलिंग तापमान
MMITS1 च: CACCACGAGAAACACTCCAA ६५
16S – 23SITS लोकस AB548718 के लिए M. marinum ठहराव R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 च: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT ६१
दोहराए गए तत्व व्यक्त R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
il4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG ५९.५
ZDB-जीन-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ 1-2 च: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, ६१
ZDB-जीन-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

तालिका 1: प्राइमरी जुगाड़ और एनीलिंग तापमान । प्राइमरों के जुगाड़ का इस्तेमाल किया और उनका अनुकूलित एनीलिंग तापमान. एम marinum 16S के लिए प्राइमरों-23S rRNA प्रतिलिपि एक No-ROX qPCR किट और ROX किट सहित एक qPCR के लिए अंय प्राइमरों के लिए अनुकूलित किया गया है ।

चरण समय तापमान
1 3 min ९५ ° c
2 5 एस ९५ ° c
3 10 एस ६५ ° c
4 5 एस ७२ ° c (प्रतिदीप्ति डिटेक्शन)
5 चरण 2 पर जाएं । ३९ बार
6 पिघलने वक्र विश्लेषण 55-95 ° c के साथ 0.5 ° c अंतराल
7 सदैव 4 ° c

तालिका 2: एम marinum डीएनए को मापने के लिए qPCR कार्यक्रम । एक qPCR प्रोटोकॉल निर्माता के निर्देशों के अनुसार डिजाइन और zebrafish नमूनों से एम marinum डीएनए को मापने के लिए अनुकूलित ।

समय तापमान
5 min 25 डिग्री सेल्सियस
30 min ४२ ° c
5 min ८५ ° c
सदैव 4 ° c

तालिका 3: सीडीएनए संश्लेषण कार्यक्रम । निर्माता के निर्देशों के अनुसार संक्रमित zebrafish की निकाली गई आरएनए से synthesizing सीडीएनए के लिए प्रोटोकॉल.

चरण समय तापमान
1 30 एस ९५ ° c
2 12 एस ९५ ° c
3 30 एस एनीलिंग ° c
4 चरण 2 पर जाएं । ३९ बार के लिए
5 वक्र विश्लेषण पिघलने 65 – 95 ° c के साथ ०.५ ° c अंतराल
6 सदैव 4 ° c

तालिका 4: मेजबान के जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए qPCR कार्यक्रम । एक qPCR प्रोटोकॉल निर्माता के निर्देशों के अनुसार डिजाइन और अलग zebrafish जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए अनुकूलित ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ हम एक qPCR आधारित अनुप्रयोग का वर्णन करने के लिए प्रयोगात्मक संक्रमित वयस्क zebrafish ऊतकों से निकाले डीएनए से माइक्रोबैक्टीरियल भार को मापने. इस आवेदन 16S-23S rRNA आंतरिक लिखित स्पेसर अनुक्रम४०के आसपास डिजाइन प्राइमरों पर आधारित है । एक मछली के नमूने में कुल माइक्रोबैक्टीरियल लोड एक मानक आइसोलेटों के एक ज्ञात संख्या से निकाले डीएनए से तैयार वक्र का उपयोग कर अनुमान है और यह मानते हुए कि एक जीवाणु किसी भी समय अपने जीनोम की एक प्रति है । एम. marinum-qPCR की जांच सीमा लगभग १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों18है । पारंपरिक चढ़ाना की तुलना में विधि का एक स्पष्ट लाभ यह है कि दोनों सक्रिय और गैर-विभाजित निष्क्रिय बैक्टीरिया का पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, zebrafish ऊतकों से संस्कृति प्लेटों पर विकास दूषित की एक आम समस्या इस दृष्टिकोण से दरकिनार कर रहा है । हालांकि, के रूप में डीएनए टेंपलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह संभव है कि मापा प्रतियां के कुछ बैक्टीरिया है कि बहुत हाल ही में मर गया है के डीएनए से प्राप्त किया जा सकता है । न्यूक्लिक एसिड आधारित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि दोनों डीएनए और आरएनए के रूप में (के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन, यहां वर्णित नहीं) एक ही व्यक्ति से निकाला जा सकता है, व्यक्ति के माइक्रोबैक्टीरियल लोड दोनों के जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ जोड़ा जा सकता है मेजबान और बैक्टीरिया ।

एम marinum की खुराक संक्रमण के परिणाम का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है । कम एम marinum (~ 20-90 CFU) संक्रमण खुराक सबसे आम रूप के रूप में विलंबता के साथ रोग राज्यों की एक स्पेक्ट्रम का उत्पादन । यदि संक्रमण खुराक हजारों के क्रम में है, एक अधिक प्रगतिशील रोग व्यक्तियों के बहुमत में विकसित करता है । के रूप में प्राकृतिक संक्रामक खुराक के लिए मानव क्षय४१में कम हो जाना जाता है, zebrafish मॉडल में एम marinum की एक कम खुराक का उपयोग कर एक और अधिक प्राकृतिक संक्रमण का उत्पादन होने की संभावना है. सही खुराक तक पहुँचने के लिए, किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले OD600 और कॉलोनी बनाने इकाइयों के बीच संबंध को मान्य करने के लिए सुनिश्चित करें. मढ़वाया संक्रमण खुराक की सामांय भिंनता लगभग 30% है और एक समस्या नहीं माना जाता है । हालांकि, यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि जीवाणु निलंबन के पूरे 5 µ एल मात्रा मछली के अंदर रहता है । इंजेक्शन समाधान की लीक संक्रमण खुराक में अतिरिक्त भिन्नता का कारण होगा । संक्रमण खुराक के अलावा, जीवाणुओं के तनाव रोग प्रगति को प्रभावित कर सकते हैं । इसमें दिखाया गया है कि बेजुबान एम. marinum उपभेदों के डाह के बीच के तनाव को बदल सकते हैं । दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपभेदों ATCC927 है (मछली अलग इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया तनाव) और एम तनाव । हालांकि, इन उपभेदों उनके डाह में बहुत अलग है । मानव-अलग एम तनाव एक और अधिक प्रगतिशील रोग विकसित जबकि मछली अलग तनाव एक मामूली रोग अच्छी तरह से माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण३३के अव्यक्त रूप का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त पैदा करता है । एक तनाव के भीतर बैक्टीरिया का डाह भी बदल सकता है यदि जीवाणु एक संस्कृति से दूसरे में प्रश्नपत्र हस्तांतरित कर रहे हैं, जिसे एक फ्रीजर स्टॉक से ताजा आइसोलेटों लेने से अक्सर काफी रोका जा सकता है.

इन विट्रो संवर्धन धीरे विभाजन की एम. marinum एंटीबायोटिक दवाओं के बिना दूषित होने का खतरा है । इसलिए, बैक्टीरिया की हैंडलिंग सख्त अपूतित एक लामिना प्रवाह हुड में किए गए दृष्टिकोण की आवश्यकता है । संस्कृति में संभावित संदूषण के रूप में बहुत अधिक एक आयुध डिपो६०० मूल्य, अजीब दिखने बैक्टीरियल निलंबन या कालोनियों का पता लगाया जा सकता है । एम marinum कालोनियों आम तौर पर फजी-धार, सपाट और मैट रंग में सफेद कर रहे हैं । M. marinum संस्कृतियों प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और वे पीले रंग का उत्पादन शुरू जब प्रकाश को उजागर । यह पीला वर्णक संक्रमण के बाद अंय बैक्टीरिया से एम marinum कालोनियों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संक्रमण के बाद जल्दी ही मछलियों को मरने की परेशानी हो सकती है । आमतौर पर, एक कम खुराक संक्रमण के पहले लक्षण प्रकट नहीं 3 सप्ताह के बाद संक्रमण और इस समय बिंदु से पहले किसी भी नश्वरता जीवाणु निलंबन या इंजेक्शन के दौरान प्रेरित आघात में संदूषण के कारण की संभावना है ।

वयस्क zebrafish 3-aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर के लिए बहुत संवेदनशील हैं और जोखिम समय बहुत लंबा है या संवेदनाहारी की एकाग्रता बहुत अधिक है, तो जीवित नहीं है । इसलिए, जब संक्रमण, zebrafish अच्छा संज्ञाहरण (~ 1-2 मिनट) को प्राप्त करने के लिए केवल समय की न्यूनतम के लिए संवेदनाहारी को उजागर किया जाना चाहिए. संक्रमण के बाद वयस्क zebrafish को समूहों में २६-२८ डिग्री सेल्सियस पानी के तापमान पर रखा जाता है । यदि तापमान अधिक है या इस से कम है, यह एम marinum विकास दर और संक्रमण के कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकता है । इसके अलावा, टैंक पानी की गुणवत्ता (सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता, नमक एकाग्रता, पीएच, ऑक्सीजन संतृप्ति) एक सफल प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण हिस्सा है । मछली के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए दैनिक और मछली है कि संक्रमण के लक्षण दिखाने के लिए समूह और euthanized से हटा दिया जाना चाहिए की जरूरत है । अगर मछली टैंक में मर जाते हैं, अंय मछली आंत के माध्यम से फिर से संक्रमित हो सकता है, जो संक्रमण की प्रगति को प्रभावित करेगा ।

तपेदिक का आमतौर पर इस्तेमाल किया zebrafish लार्वा मॉडल सहज प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए लागू है, जो मेजबान-सूक्ष्म जीव बातचीत के एक सीमित सबसेट के लिए प्रयोगों को निर्देशित करता है । वयस्क zebrafish का उपयोग यह एक बहुमुखी मॉडल में दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संभव बनाता है18,३२,३९. वयस्क zebrafish खुद को तपेदिक के पूरे स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक हड्डीवाला मॉडल के रूप में प्रस्तुत करता है । एम marinum, मछली की आबादी का 7% के एक कम खुराक जोखिम के साथ प्राथमिक प्रगतिशील रोग का विकास, 10% के लिए संक्रमण बंध्याकरण कर सकते हैं, ६५% अव्यक्त रोग का विकास और 18% में सहज पुनर्सक्रियण होता है (चित्रा 2) । रोग स्पेक्ट्रम बारीकी से मिलता है कि मानव तपेदिक में देखा, जिसमें विशाल बहुमत एक अव्यक्त रोग विकसित, लगभग 4-14% संक्रमण के बाद पहले पांच वर्षों के भीतर प्राथमिक सक्रिय संक्रमण का उत्पादन४२, 10-20% भारी उजागर व्यक्तियों के लिए संक्रमण४३ और 5-अव्यक्त संक्रमण के 10% बंध्याकरण करने में सक्षम होने लगते है४४पुनः सक्रिय । ' मेजबान आनुवंशिकी में अंतर तपेदिक को संवेदनशीलता को प्रभावित करता है और रोग४५प्रगति । यह भी zebrafish जनसंख्या है कि कई अंय प्रयोगशाला पशुओं४६,४७के विपरीत आनुवंशिक रूप से बहुत विषम है में देखा जाता है । प्राकृतिक आनुवंशिक भिन्नता यह इस multifactorial रोग में इष्टतम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए खोज में एक उच्च लागू मॉडल बनाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन (H.L.), हेरा क्षयरोग फाउंडेशन (H.L., एल.-M.V., M.M.H., म. प्र.), फाउंडेशन ऑफ फिनिश एंटी-क्षयरोग एसोसिएशन (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen säätiö) (H.L., M.M.H., म. प्र.), Sigrid jusélius फाउंडेशन (म. प्र.), एमिल Aaltonen फाउण्डेशन (M.M.H.), जेन एण्ड Aatos Erkko फाउण्डेशन (म. प्र.) और फिनलैंड की अकादमी (म. प्र.). लीना mäkinen, हैना-लीना Piippo और Jenna ilomäki उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं. लेखक अपनी सेवा के लिए छेड़-छाड़ Zebrafish प्रयोगशाला मानते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४० Zebrafish तपेदिक माइकोबैक्टीरियम marinum माइकोबैक्टीरियम तपेदिक माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण qPCR प्रतिरक्षा प्रणाली
मॉडलिंग तपेदिक में <em>माइकोबैक्टीरियम marinum</em> संक्रमित वयस्क Zebrafish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luukinen, H., Hammarén, M. M.,… More

Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter